Name: Microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare Ion Segnali in tessuto cerebrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Impara a preparare microelettrodi iono-selettivi a doppia canna e concentrici per misurare dinamiche ioniche extracellulari nel tessuto cerebrale di topo. Questo metodo consente di analizzare le variazioni di sodio e potassio durante l'attività neuronale.

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Gli autori desiderano ringraziare C. Roderigo per l&#39;assistenza tecnica di esperti. Ringraziamo S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich Heine università Duesseldorf) per un aiuto nella produzione video. La ricerca in laboratorio dell&#39;autore è stato finanziato dal Research Association tedesco (DFG: Ro 2327 / 8-1 a CRR), l&#39;Università Heinrich Heine Duesseldorf (NH) e dal National Institutes of Health di Grant R01NS032123 (a MC).

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Liquido a base porta-elettrodi ionoselettivi sono stati impiegati con successo per decenni e per molti ioni, sensori altamente specifici sono disponibili 22-26. Quando utilizzato nello spazio extracellulare (ECS) di preparazioni cerebrali vertebrati, si deve tenere presente, tuttavia, che questa è una tecnica molto invasiva: mentre la larghezza della ECS è solo circa 20-50 nm, il diametro di ione-selettivo microelettrodi è di circa 1 micron (elettrodi a doppia canna) o più grandi (elettrodi concentrici). Le punte dei microelettrodi ionoselettive saranno quindi non solo danneggiare il tessuto durante la loro impalamento del tessuto, ma anche ingrandire la ECS, favorendo una sottovalutazione dei transitori di ioni. Nonostante queste insidie, transitori ioni extracellulari in risposta all&#39;attività neuronale sono notevolmente coerenti tra i diversi laboratori 7,8, attestanti l&#39;affidabilità di questo metodo. Le prestazioni e l&#39;idoneità di elettrodi ionoselettividipende dalla loro sensibilità e selettività, che è definita dal cocktail sensore (&#39;ionoforo membrana liquida&#39;) utilizzato. Cocktail sensori contengono una speciale molecola carrier, per es valinomicina K + microelettrodi -selettivo che presenta un&#39;elevata selettività per il potassio 27. Nonostante, cross-reattività con altri ioni può avvenire e deve essere testato. Valinomicina presenta una significativa reattività crociata per ammonio, che deve essere considerato quando si interpretano i risultati (ad esempio, 11,12). Inoltre, poiché la tensione di risposta dei ionofori segue un comportamento Nernst (cfr equazione 1), il rapporto segnale-rumore e soglia di rilevamento dipendono dalla concentrazione dello ione da misurare. Così, mentre piccolo [K +] o transienti evocare grandi variazioni di tensione contro la bassa linea di base [K +] o, piccolo [Na +] o transitori sono molto più difficili da individuare contro hibasale gh [Na +] o (vedere la figura 5 e 6). Le prestazioni di elettrodi ionoselettivi è determinato anche dalla risoluzione temporale, che è largamente governata dalla sua costante di tempo elettrica. Quest&#39;ultima è determinata principalmente dalla resistenza assiale del sensore, e dalla capacità distribuita lungo la lunghezza della pipetta, tra le soluzioni interne e il fluido esterno. Nella configurazione a doppia canna, la resistenza è alta, a causa della lunga colonna di sensore ione ripiena. Per un dato dielettrico isolante (in questo caso vetro borosilicato), la capacità è governato dallo spessore dielettrico. In elettrodi a doppia canna, la larghezza dielettrico equivale alla parete di vetro della pipetta. Quando il vetro si assottiglia in prossimità della punta, la larghezza dielettrico cade, e la capacità aumenta. Questi fattori si combinano per produrre elettrodi con tempi di risposta che vanno da alcune centinaia di millisecondi a diversesecondi, come questi fattori sono molteplici. Un importante vantaggio del disegno concentrico è che sia la resistenza assiale e la capacità al bagno sono notevolmente ridotte. I derivatori pipetta concentrici maggior parte della resistenza dello scambiatore di ioni ripiena, lasciando solo un residuo negli ultimi micrometri prima della punta. Inoltre, la soluzione di riempimento all&#39;interno della pipetta concentrica è fisicamente distanziato dal bagno, separato dallo spessore di due pareti di vetro, riducendo notevolmente la capacità. Come illustrato in precedenza 10, l&#39;effetto combinato della ridotta resistenza e capacità è un miglioramento della risoluzione temporale di due ordini di grandezza. In caso di Ca 2+ concentrici e pH microelettrodi, 90% i tempi di risposta erano partire da 10-20 msec 10. Un vantaggio relativo del disegno concentrica è il livello di rumore inferiore (vedi figura 8). Grazie alla resistenza notevolmente ridotto, transitori di tensione da qualsiasi ambienrumore t sono ridotti al minimo. Inoltre, il recupero da tali transitori è rapido, a causa della costante di tempo veloce. Tali manufatti sono quindi piccolo e veloce, e hanno un effetto meno dirompente sulle registrazioni fisiologiche (vedi Figura 8). Ci sono anche degli svantaggi della tecnica concentrica. Innanzitutto, il loro assemblaggio è più complesso e richiede tempo. Un secondo inconveniente è la necessità di posizionare un