Name: Studiando la funzione delle proteine e il ruolo di Altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Scopri come studiare la funzione delle proteine nei neuroni ippocampali primari utilizzando l'interferenza anticorpale con peptidi Chariot e ricostruzioni tridimensionali. Questo metodo offre controllo immediato e dosabile dell'espressione proteica.

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Il lavoro presentato è stato sostenuto in parte da un finanziamento dal Canadian Institutes of Health Research / Fragile X Research Foundation del programma di partnership Canada a RD, Jerome Lejeune Fondazione di RD, il Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung dell&#39;Università di Erlangen-Norimberga di Rd e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft di RD e RE. Gli autori desiderano ringraziare Ingrid Zenger di assistenza tecnica con la manutenzione coltura delle cellule così come il Prof. M. Wegner per fare un vettore pCMV5-FLAG disponibili. Gli autori inoltre desiderano ringraziare particolarmente Nadja Schroeder per il supporto utile alla ripresa video.

1. Le soluzioni madre <ol><li> Risospendere la polvere motivo attiva liofilizzata in H 2 O sterile ad una concentrazione finale di 2 mg / mL. Toccare con attenzione per la miscelazione. </li><li> Preparare piccole aliquote (ad esempio, 12 ml ciascuno, 2 ml sono necessari per reazione) e conservarli a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparazione di cellule <ol><li> Seed cellule di mammiferi come le cellule HEK293 o neuroni primari su un terreno di coltura 24 pozzetti in 500 microlitri tra cui antibiotici. NOTA: quando si utilizza i neuroni, seminare le cellule a bassa densità e utilizzare solo le due file centro del piatto ben 24. Ogni pozzetto avrà quindi una controparte vuoto al porto del mezzo durante l&#39;incubazione (passo 4.2). Quando si maneggiano i neuroni, assicurarsi sempre che le cellule non sono tenuti al di fuori dell&#39;incubatore per più di qualche minuto. </li><li> Coltivare le cellule in condizioni adeguate (umidificati, 5% di CO 2 e 37 ° C) fino a quando le cellule sono app. 50%confluente. NOTA: quando si utilizza i neuroni, la cultura delle cellule fino alla fase di sviluppo desiderata viene raggiunta e cambiare app. 25-50% del mezzo due volte a settimana. Media: media Neurobasal (contenente 1x B27, 5 mM L-glutammina e 1x penicillina e la streptomicina, confrontare con rif 16). </li></ol> 3. Carro formazione del complesso <ol><li> Per reazione, diluire 0,1-2 ug del POI o il corrispondente anticorpo, nonche la proteina di controllo, o anticorpo di controllo, rispettivamente, in 50 ml di PBS. NOTA: La tecnica funziona anche con complessi macromolecolari costituito da anticorpi primari e secondari pre-bound (cp &#39;Rappresentante Risultati&#39;, figura 1.). Mescolare ed effetti. </li><li> Per ogni campione, diluire 2 ml soluzione madre Carro in 50 ml di PBS utilizzando tubi separati al fine di evitare l&#39;auto-associazione di Carro. Mescolare ed effetti. </li><li> Trasferire il POI o anticorpi (passo 3.1) diluito per la diluizione Chariot per pipettaTing. Mescolare ed effetti. </li><li> Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente (complessi Chariot-POI formeranno). </li></ol> 4. Trasfezione delle cellule <ol><li> Diluire i complessi Chariot (punto 3.4) in 100 ml terreno di crescita pre-riscaldato (37 ° C, senza additivi). Rimuovere il supporto e lavare le cellule una volta con pre-riscaldato 1x PBS. NOTA: quando si utilizza neuroni, non gettare il medium, che sarà riutilizzato. Tenerlo a 37 ° C. Per il lavaggio, utilizzare PBS contenente 0,5 mM MgCl 2 e CaCl 2. Suggerimento: tenere il mezzo in pozzi vuoti, mentre incubando la piastra (passo 4.5). </li><li> Applicare la soluzione complessa carro (passo 4.1) alle cellule e oscillare delicatamente le cellule per assicurare una distribuzione uniforme della soluzione. Far crescere le cellule in condizioni standard (passo 2,2) per 1 ora. Aggiungere siero a una concentrazione finale del 10%. Quando si utilizzano i neuroni, aggiungere il supporto dal punto 4.1. Crescere le cellule per 1 o 2 ore in più. NOTA: Iltempo di incubazione ottimale dipende dalle dimensioni e le proprietà del carico e può essere necessario regolare empiricamente. I seguenti suggerimenti possono servire come linea guida: Per peptidi, 1 ora di solito è sufficiente, per le proteine ​​sono raccomandati 1-2 ore, per gli anticorpi 2 ore, e per la trasfezione di neuroni con anticorpi 4 ore. </li><li> celle di processo per l&#39;analisi, come al solito. Si prega di notare: la tecnica è compatibile con gli esperimenti che utilizzano i protocolli di fissaggio così come l&#39;imaging dal vivo. