Name: Preparazione e caratterizzazione di individuale e Multi-droga Loaded Fisicamente intrappolate polimerici Micelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Impara a preparare micelle polimeriche caricate con farmaci mediante il metodo di solvent casting. Questo protocollo garantisce riproducibilità e stabilità per applicazioni di drug delivery in diverse patologie.

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Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione del programma AACP New Pharmacy Faculty Research Award, dal Medical Research Foundation of Oregon New Investigator Grant, dal fondo Oregon State University-Startup e dal fondo Pacific University, School of Pharmacy Start-up.

1. Preparazione di singoli e multi-droga Micelle caricate da solvente Metodo Casting <ol><li> Pesare DTX 1 mg o EVR 1 mg o di entrambi i farmaci a 1 mg ciascuna per le micelle doppio farmaco (DDM). </li><li> Pesare 15 mg di PEG 2000 - b -PLA 1800 e PEG 4000 - b -PLA 2200 sia per individuali o DDM. </li><li> Sciogliere le droghe / farmaci e il polimero in 0,5 ml di acetonitrile e posto in un pallone a fondo tondo da 5 ml. </li><li> Forma un film polimerico farmaco distribuito sottile facendo evaporare il farmaco (s) soluzione acetonitrile -polymer sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Impostare l&#39;evaporatore rotante a 100 rpm, la temperatura dell&#39;acqua di 40 vasca o C e una pressione di 260 mbar di vuoto per 5 minuti, seguito da una riduzione a 100 mbar per ulteriori 3 min. </li><li> Reidratare il film di droga-polimero con 0,5 ml di acqua deionizzata a 50 ° C e scuotere delicatamente il pallone per formare le micelle. </li><li> Filtrare il risultatoing soluzione micellare attraverso un filtro di nylon 0,2 micron per rimuovere qualsiasi farmaco o contaminanti un-dissolto in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. </li></ol> 2. Valutazione di droga Caricamento e alla stabilità nel Micelle Utilizzando Reverse-fase ad alte prestazioni cromatografia liquida (RP-HPLC) <ol><li> Effettuare analisi RP-HPLC con una colonna C8 equilibriated a 40 ° C in una modalità isocratica con una fase mobile di acetonitrile / acqua (62/38) contenente 0,1% di acido fosforico e 1% di metanolo ad una portata di 1 ml / min e un volume di iniezione di 10 ml. </li><li> Diluire micelle preparati al momento (sezione 1) 1: 100 in fase mobile prima di analizzare da RP-HPLC per determinare caricamento iniziale della droga. Conservare diluiti individuali micelle e DDM a temperatura ambiente (25 ° C) per 48 ore e si preparano freschi 1: 100 campioni diluiti in fase mobile di rivalutare da RP-HPLC e determinare droga (s) stabilità in micelle oltre 24 ore. </li><li> Monitorare DTX e EVR picchi a 227 e 279 nm, rispettivamentecon tempi di ritenzione di 1,7 e 5,7 minuti rispettivamente. Eseguire tutte le misurazioni in triplice copia. Presentare i dati come media ± SD droga carico. </li></ol> 3. valutazione delle dimensioni delle particelle micelle da Dynamic Light Scattering (DLS) <ol><li> Diluire micelle preparate (come descritto nella sezione 1) in acqua deionizzata a rapporto 1:20 per ottenere una concentrazione finale di 1,5 mg di polimero / ml. </li><li> Misurare l&#39;intensità del laser He-Ne (633 nm) a 173 ° per determinare dispersione. Eseguire tutte le misurazioni a 25 ° C dopo un pre-equilibrazione per 2 minuti. </li><li> Eseguire tutte le misurazioni in triplice copia. Dati presente come dimensione media Z-media ± SD insieme con l&#39;indice di polidispersità (PDI) della distribuzione. </li></ol> 4. Valutazione in vitro Drug uscita da Micelle individuali e DDM <ol><li> Preparare i singoli micelle e DDM come descritto nella sezione 1. Caricare 2,5 ml di micelle in una cassetta da 3 ml con dialisiun peso molecolare di cut-off (MWCO) di 7000 g / mol. NOTA: Questo MWCO stato scelto per consentire al farmaco libero (s) insieme con le molecole di polimero non associate a diffondere liberamente dalla cassetta e quindi garantire condizioni sink. </li><li> Posizionare le cassette in 2,5 L di 10 mM pH 7,4 tampone fosfato (diluire soluzione madre 200 mm) e modificare il buffer ogni 3 ore per garantire condizioni di sink. Mantenere la temperatura del tampone a 37 ° C per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> A 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, e 48 ore, prelevare 150 microlitri della soluzione in cassette e sostituire con 150 ml di tampone fresco. </li><li> Analizzare i campioni utilizzando RP-HPLC previste nella sezione 2 per determinare la concentrazione del farmaco. Curve-fit dei dati di rilascio del farmaco (s) sulla base di un modello di diffusione semplice con un&#39;associazione esponenziale una fase utilizzando il software stastitical. </li><li> Calcolare il tempo necessario per raggiungere il 50% di rilascio di farmaci (t 1/2) edroga ach in singoli micelle o DDM in base alla curva raccordo. Eseguire tutte le misure in quaterna. </li></ol>