microelettrodo riferimento separato con la punta, che comporta l&#39;utilizzo della propria micromanipolatore separato o un doppio manipolatore specializzata. Infine, microelettrodi doppia canna possono essere estesi ad un disegno tripla canna, consentendo rilevamento di due specie ioniche differenti allo stesso tempo 28, che non è possibile per elettrodi concentrici. Insidie ​​più comuni Silanizzazione inefficiente. Il passo più importante, e ostacolo principale nella fabbricazione di qualsiasi liquido-senso basate microelettrodo ionoselettivo è la procedura silanizzazione. Quando gli elettrodi non riescono a rispondere ai cambiamenti nella concentrazione di ioni specifici, o di rispondere con una risposta sub-Nernst (vale a dire, ben meno di 58 mV per dieci volte differenza di concentrazione), scarsa efficacia di silanizzazione è in genere la causa. Nella nostra esperienza, questo può verificarsi se l&#39;umidità atmosferica è troppo alto, o troppo basso, tipico delle condizioni piena estate o inverno, rispettivamente. Se è fattibile per esercitare un certo controllo dell&#39;umidità ambientale, questi problemi possono essere superati. Resistenza dell&#39;elettrodo è troppo alta. Se necessario, la resistenza della canna sensibile agli ioni può essere ridotta di bisellatura. A tal fine, esporre la sua punta a un forte getto di abrasivo sospeso in acqua per un paio di secondi. Questo farà sì che la punta upmost per rompere e abbassare la resistenza al valore desiderato. Ponti salini. Saleponti tra le botti di ioni e di riferimento determinano elettrodi scarsamente o niente di rispondere e possono quindi anche confondere notevolmente le loro prestazioni nella calibrazione. Come accennato in precedenza (vedi punto 1.6.), Questo è soprattutto un problema quando si sceglie a doppia canna di vetro theta, ma è un evento raro quando si utilizza l&#39;offset, tecnica botte contorto qui descritto. Con la facilità di fabbricazione in mente, il design a doppia canna originale di Lux 29 può essere spesso utilizzato proficuamente. Questo metodo utilizza pre-riempimento delle botti di ioni e di riferimento con soluzioni saline, un&#39;esposizione veloce per una soluzione di silano con la sua aspirazione e l&#39;espulsione dalla punta, seguendo per incorporazione di scambiatore ionico, anche tramite la punta (vedi 30,31) . Questi elettrodi possono essere realizzati in circa 10 minuti, ma il loro formato di punta è in genere 4 micron o più e sono più inclini a fallire nel corso di un esperimento. Al contrario, i metodi silanizzazione che comportano l&#39;esposizione al vapore silano e caloreing può produrre elettrodi con punte più piccoli che durano giorni, e, a volte settimane. Nel loro insieme, ci sono diversi protocolli e approcci su come prepararsi microelettrodi ionoselettive. Qui, abbiamo descritto due principali procedure per la fabbricazione di microelettrodi due canne e concentrici intrecciati che funzionano bene e affidabile nei nostri laboratori, con un tasso di successo complessivo prossimo al 100%. È importante sottolineare che queste tecniche saranno trasferibili alla misurazione di altri ioni specie, tra cui il pH o di calcio, e sarà anche essere applicabile ad altri preparati che il cervello, comprese le cavità piene di liquido o di fluidi in genere. Ultimo, ma non meno importante, microelettrodi ionoselettive consentono la determinazione delle concentrazioni di ioni all&#39;interno delle cellule. A causa della loro relativamente grandi dimensioni punta (~ 1 micron), tale volontà, però, sarà possibile solo in cellule con un corpo a grandi cellule, quali ad esempio, ha trovato in preparati invertebrati 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

La segnalazione elettrica nel cervello si basa sul flusso di ioni attraverso le membrane plasmatiche. I principali movimenti ionici da e verso lo spazio extracellulare non sono mediati solo dal passaggio attraverso canali ionici voltaggio-dipendenti, ma anche dai recettori ionotropici postsinaptici e dai trasportatori ionici. L'attività neuronale è quindi accompagnata da complessi cambiamenti nella concentrazione extracellulare di tutti i principali ioni 1. Ad esempio, è stato dimostrato che l'afflusso di sodio nei neuroni durante l'attività eccitatoria provoca una diminuzione della concentrazione extracellulare di sodio ([Na+]o) 2. Lo stesso vale per la concentrazione extracellulare di calcio perché gli ioni calcio entrano rapidamente sia nelle strutture pre che postsinaptiche 3. Allo stesso tempo, il potassio si muove in modo opposto e questo media un aumento della concentrazione extracellulare di potassio ([K+]o) nell'intervallo mM basso 4,5. L'attività sinaptica provoca anche cambiamenti nel pH extracellulare che sono in parte mitigati dai concomitanti flussi di membrana gliale che modificano il pH intragliale 6,7. Questi cambiamenti legati all'attività nelle concentrazioni di ioni extracellulari hanno conseguenze funzionali significative. Ad esempio, anche piccoli aumenti di [K+]o depolarizzano i neuroni e le cellule gliali, alterando così l'eccitabilità neuronale, ed esistono diversi meccanismi per rimuovere l'eccesso di potassio 8. Il fallimento di questi può provocare l'attività epilettiforme dei neuroni o fenomeni come la diffusione della depressione 1. 