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Utilizzando un microscopio a scansione laser, prendere z-pile di cellule e / o compartimenti cellulari di interesse utilizzando circa 0,25-0,5 micron distanza. La distanza strato precisa dipende dalle dimensioni della struttura da ricostruire e deve essere determinato singolarmente. </li></ol> 6. ricostruzione <ol><li> Nei passaggi seguenti, utilizzare il fondo Esc per passare da selezionare e spostarsi, Cntr per selezionare più oggetti facendo clic su on loro e tasto shift per tagliare gli oggetti (cfr. punto 6.10). </li><li> Aprire il LSM-file in Imaris. </li><li> Utilizzando la regolazione di visualizzazione per ogni canale, contrastare l&#39;immagine fino a quando le strutture più brillanti raggiungono la saturazione. Si prega di notare che questa regolazione non influenzerà la costruzione superficie, serve solo ad aiutare lo sperimentatore in thresholding l&#39;immagine. </li><li> Fare clic sull&#39;icona Aggiungi nuove superfici. Si aprirà una procedura guidata. </li><li> Selezionare: Segmento solo una regione di interesse. Procedere alla fase successiva. </li><li> Regolare i margini della casella di selezione per misura il vostro oggetto di interesse. Si prega di tenere presente che l&#39;immagine ha 3 dimensioni e che la selezione deve essere adeguato al piano z pure. Se la forma rettangolare della casella di selezione non deve corrispondere l&#39;oggetto di interesse correttamente, girare l&#39;oggetto e / o ingrandire la casella fino a quando tutte le strutture necessarie sono incorporati. oggetti indesiderati possono essere rimossi in seguito (cfr. punto 6.10). Procedere. </li><li> Selezionare il ch appropriataAnnel. La superficie livello di dettaglio o diametro della sfera devono essere impostati in abbinamento alle strutture di essere ricostruito. A seconda delle caratteristiche del segnale, sia assoluta intensità o Contrasto locale possono essere utilizzati. In generale, il contrasto locale funziona meglio per i segnali diffusi. In ogni caso, le impostazioni devono essere regolate separatamente per ciascun segnale o struttura di interesse, rispettivamente. </li><li> Utilizzando lo strumento Soglia, ricostruire la struttura di interesse. </li><li> Completa la ricostruzione facendo clic sulla freccia verde in basso. </li><li> Regolare l&#39;oggetto ulteriormente utilizzando lo strumento matita per tagliare e rimuovere le superfici, come richiesto. È possibile solo tagliare in direzione nord-sud, quindi inclinare l&#39;immagine per tagliare l&#39;oggetto desiderato. </li><li> Ottenere misurazioni di volume, area e intensità per ogni superficie da Statistics selezione, statistiche dettagliate, e valori medi. </li><li> (Passo opzionale) Per osservare le statistiche color-coded (cfr. Figura 2E </sTrong&gt; e F), selezionare la scheda colore della superficie corrispondente e Mark &#39;Statistica Coded&#39; invece di &#39;base&#39;. verranno visualizzate diverse opzioni. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, presentiamo un protocollo per studiare il significato dei livelli di espressione della proteina nel controllo funzioni cellulari in modo dose guidato. Il protocollo descritto consente una manipolazione perfezionato dell&#39;espressione proteica in vari tipi di cellule di mammifero, inclusi neuroni dell&#39;ippocampo, facilitando così studi dettagliati di funzione proteica a livello cellulare. Anche se l&#39;interferenza dell&#39;RNA rappresenta una strategia ben noto a down-regolare POI...