<ol><li>Yokoyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+as+a+new+drug+carrier+system+and+their+required+considerations+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).</li>
<li>Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-drug+loaded+polymeric+micelles+for+simultaneous+delivery+of+poorly+soluble+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs.</a> J Control Release. 140, 294-300 (2009).</li>
<li>Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+block+copolymers+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic block copolymers for drug delivery.</a> J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).</li>
<li>Oerlemans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+in+anticancer+therapy%3A+targeting%2C+imaging+and+triggered+release%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release.</a> Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).</li>
<li>Shin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3-in-1+polymeric+micelle+nanocontainer+for+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs.</a> Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).</li>
<li>Hasenstein, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+Triolimus%3A+a+novel+multidrug-loaded+micelle+containing+Paclitaxel+Rapamycin%2C+and+17-AAG%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG.</a> Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).</li>
<li>Mazzaferro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bivalent+sequential+binding+of+docetaxel+to+methyl-beta-cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin.</a> Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).</li>
<li>Iwase, Y., Maitani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+in+vivo+evaluation+of+liposomal+everolimus+for+lung+carcinoma+and+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma.</a> Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).</li>
<li>Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+effect+of+docetaxel+and+everolimus+as+individual+and+dual-drug-loaded+micellar+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers.</a> Pharm Res. 31, 660-669 (2014).</li>
<li>Xu, W., Ling, P., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles%2C+a+promising+drug+delivery+system+to+enhance+bioavailability+of+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs.</a> J Drug Deliv. 2013, 340315(2013).</li>
<li>Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29-block-poly%28L-amino+acid%29+micelles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'uso di micelle polimeriche per la somministrazione di farmaci continua ad espandersi grazie alla loro versatilità e capacità di fornire farmaci idrofobici per vari stati patologici. Pertanto, le tecniche necessarie per preparare e caratterizzare queste formulazioni prima dell'uso in colture cellulari o animali sono un primo passo fondamentale per determinare il miglior abbinamento tra il farmaco e il polimero. PEG-b-PLA sono eccellenti copolimeri a blocchi anfifilici per la somministrazione di farmaci. Tutt...