A causa della loro importanza critica, la determinazione quantitativa delle concentrazioni di ioni extracellulari è spesso necessaria e richiesta per comprendere la funzione e la disfunzione delle reti neurali in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Per decenni, i microelettrodi iono-selettivi a doppia canna si sono dimostrati strumenti eccellenti per tali misurazioni nel tessuto cerebrale 9. Per molti ioni sono disponibili sensori altamente specifici con bassa reattività crociata per altri ioni. Oltre ai classici elettrodi a doppia canna, sono stati recentemente introdotti i cosiddetti elettrodi concentrici. Questi ultimi forniscono una risoluzione temporale superiore, ma richiedono un po' più di tempo e fatica per costruirne 10. 
Di seguito, descriveremo la preparazione e la calibrazione di questi due tipi di microelettrodi ionoselettivi. Mostriamo quindi come questi elettrodi possano essere impiegati nelle preparazioni di fette di cervello per misurare le variazioni di [K+]o o [Na+]o indotte dall'attività eccitatoria seguendo diversi paradigmi di stimolazione tra cui il bagno e l'applicazione di pressione di farmaci.

<table><tbody><tr><td>Abrasivo&nbsp; &nbsp;</td><td>MicroPolish&nbsp;</td><td>Buehler GmbH</td><td>Disciolto in</td></tr><tr><td>capillari in vetro borosilicato</td> A.dest <td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>Pipetta di applicazione; 75 mm x 2 mm, spessore della parete 0,3 mm</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato con filamento</td><td>GC 150 F-15&nbsp;</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>Per il sensore di microelettrodi a doppia canna&nbsp;</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato con filamento</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>Per il riferimento di microelettrodi a doppia canna&nbsp;</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato con filamento</td><td>GB-200TF-15&nbsp;</td><td>Canale</td><td>esterno concentrico. D.E. 2,0 mm &nbsp;</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato con filamento</td><td>GB-120TF-10</td><td>Science Products</td><td>Canale interno concentrico. D.E. 1,2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments Amplificatore</td><td></td></tr><tr><td>elettrometrico con headstage</td><td></td><td>Su misura</td><td>Rin = 10 T&Omega; e Ibias=50 fA-1pA (disponibili in commercio&nbsp; alternative: es.g. Dagan IX2-700, con headstage (resistenza di feedback da 10 Gig) o EPMS-07, NPI, Tamm, Germania)</td></tr><tr><td>Camera sperimentale</td><td></td><td>Su misura</td><td>Disponibile in commercio da es. &nbsp; Warner Instruments, Stati Uniti; &nbsp; Scientifica, Regno Unito</td></tr><tr><td>Fornace</td><td></td><td>Heraeus</td><td>Deve rimanere costante a 200 gradi C</td></tr><tr><td>Cera dura appiccicosa / cera dentale&nbsp;</td><td>Deiberit 502&nbsp;</td><td>Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td><td></td> riscaldante <td>Su misura</td><td>Deve rimanere costante a 40 gradi C</td></tr><tr><td>Porta microelettrodi in plexiglas</td><td></td><td>Su misura</td><td>Doppio cilindro: O.D. &nbsp; capillari 1,5 mm, concentrici: O.D.&nbsp; capillari 2 mm</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>MD4R</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>M205C</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Plan 0.8xLWD</td><td>Estrattore per</td> pipette Leica <td></td></tr><tr><td></td><td>Modello PP-830</td><td>Narishige</td><td>Microelettrodi concentrici&nbsp;</td></tr><tr><td>Estrattore per pipette</td><td>Modello P-97</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td>Sensore di microelettrodi concentrici&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema pneumatico di espulsione dei farmaci</td><td>Picospritzter Tipo II</td><td>General Valve TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Stadio a coda di rondine da viaggio</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>Colla bicomponente</td><td>&nbsp; Araldite</td><td>Huntsman advanced materials GmbH</td><td>Si può anche usare una piccola striscia di foglio di alluminio per incollare i capillari insieme.