Una stretto controllo dell&#39;espressione della proteina è essenziale per ogni organismo vivente per comandare il proprio sviluppo e di reagire a segnali ambientali. Pertanto, un gran numero di meccanismi è stato inventato durante l&#39;evoluzione di regolare con precisione il livello di espressione di ogni proteina codificata dal app. 20.000 geni esistenti in qualsiasi cellula eucariotica in un dato momento della sua vita. Che si svolgono in diverse fasi della produzione di proteine, meccanismi regolatori spaziano dalla gestione della struttura della cromatina, trascrizione e RNA movimentazione alla direzione di modificazioni post-traduzionali di proteine, trasporto e degradazione. Non è quindi sorprendente che i disturbi del macchinari molecolari e livelli di espressione della proteina alterata sottostante sono stati associati con malattie diverse come il cancro o disabilità intellettiva. In effetti, guardando l&#39;eccezionale complessità dello sviluppo neuronale e la funzione del cervello dei mammiferi, la Sensitività di questi sistemi sofisticati ad alterazioni nel espressione della proteina si manifesta in diversi deficit intellettuali ben noti, tra cui Alzheimer e morbo di Parkinson (AD e PD), così come disturbi dello spettro autistico (ASD) come la sindrome dell&#39;X fragile (FXS). Quest&#39;ultima malattia è caratterizzata da una vasta misexpression di una varietà di proteine, che è dovuto alla perdita di una singola definizione regolazione proteine, FMRP (fragile X ritardo mentale Protein) 1-4. Inoltre, riarrangiamenti cromosomici che interessano la carica variabile legata all&#39;X proteina A (VCXA), una proteina, che gestisce la stabilità mRNA e la traduzione modificando mRNA tappatura 5, sono state recentemente associate a deficit intellettivi, mentre mutazioni puntiformi non sono state identificate nei pazienti con disabilità cognitive fin d&#39;ora 6, 7, il che suggerisce che i disturbi mentali osservati provengono da espressione VCXA alterata e l&#39;espressione disregolazione della sua prote bersaglioins. In linea con questi risultati, uno studio che ha valutato se de novo copia variazioni del numero di geni sono associati con ASD stabilito che duplicazioni di geni nuovi e delezioni sono un fattore di rischio significativo per ASD 8, sostenendo in tal modo l&#39;idea che i livelli di espressione della proteina elevati o diminuiti possono causare deficit intellettuali. Sorprendentemente, recenti ricerche hanno fornito ulteriore prova che il livello di espressione di una data proteina è regolata con precisione per prevenire l&#39;aggregazione in conseguenza di elevate quantità della proteina con quasi senza margini di sicurezza 9. È stato quindi proposto che anche piccoli incrementi sono sufficienti ad indurre malattie come AD e PD 9. Sebbene la varietà di macchinari molecolari che contribuiscono al controllo espressione della proteina suggerisce uno schema regolazione complessa alla luce di questi risultati, uno studio che ha il livello di espressione di oltre 5.000 geni di mammifero 10 dimostrato chela natura ha preferito uno schema più parsimoniosa: L&#39;abbondanza cellulare di proteine ​​ha dimostrato di essere in prevalenza regolato a livello della traduzione 10, illustrando in tal modo che la gestione della disponibilità di RNA serve soprattutto per mettere a punto l&#39;espressione della proteina. Studiando la dose di proteine ​​di interesse (POI) è quindi importante non solo per la comprensione delle funzioni endogene di una proteina, ma anche alla ricerca di molte malattie e lo sviluppo di terapie. Così, negli ultimi decenni hanno visto l&#39;avanzata delle diverse strategie utilizzando RNA interferenza di manipolare dosaggio POI. Anche se l&#39;interferenza dell&#39;RNA è ampiamente usato per studiare la funzione delle proteine ​​e viene anche applicata in studi clinici per il trattamento di cancro o di malattie oculari, nonché a perseguire terapie antivirali nei pazienti 11-13, alcune difficoltà possono sorgere che potrebbero rendere la strategia di impossibile. Ad esempio, la sequenza seme, che spinge il colpo per omologia è comparabilitàeffetti a breve, quindi la promozione fuori bersaglio bile. Dal momento che le sequenze altamente efficienti sono rari e hanno bisogno di essere trovato tra migliaia di opzioni (rivisto nel 14), identificando la sequenza giusta può richiedere molto tempo e costoso, ma i risultati possono ancora essere deludente. Una strategia alternativa è quello di colpire direttamente il POI da anticorpi. Qui, illustriamo l&#39;uso del Carro proteina carrier (prodotto da Active Motif) per ridurre la disponibilità proteina cellulare, e l&#39;impiego di ricostruzioni tridimensionali per studiare la funzione della proteina seguente knock-down. Il motivo attivo di carro, per sé un 2,8 kDa peptide, viene utilizzato per peptidi navetta, proteine ​​e anticorpi attraverso le membrane delle cellule di mammifero 15. I soci peptide con POI formando non covalente accoppiato complessi macromolecolari che utilizzano interazioni idrofobiche, dopo complessi Chariot-POI vengono internalizzati nelle cellule in un endosome-indmaniera ependent. Importante, Chariot stato indicato per non pregiudicare la localizzazione intracellulare delle proteine ​​spola, né di esercitare effetti citotossici o di influenzare l&#39;attività biologica del suo carico 15.

