Preparazione e caratterizzazione di individuale e Multi-droga Loaded Fisicamente intrappolate polimerici Micelle

L'obiettivo generale del seguente esperimento è delineare un processo passo dopo passo per la preparazione e la caratterizzazione di micelle cariche con farmaco prima di valutarle in stati patologici di interesse. Questo viene ottenuto preparando le micelle mediante il metodo di evaporazione del solvente, al fine di generare micelle riproducibili per lo studio. Come secondo passaggio, vengono valutate la stabilità del caricamento e le dimensioni delle micelle, parametri che determinano la capacità delle micelle di caricare e mantenere concentrazioni clinicamente rilevanti.

Successivamente, viene determinata la velocità di rilascio del farmaco dalle cellule mi, al fine di garantire che le cellule mi presentino adeguate caratteristiche di rilascio in vitro prima della valutazione della stabilità in vivo. I risultati mostrano che cellule mi stabili generate in modo riproducibile possono fornire una piattaforma per lo sviluppo della somministrazione di farmaci in diverse condizioni patologiche, basata sulle tecniche di valutazione qui presentate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il caricamento in equilibrio o i metodi di dialisi, è che le miosine possono essere preparate molto più rapidamente con un caricamento del farmaco e una dimensione riproducibili.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di vari stati patologici poiché i farmaci su scala nanometrica offrono opportunità oltre le forme convenzionali. In generale, le persone alle prime armi potrebbero avere difficoltà con queste tecniche, anche se semplici, perché comunque è necessario eseguire gli studi di rilascio e non si riesce a valutare adeguatamente l'effetto burst. La dimostrazione di queste procedure sarà effettuata da Shaman Duke, il mio studente laureato, e da Deepa, la mia collaboratrice. Pesare innanzitutto un milligrammo di DTX, un milligrammo di EVR e 15 milligrammi di Peg 4,000 block PLA 2200 per le cellule bicomponenti o DDM. Dopo aver pesato, sciogliere i farmaci e il polimero in 0,5 millilitri di acetonitrile, quindi trasferire la soluzione in un pallone rotondo da cinque millilitri e formare un sottile film polimerico con farmaco distribuito evaporando la soluzione di farmaco-polimero in acetonitrile sotto pressione ridotta mediante un evaporatore rotante.

Dopo questa fase, idratare il film polimerico del farmaco con 0,5 millilitri di acqua deionizzata preriscaldata a 50 gradi Celsius e agitare delicatamente il flacone in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius per formare le cellule dei topi. Aggiungere la soluzione in un tubo da centrifuga e centrifugare a 7.200 ×g per tre minuti. Aspirare la soluzione con un ago e filtrare la soluzione micellare risultante in un nuovo tubo da centrifuga da 1,5 millilitri utilizzando un filtro in nylon da 0,2 micron per rimuovere qualsiasi farmaco non disciolto o contaminanti. A questo punto, eseguire un'analisi di HPLC in fase inversa con una colonna C8 equilibrata a 40 gradi Celsius in modalità isocratica con una fase mobile di acetonitrile e acqua, diluendo le micelle appena preparate in acetonitrile in un rapporto di 1 a 100 prima dell'analisi mediante HPLC in fase inversa per determinare il carico iniziale di farmaco.

Dopo aver conservato le mie cellule non diluite a temperatura ambiente per 48 ore, preparare campioni freschi diluiti da rivalutare mediante HPLC in fase inversa per determinare la stabilità del farmaco nelle mie cellule nel periodo di 48 ore. Monitorare i picchi di DTX e DVR a 227 e 279 nanometri con tempi di ritenzione di 1,7 e 5,7 minuti rispettivamente. Presentare i dati come media ± deviazione standard del carico di farmaco.

Successivamente, diluire le cellule appena preparate e l'acqua deionizzata in un rapporto di uno a 20 per ottenere una concentrazione finale di polimero di 1,5 milligrammi per millilitro. Trasferire la soluzione in un vetrino per la misurazione della diffusione dinamica della luce. Misurare l'intensità del laser a elio-neon a 173 gradi per determinare la diffusione.

Presentare i dati come dimensione media Z plus o minus deviazione standard, insieme all'indice di polidispersità o PDI della distribuzione. Dopo aver preparato il DDM come descritto in precedenza, caricare 2,5 millilitri delle mie cellule in una cassetta per dialisi da 3 millilitri con cutoff di peso molecolare di 7.000 grammi per mole. Posizionare la cassetta in 2,5 litri di tampone fosfato 10 millimolare a pH 7,4 durante gli intervalli seguenti.

Prelevare 150 microlitri della soluzione e sostituirli con 150 microlitri di tampone fresco. Cambiare il tampone ogni tre ore per garantire condizioni di sincronizzazione. Analizzare i campioni mediante HPLC in fase inversa per determinare la curva di concentrazione del farmaco.

Adattare i dati di rilascio del farmaco a un modello di diffusione semplice con un'associazione esponenziale monofasica utilizzando il software statistico D-T-X-E-V-R e il DDM ha mostrato una stabilità simile in PEG 2000 blocco PLA 1800 o PEG 2000 blocco PLA 2200 nel corso di 48 ore. Tutte le mie cellule hanno mantenuto il 97% o più del carico iniziale dopo 48 ore a temperatura ambiente. Sulla base dei risultati della diffusione dinamica della luce, tutte le mie cellule hanno mostrato una distribuzione unimodale con valori di PDI inferiori a 0,2.

In base ai dati, il rilascio di DTX da singole cellule mi e da DDM è stato di circa il 60% nell'arco di 48 ore. Il rilascio di EVR da singole cellule mi e da DDM è stato rispettivamente del 60% e del 50%. Il tempo necessario per il rilascio del 50% del farmaco da singole cellule mi e da DDM e i dati relativi all'adattamento del modello sono presentati qui.

La bontà dell'adattamento della curva per tutte le mie cellule, eccetto le singole EVR, è superiore a 0,950, il che significa che l'ipotesi di un rilascio di primo ordine rappresenta una buona approssimazione per spiegare il rilascio del farmaco dalle singole mie cellule e dal DDM. Una volta acquisite, queste tecniche possono essere eseguite regolarmente su una libreria di farmaci e polimeri come le mie cellule, in poche ore fino a una settimana. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di caratterizzare completamente le mie cellule prima di accedere alle colture cellulari o ai modelli animali successivi a tali procedure. Altri sistemi di somministrazione, come il sistema di somministrazione liposomiale, possono essere anch'essi valutati o caratterizzati al fine di rispondere alla domanda sul ruolo del sistema di somministrazione del farmaco nell'efficacia del trattamento.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e caratterizzare le cellule caricate con farmaci prima di valutarle in una malattia di interesse.