Copolimeri a blocchi anfifilici con struttura ripetendo composta da domini idrofili e idrofobi possono spontaneamente auto-assemblano a formare tre assemblee macromolecolari tridimensionali conosciuti come micelle polimeriche. Queste strutture hanno un core idrofobico interno circondato da un guscio idrofilo. Il core idrofobico ha la capacità di incorporare farmaci idrofobici mediante intrappolamento fisico attraverso interazioni idrofobiche o mediante coniugazione chimica a catena polimerica. 1 Molti vantaggi esistono per utilizzare questi copolimeri a blocchi per formare micelle per il drug delivery. Questi includono l&#39;incorporazione di farmaci scarsamente solubili, migliorando farmacocinetica dei farmaci incorporati, e la biocompatibilità e / o biodegradabilità dei polimeri li rende un sostituto sicuro per solubilizzanti convenzionali. 2 Un altro vantaggio dell&#39;utilizzo di micelle polimeriche è la loro granulometria colloidale, tra 15- 150 nm 3, che li rende attraenti per paconsegna renteral. Pertanto, nel corso degli ultimi 20 anni micelle polimeriche sono emersi come sistemi di drug delivery vitali per farmaci scarsamente solubili in acqua soprattutto per la terapia del cancro. 3,4 Attualmente ci sono cinque formulazioni micellari polimerici per la terapia del cancro in fase di sperimentazione clinica. 4 Quattro delle micelle negli studi clinici sono copolimeri a base di PEG diblock mentre l&#39;ultimo è un copolimero a tre blocchi contenente polietilenossido. La dimensione di queste micelle variava da 20 nm a 85 nm. Il vantaggio di usare polimeri a base di PEG è la loro biocompatibilità e in funzione del secondo blocco può anche essere biodegradabili. Recentemente nuovi sistemi di somministrazione dei farmaci a base di acido -polylactic blocco polyethyleneglycol- (PEG-b -PLA) micelle polimeriche sono stati sviluppati per la consegna contemporanea di più farmaci antitumorali. Le micelle PEG-b- PLA sono sia biocompatibile e biodegradabile. Questi multi-farmaco micelle caricati hanno dimostrato comeinibizione ynergistic di diversi modelli di tumori in vitro e in vivo e in forma 2,5,6 nella corrente paradigma di utilizzare più farmaci in chemioterapia per prevenire la resistenza e ridurre la tossicità. Pertanto, non vi è un grande interesse per la preparazione e la caratterizzazione di questi sistemi di drug delivery micellari per l&#39;uso nel cancro e altre malattie. Nel lavoro di seguito abbiamo delineato un processo step-by-step per cui tali micelle possono essere preparati e caratterizzati prima di valutare negli stati di malattia d&#39;interesse. Ai fini di questo lavoro, docetaxel (DTX) e everolimus (EVR) sono stati scelti due agenti anti-tumorali scarsamente solubili. Sia DTX e EVR sono composti scarsamente solubili in acqua con solubilità in acqua intrinseche a 1,9 e 9,6 mg / ml. 7,8 Due PEG-polimeri b -PLA con diversi pesi molecolari sono stati utilizzati in questo protocollo, come i mattoni per la polimerico formulato micelle,questi polimeri sono PEG 2000 - b -PLA 1800 (3.800 Da) e PEG 4000 - b -PLA 2200 (6.200 Da). PEG micelle b -PLA possono quindi fornire una piattaforma unica come nanocarrier per DTX e EVR individualmente e in combinazione. Le richieste Reagenti / Materiali e attrezzature necessarie per preparare e caratterizzare queste micelle sono elencati nella tabella 1.

<table><tbody><tr><td>PEG2000-b-PLA1800</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/2000</td><td>PLA MW può essere specificato al momento dell'ordine</td></tr><tr><td>PEG4000-b-PLA2200</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/4000</td><td>PLA MW può essere specificato al momento dell'ordine</td></tr><tr><td>Docetaxel</td><td>LC Laboratories</td><td>D-1000</td><td>mg</td></tr><tr><td>Everolimus</td><td>LC Laboratories</td><td>E-4040</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-AX0145-1</td><td>grado HPLC; 4 L</td></tr><tr><td>Pallone a fondo tondo&nbsp;</td><td>Glassco/VWR</td><td>89426-496</td> 5 <td>ml</td></tr><tr><td>RV 10 Evaporatori rotanti di controllo</td><td>IKA Works</td><td>8025001</td><td>Rotoevaporatore</td></tr><tr><td>Shimadzhu HPLC con rivelatore DAD</td><td>Shimadzhu</td><td></td><td>RP-HPLC</td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer cassetta per dialisi MWCO 7000</td><td>Thermo Scientific, Inc</td><td>66370</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>Tampone fosfato pH 7,4, 200 mM</td><td>VWR</td><td>100190-870</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Malvern NanoZS</td><td>Malvern Instruments, UK</td><td></td><td>DLS</td></tr><tr><td>Filtro in nylon</td><td>Acrodisc/VWR</td><td>28143-242</td><td>13 mm; 0.2&micro; M</td></tr><tr><td>Acido fosforico, NF</td><td>Spectrum Chemical/VWR</td><td>700000-626</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td><td>Software di</td><td></td> analisi</tr><tr><td>Zorbax SB-C8 Cartuccia a risoluzione rapida&nbsp;</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>866953-906</td><td>4.6 &volte; 75 mm, 3,5 &#956; m</td></tr></tbody></table>