<table><tbody><tr><td>Chariot</td><td>Active Motif</td><td>30025</td><td>negozio a -20 C</td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Life technologies</td><td>21103-049</td><td>riscalda fino a 37 gradi C prima di utilizzare</td></tr><tr><td>1x B27</td><td>Life technologies</td><td>17504044</td><td>conservare a -20 gradi C</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Life technologies</td><td>25030-149</td><td>conservare a -20 &deg; </td></tr><tr><td>C Penicillina e Streptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>negozio a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>Bitplane</td><td>n.a.costoso</td><td>, ma ineguagliabile</td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser</td><td>Zeiss</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

studiando la funzione delle proteine ​​e il ruolo di altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Una gestione rigorosa di espressione della proteina è essenziale non solo per ogni organismo vivo, ma anche una strategia importante per indagare le funzioni delle proteine ​​in modelli cellulari. Pertanto, una recente ricerca ha inventato diversi strumenti per indirizzare l&#39;espressione della proteina in linee cellulari di mammifero o anche modelli animali, tra cui l&#39;RNA e l&#39;interferenza degli anticorpi. Mentre la prima strategia ha raccolto molta attenzione nel corso degli ultimi due decenni, i peptidi che mediano una traslocazione dei carichi di anticorpi attraverso le membrane cellulari e nelle cellule, ottenute molto meno interesse. In questa pubblicazione, fornendo un protocollo dettagliato come utilizzare un vettore peptide chiamato Chariot in cellule renali embrionali umane come in neuroni ippocampali primari eseguire esperimenti di interferenza anticorpale e illustrano ulteriormente l&#39;applicazione di ricostruzioni tridimensionali per analizzare la funzione delle proteine. I nostri risultati suggeriscono che Chariot è, probabilmente a causa del suo segnale di localizzazione nucleare, particularly ben adatto a bersaglio le proteine ​​che risiedono nel soma e il nucleo. Sorprendentemente, quando si applica Chariot alle culture ippocampali primarie, il reagente si rivelò essere sorprendentemente ben accettato dai neuroni dissociati.

Nei paragrafi che seguono, i risultati esemplari che illustrano un atterramento funzionale di un POI (Simiate, per ulteriori dettagli si rimanda 16, 17) utilizzando Chariot reagente e l&#39;interferenza degli anticorpi sono presentati. I risultati dimostrano che l&#39;espressione diminuita Simiate compromette l&#39;attività trascrizionale, e, in un modo dipendente dosaggio, induce apoptosi, che si conclude con i tassi di mortalità di oltre il 99% se vengono applicati quantità di anticorp...

Il controllo dell'espressione proteica non è solo essenziale per ogni organismo vivente, ma anche un'importante strategia per studiare le funzioni proteiche nei modelli cellulari. Il protocollo presentato mostra l'applicazione dell'interferenza anticorpale nelle cellule di mammifero, compresi i neuroni primari dell'ippocampo, e dimostra l'uso di ricostruzioni tridimensionali nello studio della funzione delle proteine.

Studiando la funzione delle proteine ​​e il ruolo di Altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare le funzioni delle proteine e il ruolo di un'espressione proteica alterata in modo efficiente e rigorosamente controllato. Questo risultato si ottiene applicando anticorpi per ridurre la quantità di proteina funzionale disponibile per la cellula. A tale scopo, gli anticorpi vengono accoppiati a un peptide chiamato Chariot, che media il passaggio attraverso le membrane cellulari.Successivamente, le strutture cellulari di interesse vengono immaginate e ricostruite in 3D al fine di valutare gli effetti del trattamento. I risultati mostrano che i peptidi Chariot sono particolarmente adatti per indirizzare proteine nucleari mediante interferenza anticorpale. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'interferenza dell'RNA, sono che gli anticorpi trasportati all'interno della cellula agiscono immediatamente e che il ricercatore può controllare rigorosamente il grado di interferenza regolando le dosi degli anticorpi.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle funzioni delle proteine in molti tipi cellulari, è particolarmente interessante per l'indirizzamento di proteine nelle colture prima

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Bioingegneria

Più della metà delle proteine ​​sono piccole proteine ​​(massa molecolare &lt;200 kDa) che stanno sfidando per entrambi microscopio elettronico di immagini e ricostruzioni tridimensionali. Ottimizzato colorazione negativa è un protocollo robusto e high-throughput per ottenere un elevato contrasto e immagini di piccole proteine ​​o complessi asimmetrici in diverse condizioni fisiologiche relativamente alta risoluzione (~ 1 nm).