</td></tr><tr><td>Silverwire</td><td>99,9%&nbsp;</td><td>Affettatrice / Vibratomo Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr> HM <tr><td></td><td>650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>AxoScope 8.1&nbsp;</td><td>Estrattore verticale Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Tipo PE-2</td><td>Narishige Scientific Instruments</td><td>Con un mandrino girevole per microelettrodi a doppia canna</td></tr><tr><td>x/y stadio traslazionale</td><td></td><td>Su misura</td><td></td></tr><tr><td>1(S),9(R)-(&minus;)-Bicucullina metioduro Sigma</td><td>aldrich</td><td>14343</td><td>Antagonista competitivo dei recettori GABAA (fotosensibili); ATTENZIONE antagonista tossico</td></tr><tr>del recettore<td>CNQX</td><td>Sigma aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA/kainato; ATTENZIONE tossico</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>antagonista del recettore NMDA; ATTENZIONE</td></tr><tr><td>Esametiltililazano tossico (HMDS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td>ATTENZIONE: Infiammabile, tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione) e corrosivo per i metalli e la pelle</td></tr><tr><td>Acido L-aspartico</td><td>Sigma aldrich</td><td>A9256</td><td>Attiva NMDA e non-NMDA e EAAT Acido L-glutammico</td></tr><tr><td>sale monosodico idrato</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1626</td><td>Attiva NMDA-R, AMPA-R, QA-R e KA-R),&nbsp; mGluR e EAAT</td></tr><tr><td>Ionoforo di potassio I - cocktail B</td><td>Fluka</td><td>60403</td><td>A base di valinomicina; ATTENZIONE tossico</td></tr><tr><td>Sodio ionoforo II - cocktail A</td><td>Fluka&nbsp; &nbsp;</td><td>71178</td><td>Basato su ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inibitore dei canali Na+ voltaggio-dipendenti; ATTENZIONE acqua tossica</td></tr><tr><td>, ultra pura</td><td>Sigma aldrich</td><td>W3500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare ion segnali in tessuto cerebrale

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

L'attività elettrica nel cervello è accompagnata da significativi flussi di ioni attraverso le membrane, con conseguenti cambiamenti complessi nella concentrazione extracellulare di tutti i principali ioni. Poiché questi spostamenti ionici hanno conseguenze funzionali significative, la loro determinazione quantitativa è spesso necessaria per comprendere la funzione e la disfunzione delle reti neurali in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Nel presente studio, dimostriamo la fabbricazione e la calibrazione di microelettrodi iono-selettivi a doppio barile, che si sono dimostrati strumenti eccellenti per tali misurazioni nel tessuto cerebrale. Inoltre, vengono descritti anche i cosiddetti microelettrodi iono-selettivi "concentrici" che, in base al loro diverso design, offrono una risoluzione temporale di gran lunga migliore dei rapidi cambiamenti ionici. Mostriamo quindi come questi elettrodi possono essere impiegati in preparazioni acute di fette di cervello dell'ippocampo del topo. Utilizzando microelettrodi selettivi per il potassio a doppia canna, sono dimostrate variazioni della concentrazione extracellulare di potassio ([K+]o) in risposta all'applicazione esogena di agonisti del recettore del glutammato o durante l'attività epilettiforme. Inoltre, illustriamo le caratteristiche di risposta degli elettrodi sensibili al sodio, a doppia canna e concentrici e confrontiamo la loro rilevazione delle variazioni della concentrazione extracellulare di sodio ([Na+]o) evocate dal bagno o dall'applicazione di pressione di farmaci. Queste misurazioni mostrano che, sebbene le ampiezze di risposta siano simili, i microelettrodi concentrici di sodio mostrano un rapporto segnale/rumore e un tempo di risposta superiori rispetto al design a doppio cilindro. In generale, le procedure dimostrate saranno facilmente trasferibili alla misurazione di altre specie di ioni, tra cui pH o calcio, e saranno applicabili anche ad altre preparazioni.

