Microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare Ion Segnali in tessuto cerebrale

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare e analizzare la dinamica ionica nello spazio extracellulare del cervello. Fazzoletto. La misurazione dei transienti ionici viene eseguita utilizzando microelettrodi iono-selettivi, che possono essere preparati in base a un design a doppio cilindro o concentrico. Come primo passo, i micro elettrodi vengono calibrati nel bagno sperimentale.

Quindi gli elettrodi vengono inseriti nelle fette acute dell'ippocampo di topo per la registrazione per evocare spostamenti ionici extracellulari del trasmettitore glutammato, oppure viene fornito un agonista del glutammato. Il glutammato si lega e apre i recettori ionotropici nelle spine postsinaptiche, il che consente l'afflusso di sodio all'interno e all'esterno delle cellule. In definitiva, ciò si traduce in una diminuzione del sodio extracellulare e in un aumento del potassio extracellulare che vengono rilevati dai micro elettrodi ionoselettivi.

Questo metodo viene impiegato per studiare la regolazione ionica extracellulare e i transitori di ferro indotti dall'attività nel cervello. Qui descriviamo la preparazione e la calibrazione di due tipi di micro elettrodi ionoselettivi. Mostriamo come possono essere impiegati in fette di tessuto cerebrale acuto per misurare i cambiamenti nel potassio o nel sodio extracellulare in risposta all'applicazione di neurotrasmettitori.

La procedura sarà dimostrata da Nicole Hark e Simon per il mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare una fresa in vetro silicato capillare con filamento da utilizzare per il cilindro sensibile agli ioni e un altro per il successivo cilindro di riferimento. Quindi, usa la colla bicomponente o una piccola striscia di foglio di alluminio per fissare insieme il capillare lungo e corto su entrambe le estremità.

Riscaldare il doppio capillare in un forno a 60 gradi Celsius per un'ora per rimuovere l'umidità residua. Successivamente, conservare gli elettrodi in un essiccante fino a quando non si centra il doppio capillare in un estrattore verticale con un gesso revolver. Usa un gesso per evitare l'allungamento del capillare.

Tenere la bobina delicatamente fino a quando il vetro è abbastanza morbido da consentire una rotazione orizzontale del revolver. Mandrino di 180 gradi dopo il raffreddamento, rimuovere il freno meccanico. Applicare un secondo protocollo di riscaldamento per tirare il capillare ottenendo due capillari affilati a doppia canna.

Il diametro della punta del doppio capillare deve essere vicino a un micron. A questo punto riempire la botte di riferimento fino alla punta con acqua distillata per evitare la colonizzazione. Nella procedura seguente, posizionare un capillare a doppia canna con la punta rivolta verso l'alto su un supporto personalizzato.

Quindi posizionare questo supporto sul flacone a bocca larga contenente l'HMDS preavvertito e incubare per 70 minuti. Successivamente, trasferire il capillare su un supporto metallico. Successivamente, metterlo nel forno preriscaldato per due ore ad asciugare entrambe le botti dopo la colonizzazione, mantenere il capillare asciutto nell'essiccato fino all'utilizzo.

Il giorno dell'esperimento, preparare l'elettrodo iono-selettivo riempiendo la punta del cilindro siliconato con due o tre microlitri del sensore iono-selettivo. Quindi riempire nuovamente il cilindro con 100 millimolari di cloruro di sodio per un microelettrodo sensibile al sodio o soluzione salina di cloruro di potassio da 100 millimolari per un microelettrodo sensibile al potassio. Fare attenzione a non inserire ulteriori bolle d'aria durante questa procedura.

Se l'inquadratura ha esito positivo e il sensore è riempito correttamente, la superficie del sensore dovrebbe apparire come una superficie concava chiaramente visibile contro il riempimento. Quindi, riempire il canale di riferimento, quindi inserire i fili di argento clorurato in entrambi i cilindri e sigillare ogni cilindro con cera dentale. In questa procedura, tirare un capillare di due millimetri nell'estrattore orizzontale per ottenere una conicità corta e un diametro della punta di quattro micron.

Poco prima dell'uso, riempire il capillare siliconato con 0,2 microlitri di sensore. Per preparare il capillare interno, tirare un capillare di piccolo diametro per ottenere due capillari con lunghe conicità e punte affilate. Quindi riempirli con 100 millimolari di cloruro di sodio o 100 millimolari di soluzione salina di cloruro di potassio.

Posizionare i capillari riempiti di sensore e salini direttamente in linea l'uno con l'altro su un tappo personalizzato realizzato con vetrini coprioggetti. Inserire parzialmente il capillare più piccolo nel capillare più grande. Quindi, fissare i capillari su un altro vetrino coprioggetti.