Ottimizzato colorazione negativa: un protocollo ad alta velocità per l&#39;esame di piccole e asimmetrica Protein Structure da microscopia elettronica

Viene presentato un protocollo per l'analisi in linea delle relazioni tra proteine ​​sequenza-struttura-dinamiche utilizzando Bio3D-web.

Indagine sulla proteina Sequenza-struttura-dinamica Relazioni con Bio3D-web

Presentato qui sono due tecniche di ricerca di interazione proteina-proteina anticorpo-basato: immunofluorescenza e immunoprecipitazione. Queste tecniche sono adatte per lo studio delle interazioni fisiche tra le proteine per la scoperta di nuovi componenti delle vie di segnalazione cellulare e per la dinamica di proteina di comprensione.<br...

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Vi presentiamo gli approcci per la caratterizzazione biofisica e strutturale delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina biolayer interferometria, calorimetria isotermica di titolazione e cristallografia a raggi x.

Caratterizzazione delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina mediante cristallografia a raggi x e tecniche biofisiche

Qui presentiamo un protocollo per controllare il montaggio e lo smontaggio della tossina antrace tramite interferometria biolayer (BLI). A seguito di montaggio/smontaggio sulla superficie del biosensore, i complessi di grande proteina vengono rilasciati dalla superficie per la visualizzazione e l'identificazione dei componenti dei complessi utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa, rispettivamente.

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

Spettrometria di massa (MS) è emersa come un importante strumento per lo studio della struttura e dinamica di assembly macromolecolari. Qui, possiamo integrare approcci basati su MS per interrogare la formazione dei complessi della proteina e grippaggio del ligand.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Qui, presentiamo come Scattering di raggi x piccolo angolo (SAXS) può essere utilizzato per ottenere informazioni sulle buste a bassa risoluzione che rappresentano le strutture macromolecolari. Quando utilizzato in combinazione con tecniche ad alta risoluzione strutturale come la cristallografia a raggi x e risonanza magnetica nucleare, SAXS è in grado di fornire approfondimenti dettagliati in proteine di multidomain e complessi macromolecolari in soluzione.

Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Proteine strutturalmente correlate spesso esercitano funzioni biologiche distinte. Lo scambio di equivalenti regioni di queste proteine al fine di creare proteine chimeriche costituisce un approccio innovativo per identificare le aree critiche della proteina che sono responsabili della loro divergenza funzionale.

Identificazione delle regioni di proteina funzionale attraverso la proteina chimerica costruzione

Il presente protocollo descrive i metodi per studiare la struttura e la dinamica di due proteine modello che hanno un ruolo importante nella salute umana. La tecnica combina la caratterizzazione biofisica da banco con la spettroscopia eco-spin neutronica per accedere alla dinamica alle scale di tempo e lunghezza rilevanti per i movimenti interdominio delle proteine.

Studio della dinamica delle proteine tramite spettroscopia eco-spin neutronica

Questo protocollo descrive la marcatura e l'iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.

Visualizzazione di proteine a bassa abbondanza e modificazioni post-traduzionali in embrioni di Drosophila viventi tramite iniezione di anticorpi fluorescenti

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la cattura e l'identificazione di interazioni proteina-proteina specifiche della malattia da cellule e tessuti nativi utilizzando sonde chimiche e spettrometria di massa. I set di dati di interazione risultanti vengono analizzati attraverso una piattaforma web dedicata per rivelare disfunzioni dinamiche della rete e alterazioni del percorso legate alla malattia.

Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Scopri come studiare la funzione delle proteine nei neuroni ippocampali primari utilizzando l'interferenza anticorpale con peptidi Chariot e ricostruzioni tridimensionali. Questo metodo offre controllo immediato e dosabile dell'espressione proteica.

Studiando la funzione delle proteine ​​e il ruolo di Altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali (Video) | JoVE Journal

Studiando la funzione delle proteine ​​e il ruolo di Altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali

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