<html> Per monitorare [K +] o e sue variazioni in risposta all&#39;attività eccitatoria, un microelettrodo doppia canna potassio-selettivo è stato inserito nel radiatum strato dell&#39;area CA1. Pochi minuti dopo impalamento, la canna ionoselettivo dell&#39;elettrodo raggiunto una linea di base stabile (Figura 7A), corrispondente ad un [K +] o di circa 2,8 mm, un valore prossimo al [K +] del ACSF utilizzato ( 2,5 mm). Bagno applicazione di glutammato 0,5 mM per 10 sec indotto un aumento reversibile [K +] o di circa 4 mm, seguito da un undershoot al basale pari a ~ 0,7 mM (Figura 7A). L&#39;abbassamento della concentrazione di glutammato a 0,4, 0,3, e 0,2 mM causato una corrispondente riduzione dell&#39;ampiezza sia l&#39;aumento transitorio e sottomodulazioni [K +] o (Figura 7A). OAD / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. transitori potassio extracellulari in risposta all&#39;attività eccitatoria. (A) [K +] o transitori, consistente in un aumento seguito da un undershoot inferiore al valore basale, indotta da bagno applicazione di diverse concentrazioni di glutammato per 10 secondi come indicato. (B) L&#39;influenza di una perfusione con bloccanti del recettore del glutammato (CNQX, 100 micron, APV, 100 micron) e tetrodotossina (TTX; 0,5 micron) su [K +] o transienti indotta dalla applicazione bagno di glutammato 0.5 mm per 10 sec. (C) spontaneo [K +] o transienti in presenza di 0 mg 2+ / BIC. Gli esperimenti riportati in AC sono stati eseguiti utilizzando elettrodi a doppia canna. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cl</a>ick qui per vedere una versione più grande di questa figura. Esperimenti precedenti hanno dimostrato che tali [K +] o segnali glutammato indotto non risultano significativamente modificati durante l&#39;applicazione di TTX, e sono quindi in gran parte indipendente sull&#39;apertura dei canali del sodio voltaggio-dipendenti e l&#39;azione neuronale potenziale di generazione di 15,16. Per studiare i meccanismi alla base delle osservati [K +] o cambiamenti in risposta al glutammato, abbiamo applicato bloccanti del recettore del glutammato, cioè CNQX (100 micron; bloccante dei recettori AMPA) e APV (100 micron; bloccante dei recettori NMDA) in presenza di TTX (0,5 mM). Al Bagno perfusione con questi bloccanti, glutammato indotta [K +] o cambiamenti erano praticamente abolito, confermando la loro dipendenza l&#39;apertura di canali recettori del glutammato ionotropi come riportato in precedenza (ad esempio, 17; Figura 7B). Per dimostrare ulteriormente tegli rilevanza di glutamatergico di eccitazione per la generazione di extracellulare [K +] i segnali, le fette sono stati perfusi con nominalmente Mg 2 + -free salina contenente 10 mM bicucullina methiodide (0mg 2+ / BIC). Questo allevia voltaggio-dipendenti Mg 2+ -block dei recettori NMDA e smorza l&#39;inibizione bloccando i recettori GABA A, provocando spontanea attività epilettiforme ricorrente nella rete (ad esempio, 18,19). Come previsto 20, spontanea, ricorrente [K +] o transienti, pari a circa 1,5 mm sono stati rilevati in 0mg 2+ / salina BIC (Figura 7C). Tra queste risposte, più piccolo [K +] o transienti con una ampiezza media di circa 0,2 mM verificato (figura 7C). In una seconda serie di esperimenti, abbiamo utilizzato [Na +] microelettrodi sensitive per determinare [Na +] o cambiamenti evocati mediante l&#39;applicazione diagonisti glutammato. Qui, abbiamo anche confrontato le caratteristiche di risposta di microelettrodi a due canne e concentriche che impiegano due diversi paradigmi di applicazione. [Na +] microelettrodi -sensitive erano posizionati nella radiatum strato a una profondità di circa 50 micron. Dopo una linea di base stabile è stato raggiunto, il glutammato agonista L-aspartato è stato applicato per bagno perfusione (10 mM, 120 sec, bagno perfusione a 2,5 ml / min). Come osservato in precedenza 21, applicazione di aspartato ha causato una lenta diminuzione del [Na +] o di circa 15 mm, che è durato circa 5 minuti e poi ha iniziato a recuperare di nuovo al basale (Figura 8A). In particolare, mentre le ampiezze di picco e cinetica delle [Na +] o segnali determinati da entrambi gli elettrodi erano virtualmente identiche in queste condizioni, elettrodi concentrici mostravano una linea di base stabile e una maggiore rumorosità inferiore (Figura 8A). Per verificare il