Studiando la funzione delle proteine ​​e il ruolo di Altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare le funzioni proteiche e il ruolo dell'espressione proteica alterata in modo efficiente e strettamente controllato. Ciò si ottiene applicando anticorpi per ridurre la quantità di proteina funzionale disponibile per la cellula. Per raggiungere questo obiettivo, gli anticorpi sono accoppiati a un peptide chiamato Chariot, che media un passaggio attraverso le membrane cellulari.

Successivamente, le strutture cellulari di interesse vengono visualizzate e ricostruite in 3D al fine di valutare gli effetti del trattamento. I risultati rivelano che i peptidi Chariot sono particolarmente adatti a colpire le proteine nucleari mediante interferenza anticorpale. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'interferenza dell'RNA sono che gli anticorpi trasportati nella cellula sono immediatamente efficaci e che il ricercatore può controllare rigorosamente il grado di interferenza regolando i dosaggi degli anticorpi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle funzioni delle proteine in molti tipi di cellule, è particolarmente interessante per il targeting delle proteine nelle colture neuronali primarie, che sono molto sensibili ai trattamenti ma tollerano molto bene Chariot. In preparazione, risospendere la polvere di peptide Chariot liofilizzata in acqua sterile a due microgrammi per microlitro. Picchiettare accuratamente il tubo per mescolare la polvere nella soluzione.

Quindi preparare piccole aliquote di lavoro, sono necessari solo due microlitri per ogni reazione, e conservare le aliquote a 20 gradi Celsius. Successivamente, preparare le cellule di mammifero per la trasfezione seminandole in una piastra a 24 pozzetti con mezzo millilitro di terreno contenente antibiotici. Quando si utilizzano i neuroni, seminare le cellule solo nelle due file centrali e a bassa densità.

I pozzetti vuoti sono utili in seguito. Sii veloce. I neuroni in coltura non dovrebbero essere fuori dall'incubatrice per più di pochi minuti.

Fino a quando i neuroni non raggiungono lo stadio di sviluppo desiderato, scambiare circa un quarto o la metà del loro terreno due volte a settimana. Le colture non neuronali dovrebbero essere utilizzate quando le cellule sono al 50% di confluenza. La seguente procedura è illustrata per sei test e sei campioni di controllo.

Per ogni carico, preparare una diluizione da 0,1 a 2 microgrammi in 50 microlitri di 1X PBS per campione. Anche i complessi macromolecolari degli anticorpi primari e secondari pre-legati possono essere utilizzati come carico. Mescolare la soluzione con un vortice delicato, seguito da una breve centrifugazione.

Quindi diluire due microlitri di soluzione madre Chariot in 50 microlitri di PBS per ogni reazione. Utilizzare provette separate per ogni campione al fine di evitare l'autoassociazione di Chariot. Ora, combina le proteine preparate nelle diluizioni Chariot.

Mescola e centrifuga le proteine combinate. Incubare il campione per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione di complessi di carico Chariot. La quantità ottimale di peptidi proteici dipende dal carico e dal tipo di cellula utilizzata.

Pertanto, questo importo dovrebbe essere determinato empiricamente. In anticipo, preriscaldare un terreno di coltura senza additivi e 1X PBS contenente 0,5 millimolari di cloruro di magnesio e cloruro di calcio a 37 gradi Celsius. Ora, per iniziare, diluire i complessi Chariot preparati con 100 microlitri di terreno.

Rimuovere il terreno dalle celle piastrate e trasferirlo nei pozzetti vuoti per il riutilizzo. Quindi lavare delicatamente le cellule con 500 microlitri di soluzione preriscaldata di 1X PBS, calcio, cloruro di magnesio. Applicare il terreno che trasporta i complessi Chariot alle cellule e far oscillare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme della soluzione.

Rimettere rapidamente le cellule nell'incubatrice e attendere un'ora prima di procedere. Per i neuroni, dopo un'ora di incubazione, trasferire il terreno salvato nei pozzetti. Per tutte le altre cellule, aggiungere siero a una concentrazione finale del 10%I neuroni in coltura sono molto sensibili, ad esempio alle variazioni della temperatura e del pH del terreno.

Pertanto, queste cellule devono essere lavate e trasfettate delicatamente con soluzioni preriscaldate e rimesse nell'incubatore il prima possibile. Continuare l'incubazione per tutto il tempo necessario, a seconda del carico trasfettato e del tipo di cella. Dopo l'incubazione, processare le cellule per le analisi successive come di consueto.

I protocolli di fissazione, così come l'imaging dal vivo, sono entrambi compatibili con questa tecnica. Utilizzando un microscopio a scansione laser con una lente 63X, scattare immagini a una distanza compresa tra 0,25 e 0,5 micron circa per ottenere pile Z di dettagli sufficienti evitando lo sbiancamento. La distanza precisa dello strato dipende dalle dimensioni della struttura da ricostruire e deve essere determinata individualmente.