Utilizzando l'argilla da modellare, trasferire i capillari sul tavolino di un microscopio e visualizzarli con un ingrandimento di 100x. Con l'aiuto di un'asta di vetro montata su un micro manipolatore, far avanzare lentamente il capillare esterno sul capillare interno fino a quando la distanza tra le loro punte è di circa cinque micron. Fissare l'estremità aperta del capillare esterno sul capillare interno usando cera dentale e inserire un filo d'argento.

Per preparare l'elettrodo di riferimento, tirare un capillare con filamento in un estrattore verticale, gettare la pipetta superiore, quindi aprire il mandrino inferiore e sollevare la pipetta inferiore di circa cinque millimetri. Richiudere il mandrino e sollevarlo fino a quando la punta dell'elettrodo inferiore non si posiziona a circa cinque millimetri sopra la bobina di riscaldamento. Successivamente riscaldare la bobina e utilizzare una pinza per piegare la punta di circa 45 gradi di lato.

Piegalo di nuovo di circa meno 45 gradi per dirigere la punta indietro parallelamente all'albero principale. Quindi riempire il barilotto di riferimento con cumuli di soluzione salina tamponata. Inserire un filo d'argento clorurato e sigillare la canna con cera dentale.

In questa fase, collegare sia l'elettrodo sensibile agli ioni che l'elettrodo di riferimento ai micromanipolatori e calarli in una camera sperimentale perfusa con A CSF. Sotto lo stereomicroscopio, collegare i fili di argento clorurato ai rispettivi ingressi dello stadio principale dell'amplificatore differenziale. Quindi determinare le resistenze degli elettrodi.

Successivamente, regolare i segnali di tensione su zero e avviare la registrazione per la calibrazione. Dopo aver ottenuto una linea di base stabile, passare alla soluzione salina contenente concentrazioni definite dello ione da misurare. Ora, trasferisci una fetta di ippocampo spessa 250 micron nella camera sperimentale e fissala con una griglia.

Abbassare il microelettrodo iono-selettivo calibrato sulla superficie della fetta. Quindi abbassare ulteriormente l'elettrodo per circa 50 micron nel radiatore di strato della regione CA uno. Per applicare l'agonista del trasmettitore, riempire la pipetta di applicazione con glutammato 0,5 millimolare.

Collegare la pipetta a un micromanipolatore e accoppiarla a un dispositivo di applicazione della pressione. Quindi, abbassare la pipetta di applicazione nel tessuto e posizionarla con cura in prossimità della punta del microelettrodo iono-selettivo. Avviare l'applicazione della pressione a 40 millibar.

Qui è mostrata la variazione di tensione dei cilindri di riferimento di un elettrodo a doppio cilindro e di un elettrodo concentrico in risposta alle variazioni della concentrazione di sodio nel bagno. E queste sono le variazioni della tensione del potenziale di sodio di un elettrodo a doppio cilindro e di un elettrodo concentrico in risposta alle variazioni della concentrazione di sodio nel bagno. Questa figura mostra il grafico semilogaritmico della concentrazione di sodio in bagno rispetto alla tensione del potenziale di sodio di entrambi gli elettrodi.

I grafici lineari rivelano una pendenza di circa 48 millivolt per entrambi gli elettrodi. Ecco la risposta di un elettrodo a doppia canna e di un elettrodo concentrico ad un rapido cambio nel bagno. Concentrazione di sodio da 152 millimolari a 70 millimolari.

Si noti che il tempo di risposta dell'elettrodo concentrico è significativamente più veloce. Questa figura mostra il transitorio extracellulare di sodio rilevato da elettrodi a doppio cilindro e concentrici, le variazioni transitorie della tensione dei cilindri di riferimento e la concentrazione extracellulare di sodio sono state indotte dalla perfusione a bagno con 10 millimolari di aspartato per 120 secondi come indicato dalla barra. E in questa figura cambiamenti transitori nella tensione dei cilindri di riferimento e nella concentrazione extracellulare di sodio sono stati indotti dall'applicazione di pressione locale con 10 millimolari di glutammato per 0,2 secondi.

Si noti che il tempo di risposta dell'elettrodo conico è significativamente più veloce in questa condizione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente che una corretta silenziosità è il passaggio chiave per il successo della produzione di micro elettrodi elettivi in ferro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e utilizzare questi elettrodi per la rilevazione del ferro extracellulare, transitorio nel tessuto cerebrale.