r<html> esponse caratteristiche dei diversi elettrodi sotto un paradigma un&#39;applicazione più rapida, abbiamo glutammato pressione applicata attraverso una pipetta di vetro fine posizionata nella radiatum strato a una distanza di 20-40 micron dalla punta del microelettrodo ione-selettivo. Come previsto 21, applicazione di glutammato (10 mM) per 200 ms causato un calo nella o [Na +] (Figura 8B). Le ampiezze di picco del o diminuzione [Na +] erano nello stesso intervallo per entrambi i tipi di elettrodi (doppia canna: 4,5 - 13.5 mM, n = 14; concentrici: 2.0 - 19.1 mM, n = 15). Tuttavia, in contrasto con i risultati ottenuti con lenta perfusione vasca (vedi sopra), non solo il rapporto segnale-rumore, ma anche l&#39;andamento temporale dei [Na +] o segnali rilevati dai due tipi di elettrodi differivano significativamente. Il tempo medio di picco è stato 3,5 secondi per la doppia canna e solo 1,3 secondi per i microelettrodi concentrici. controparti ve_content &quot;&gt; Quindi, questi risultati dimostrano e confermano la cinetica di risposta più veloci del concentriche rispetto microelettrodi a doppia canna Na + -selettivo, (vedi Figura 6C e 8B), come è stato anche notato per Ca 2+ e pH-selettivi 10 . A differenza del primo studio, in cui la stimolazione sinaptica breve scoppio è stata effettuata per evocare transitori ioni veloce sinapticamente-indotti, c&#39;era solo una tendenza, ma nessuna differenza significativa nelle ampiezze di picco medie tra elettrodi concentrici e doppia canna con la nostra applicazione paradigma. Questo è probabilmente dovuto al fatto che la distanza della pipetta applicazione dalla punta del microelettrodo ionoselettivo variava di un fattore di due (20-40 micron), e di conseguenza, che la concentrazione glutammato massimo in corrispondenza della zona di destinazione non era la stessa in diversi esperimenti, ostacolando qualsiasi differenza esistente in ampiezze di picco. (A) In alto tracce: Variazione della Voltage delle canne di riferimento (VREF) di una doppia canna elettrodo (nero traccia tratteggiata) ed un elettrodo concentrica (grigio traccia) in risposta ai cambiamenti nella vasca di concentrazione di Na + ([Na +] b) come indicato. Si noti che le risposte tensione di entrambi gli elettrodi sono praticamente identici. Tracce di fondo: variazioni della tensione della Na + -potential (V Na +) di una doppia canna elettrodo (traccia nera) ed un elettrodo concentrica (grigio traccia) in risposta alle variazioni di [Na +] b. (B) trame mezza logaritmiche del [Na +] b rispetto al V Na + di entrambi gli elettrodi. Trame lineare dei dati rivelano una pendenza di circa 48 mV per entrambi gli elettrodi. (C) Reazione del V Na + di una doppia canna (trace nero) e un elettrodo concentrica (grigio trace) ad una variazione rapida della [Na +] b da 152 mM a 70 mM. Si noti che il tempo di risposta dell&#39;elettrodo concentrica è significativamente faster. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Figura 8: transitori di sodio extracellulari rilevate tramite elettrodi a doppia canna e concentriche. (A) i cambiamenti transitori V ref e [Na +] o indotta da bagno perfusione con aspartato 10 mm per 120 sec, come indicato dalla barra. Le tracce superiori mostrano una registrazione eseguita con un elettrodo a due canne, le tracce inferiori sono stati registrati utilizzando un elettrodo concentrica. (B) cambiamenti transitori V ref e [Na +] o indotta applicando pressione locale con glutammato 10 mM per 0,2 sec come indicato dalla freccia. Le tracce superiori mostrano una registrazione eseguita con un elettrodo a due canne, le tracce inferiori sono stati registrati utilizzando un elettrodo concentrica.Linee rosse tratteggiate rappresentano attacchi lineari del periodo tra l&#39;inizio del segnale al massimo. Si noti che il tempo di risposta dell&#39;elettrodo concentrica è significativamente più veloce in questa condizione. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Dimostriamo la fabbricazione, la calibrazione e le proprietà di due tipi di microelettrodi iono-selettivi (a doppio cilindro e concentrici) per la misurazione delle concentrazioni di ioni nel tessuto cerebrale. Questi vengono poi utilizzati nella preparazione della fetta di ippocampo di topo per dimostrare che l'attività eccitatoria cambia sia le concentrazioni extracellulari di potassio che di sodio.

Microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare Ion Segnali in tessuto cerebrale

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare e analizzare la dinamica ionica nello spazio extracellulare del tessuto cerebrale. La misurazione dei transitori ionici viene effettuata utilizzando microelettrodi selettivi per ioni, che possono essere preparati secondo una configurazione a doppio canale o concentrica. Come primo passo, i microelettrodi vengono calibrati nel bagno sperimentale.Successivamente, gli elettrodi vengono inseriti in fette acute dell'ippocampo di topo per la registrazione, al fine di evocare spostamenti ionici extracellulari; viene fornito il neurotrasmettitore glutammato oppure un agonista del glutammato. Il glutammato si lega e apre i recettori ionotropici sulle spine postsinaptiche, permettendo l'ingresso di sodio e l'uscita di potassio dalle cellule. In definitiva, ciò determina una diminuzione del sodio extracellulare e un aumento del potassio extracellulare, che vengono rilevati dagli elettrodi micro selettivi per ioni.Questo metodo viene utilizzato per studiare la regolazione ionica extracellulare e le transizioni di ferro indotte dall'attività nel cervello. Descriviamo qui la preparazione e la calibrazione di due tipi di microelettrodi selettivi per ioni. Mostriamo come questi possano essere utilizzati in fette di tessuto cerebrale acuto per misurare le variazioni di potassio o sodio extracellulare in risposta all'applicazione di neurotrasmettitori.La procedura sarà dimostrata da Nicole Hark e Simon per il mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare una capillare in vetro borosilicato con filamento da utilizzare per il barile sensibile agli ioni e un'altra per il successivo barile di riferimento. Successivamente, utilizzare una colla bicomponente o una piccola striscia di foglio di alluminio per fissare insieme le capillari lunga e corta alle due estremità.Riscaldare la capillare doppia in un forno a 60 gradi Celsius per un'ora per rimuovere l'umidità residua. Successivamente, conservare le elettrodi in un essiccatore fino all'uso. Centrare la capillare doppia in un estrattore verticale con una stecca di gesso. Utilizzare una stecca di gesso per prevenire l'allungamento della capillare.Mantenere delicatamente la bobina finché il vetro non diventa abbastanza morbido da permettere una rotazione orizzontale del revolver. Dopo il raffreddamento, ruotare di 180 gradi e rimuovere l'elemento di rottura meccanico. Applicare un secondo protocollo di riscaldamento per tirare il capillare, ottenendo due capillari doppi affusolati.Il diametro della punta della capillare doppia deve essere vicino a un micron. Riempire ora il barile di riferimento fino alla sua punta con acqua distillata per prevenire la colonizzazione. Nella procedura seguente, posizionare una capillare a doppio barile con la punta rivolta verso l'alto su un supporto appositamente realizzato.Quindi posizionare questo supporto sulla bottiglia a bocca larga contenente l'HMDS pre-riscaldato e incubare per 70 minuti. Successivamente, trasferire la capillare su un supporto metallico. In seguito, collocarla nel forno preriscaldato per due ore al fine di asciugare entrambi i compartimenti dopo la colonizzazione; mantenere la capillare asciutta nel desiccante fino all'uso.Nel giorno dell'esperimento, preparare l'elettrodo selettivo per ioni riempiendo la punta del barile silanizzato con due o tre microlitri del sensore selettivo per ioni. Successivamente, riempire il barile con cloruro di sodio 100 millimolare per un microelettrodo sensibile al sodio o con soluzione salina di cloruro di potassio 100 millimolare per un microelettrodo sensibile al potassio. Prestare attenzione a non introdurre bolle d'aria aggiuntive durante questa procedura.Se la silanizzazione ha successo e il sensore è stato riempito correttamente, la superficie del sensore dovrebbe apparire come una superficie concava chiaramente visibile rispetto al materiale di riempimento posteriore. Successivamente, riempire il canale di riferimento, quindi inserire i fili di argento clorurato in entrambi i barilotti e sigillare ciascun barilotto con cera dentale. In questa procedura, tirare un capillare di due millimetri nel tiratore orizzontale in modo da ottenere una conicità breve e un diametro della punta di quattro micron.Immediatamente prima dell'uso, riempire il capillare silanizzato con 0,2 microlitri di sensore. Per preparare il capillare interno, tirare un capillare di piccolo diametro in modo da ottenere due capillari con coni allungati e punte affilate. Quindi riempirli con soluzione salina di cloruro di sodio 100 millimolare o cloruro di potassio 100 millimolare.Posizionare i capillari riempiti con il sensore e quelli riempiti con soluzione salina direttamente in linea tra loro su un tappo