preparazione e caratterizzazione di individuale e multi-droga loaded fisicamente intrappolate polimerici micelle

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Copolimeri a blocchi anfifilici come blocco polyethyleneglycol- acido -polylactic (PEG-b- PLA) possono auto-assemblarsi in micelle di sopra del loro concentrazione micellare critica che formano nuclei idrofobici circondati da gusci idrofili in ambienti acquosi. Il nucleo di queste micelle può essere utilizzato per caricare farmaci idrofobici, scarsamente idrosolubili come docetaxel (DTX) e everolimus (EVR). Caratterizzazione sistematica delle capacità della struttura micelle e droga di carico sono importanti prima in vitro e in vivo può essere effettuata. L&#39;obiettivo del protocollo qui descritto è quello di fornire le misure di caratterizzazione necessari per realizzare prodotti micellari standardizzati. DTX e EVR hanno solubilità intrinseca di 1,9 e 9,6 mg / ml Preparazione di queste micelle può essere realizzato per fusione solvente che aumenta la solubilità in acqua di DTX e EVR a 1,86 e 1,85 mg / ml, rispettivamente. Stabilità droga in micelle evalranea a temperatura ambiente per 48 ore indica che il 97% o più dei farmaci sono mantenuti in soluzione. Dimensioni micella è stata valutata utilizzando light scattering dinamico e indicato che la dimensione di queste micelle era inferiore a 50 nm e dipendeva dal peso molecolare del polimero. Rilascio del farmaco da parte delle micelle è stata valutata utilizzando la dialisi, in condizioni sink a pH 7,4 a 37 ° C oltre 48 ore. Curve risultati adatti indicano che il rilascio del farmaco è guidato da un processo di primo ordine che indica che è guidato diffusione.

DTX individuali o micelle EVR e DTX e EVR DDM in PEG b -PLA micelle sono formulati con successo in entrambi i PEG 4000 - b -PLA 2200 o PEG 2000 - b -PLA 1800 (Figura 1). DTX, EVR, e il DDM ha mostrato stabilità simile a PEG 4000 - b -PLA 2200 o PEG 2000 - b -PLA 1800 più di 48 ore (Figura 2). Caricamento farmacologic...

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere la preparazione e la caratterizzazione di farmaci fisicamente intrappolati e scarsamente solubili in acqua in sistemi di somministrazione di farmaci micellari composti da copolimeri a blocchi anfifilici.

Preparazione e caratterizzazione di individuale e Multi-droga Loaded Fisicamente intrappolate polimerici Micelle

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è delineare un processo passo dopo passo per la preparazione e la caratterizzazione di micelle cariche con farmaco prima di valutarle in stati patologici di interesse. Questo viene ottenuto preparando le micelle mediante il metodo di evaporazione del solvente, al fine di generare micelle riproducibili per lo studio. Come secondo passaggio, vengono valutate la stabilità del caricamento e le dimensioni delle micelle, parametri che determinano la capacità delle micelle di caricare e mantenere concentrazioni clinicamente rilevanti.Successivamente, viene determinata la velocità di rilascio del farmaco dalle cellule mi, al fine di garantire che le cellule mi presentino adeguate caratteristiche di rilascio in vitro prima della valutazione della stabilità in vivo. I risultati mostrano che cellule mi stabili generate in modo riproducibile possono fornire una piattaforma per lo sviluppo della somministrazione di farmaci in diverse condizioni patologiche, basata sulle tecniche di valutazione qui presentate. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il caricamento in equilibrio o i metodi di dialisi, è che le mios

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