Per la ricostruzione dell'immagine, aprire i file LSM in Imaris. Con questo software, il pulsante Esc viene utilizzato per passare da Seleziona a Naviga. Inoltre, è possibile selezionare più oggetti tenendo premuto il tasto Ctrl.

Utilizzando la regolazione del display, entrare in ciascun canale e regolare il contrasto fino a quando le strutture più luminose raggiungono la saturazione. Questa regolazione non influenza la costruzione della superficie, ma aiuta a definire la soglia dell'immagine. Se l'oggetto da ricostruire è contenuto in file diversi, utilizzare la funzione Modifica e Aggiungi Sezioni per combinare i file corrispondenti.

Quindi, fai clic sull'icona Aggiungi nuove superfici e seleziona Segmenta solo una regione di interesse. A questo punto, regolare i margini della casella di selezione per adattarli all'oggetto di interesse. Regola la forma e l'inclinazione della forma rettangolare fino a quando tutte le strutture richieste non sono all'interno della scatola.

La selezione deve essere regolata in ogni immagine attraverso il piano Z. Gli oggetti indesiderati possono essere rimossi in seguito. Quindi, seleziona un canale appropriato.

Per procedere, utilizzare lo strumento di soglia per ricostruire la struttura di interesse. Il livello di dettaglio dell'area della superficie, o diametro della sfera, deve essere impostato in modo che corrisponda alle strutture da ricostruire. A seconda delle caratteristiche del segnale, è possibile utilizzare l'intensità assoluta o il contrasto locale.

In generale, il contrasto locale funziona meglio per i segnali diffusi. A causa delle caratteristiche di questo segnale, il contrasto locale viene utilizzato per ricostruire la proteina all'interno del nucleo. In ogni caso, le impostazioni devono essere regolate separatamente per ogni segnale o struttura di interesse.

Completa la ricostruzione cliccando sulla freccia verde nella parte inferiore dello schermo. Quindi regola ulteriormente l'oggetto utilizzando lo strumento Matita. Confronta attentamente le ricostruzioni con il segnale originale e taglia e rimuovi le superfici inclinando le immagini secondo necessità in modo che lo strumento di taglio possa servire con precisione al suo scopo.

A questo punto, è possibile misurare il volume, l'area e l'intensità di ciascuna superficie selezionando Statistiche, Statistiche dettagliate e Valori medi. Se lo si desidera, è possibile produrre statistiche con codice colore selezionando la scheda Colore della superficie corrispondente e modificando l'opzione selezionata da Base a Codifica statistica. Utilizzando lo strumento Scatta istantanea, è possibile scattare foto per la pubblicazione.

Se è necessario ricostruire più oggetti all'interno della stessa area, è possibile utilizzare la funzione Memorizza parametri per salvare le informazioni. Il Simiate espresso nelle cellule HEK293 è stato specificamente rilevato dagli anticorpi Simiate trasportati nelle cellule dai peptidi Chariot. Gli assemblaggi di anticorpi Simiate entrano nel soma e nel nucleo, dopo l'applicazione, dove co-localizzano specificamente con FLAG-Simiate, come indicato dalle frecce gialle.

In modo dose-dipendente, gli anticorpi Simiate hanno indotto un'apoptosi massiccia nelle cellule HEK293 mentre gli anticorpi di controllo non hanno avuto alcun effetto. Dato che le cellule neuronali sono molto sensibili agli effetti tossici, la tecnica è stata applicata a colture di ippocampo primarie in cui non vi era alcun effetto sulla vitalità dei neuroni quando si confrontavano cellule mock, o non trattate, e trattate con Chariot. Seguendo lo stesso schema di applicazione, gli assemblaggi di anticorpi Alexa568 di capra anti-cavia sono stati osservati in circa l'83% delle cellule in cui si sono verificati nei somata e nei nuclei in varia misura.

Queste osservazioni sono state ulteriormente supportate da un'analisi 3D, che era coerente con i risultati delle celle HEK293. Quindi, la tecnica Chariot può essere utilizzata con successo per trasfettare i neuroni primari dell'ippocampo dissociati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o sei ore se eseguita correttamente.

La formazione complessa di Chariot e della proteina di interesse dura circa 40 minuti. Per trasfettare le cellule con questi complessi, ci vorranno 70 minuti e altre da una a quattro ore a seconda delle dimensioni e delle proprietà del carico. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi per analizzare la funzione di una proteina in modo più dettagliato, come l'imaging dal vivo e i saggi di motilità, l'analisi e le registrazioni elettrofisiologiche.