appositamente realizzato con coprioggetti. Inserire parzialmente il capillare più piccolo all'interno del capillare più grande. Successivamente, fissare i capillari su un altro coprioggetto.Utilizzando argilla da modellare, trasferire i capillari sul piano di un microscopio e osservarli con un'ingrandimento di 100x. Con l'aiuto di un'asta di vetro montata su un micromanipolatore, avanzare lentamente il capillare esterno sopra il capillare interno finché la distanza tra le loro punte è approssimativamente di cinque micron. Fissare l'estremità aperta del capillare esterno al capillare interno utilizzando cera da dentista e inserire un filo di argento.Per preparare l'elettrodo di riferimento, tirare una capillare con filamento in un tiratore verticale, scartare la pipetta superiore, quindi aprire la morsa inferiore e sollevare la pipetta inferiore di circa cinque millimetri. Chiudere nuovamente la morsa e sollevarla fino a quando la punta dell'elettrodo inferiore si trova posizionata a circa cinque millimetri sopra la bobina riscaldante. Successivamente, riscaldare la bobina e utilizzare una pinzetta per piegare la punta di circa 45 gradi lateralmente.Piegare nuovamente di circa meno 45 gradi per riportare la punta in parallelo con l'asta principale. Quindi riempire il barile di riferimento con abbondante soluzione salina tamponata. Inserire un filo di argento clorurato e sigillare il barile con cera da dentista.In questo passaggio, collegare entrambi gli elettrodi sensibili agli ioni e di riferimento ai micromanipolatori e abbassarli in una camera sperimentale perfusa con A CSF. Sotto il microscopio stereoscopico, collegare i fili di argento clorurato agli ingressi corrispondenti della testa dell'amplificatore differenziale. Quindi determinare le resistenze degli elettrodi.Successivamente, regolare i segnali di tensione a zero e iniziare la registrazione per la calibrazione. Dopo aver ottenuto una baseline stabile, passare alla soluzione salina contenente concentrazioni definite dell'ione da misurare. Ora, trasferire una sezione di ippocampo spessa 250 micron nella camera sperimentale e fissarla con una griglia.Abbassare l'elettrodo microelettrico selettivo per ioni calibrato sulla superficie della sezione. Successivamente, abbassare ulteriormente l'elettrodo di circa 50 micron nello strato radiatum della regione CA1. Per applicare l'agonista del trasmettitore, riempire la pipetta di applicazione con 0,5 millimoli di glutammato.Collegare la pipetta a un micro manipolatore e connetterla a un dispositivo di applicazione della pressione. Successivamente, abbassare la pipetta nell&#39;organo e posizionarla con attenzione in prossimità della punta dell&#39;elettrodo microscopico selettivo agli ioni. Iniziare l&#39;applicazione della pressione a 40 millibar.Qui viene mostrata la variazione di tensione dei barili di riferimento di un elettrodo a doppio barile e di un elettrodo concentrico in risposta alle variazioni della concentrazione di sodio nella soluzione. E queste sono le variazioni della tensione del potenziale di sodio di un elettrodo a doppio barile e di un elettrodo concentrico in risposta alle variazioni della concentrazione di sodio nella soluzione. Questa figura mostra il grafico semilogaritmico della concentrazione di sodio nella soluzione in funzione della tensione del potenziale di sodio di entrambi gli elettrodi.I grafici lineari mostrano una pendenza di circa 48 millivolt per entrambi gli elettrodi. Qui è riportata la risposta di un elettrodo a doppio canale e di uno concentrico a un rapido cambiamento nella soluzione. Concentrazione di sodio da 152 millimolare a 70 millimolare.Si noti che il tempo di risposta dell'elettrodo concentrico è significativamente più rapido. Questa figura mostra il transitorio di sodio extracellulare rilevato da elettrodi doppi canali ed elettrodi concentrici; le variazioni transitorie della tensione nei canali di riferimento e la concentrazione extracellulare di sodio sono state indotte da perfusione del bagno con 10 millimolare di aspartato per 120 secondi, come indicato dalla barra. In questa figura, le variazioni transitorie della tensione nei canali di riferimento e della concentrazione di sodio extracellulare sono state indotte da applicazione locale sotto pressione di 10 millimolare di glutammato per 0,2 secondi.Si noti che il tempo di risposta dell'elettrodo conico è significativamente più rapido in queste condizioni. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante tenere presente che un corretto isolamento è il passaggio chiave per la produzione con successo di microelettrodi selettivi per il ferro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare e utilizzare questi elettrodi per la rilevazione del ferro extracellulare transiente nel tessuto cerebrale.

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