Microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare Ion Segnali in tessuto cerebrale

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare e analizzare la dinamica ionica nello spazio extracellulare del tessuto cerebrale. La misurazione dei transitori ionici viene effettuata utilizzando microelettrodi selettivi per ioni, che possono essere preparati secondo una configurazione a doppio canale o concentrica. Come primo passo, i microelettrodi vengono calibrati nel bagno sperimentale.

Successivamente, gli elettrodi vengono inseriti in fette acute dell'ippocampo di topo per la registrazione, al fine di evocare spostamenti ionici extracellulari; viene fornito il neurotrasmettitore glutammato oppure un agonista del glutammato. Il glutammato si lega e apre i recettori ionotropici sulle spine postsinaptiche, permettendo l'ingresso di sodio e l'uscita di potassio dalle cellule. In definitiva, ciò determina una diminuzione del sodio extracellulare e un aumento del potassio extracellulare, che vengono rilevati dagli elettrodi micro selettivi per ioni.

Questo metodo viene utilizzato per studiare la regolazione ionica extracellulare e le transizioni di ferro indotte dall'attività nel cervello. Descriviamo qui la preparazione e la calibrazione di due tipi di microelettrodi selettivi per ioni. Mostriamo come questi possano essere utilizzati in fette di tessuto cerebrale acuto per misurare le variazioni di potassio o sodio extracellulare in risposta all'applicazione di neurotrasmettitori.

La procedura sarà dimostrata da Nicole Hark e Simon per il mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare una capillare in vetro borosilicato con filamento da utilizzare per il barile sensibile agli ioni e un'altra per il successivo barile di riferimento. Successivamente, utilizzare una colla bicomponente o una piccola striscia di foglio di alluminio per fissare insieme le capillari lunga e corta alle due estremità.

Riscaldare la capillare doppia in un forno a 60 gradi Celsius per un'ora per rimuovere l'umidità residua. Successivamente, conservare le elettrodi in un essiccatore fino all'uso. Centrare la capillare doppia in un estrattore verticale con una stecca di gesso. Utilizzare una stecca di gesso per prevenire l'allungamento della capillare.

Mantenere delicatamente la bobina finché il vetro non diventa abbastanza morbido da permettere una rotazione orizzontale del revolver. Dopo il raffreddamento, ruotare di 180 gradi e rimuovere l'elemento di rottura meccanico. Applicare un secondo protocollo di riscaldamento per tirare il capillare, ottenendo due capillari doppi affusolati.

Il diametro della punta della capillare doppia deve essere vicino a un micron. Riempire ora il barile di riferimento fino alla sua punta con acqua distillata per prevenire la colonizzazione. Nella procedura seguente, posizionare una capillare a doppio barile con la punta rivolta verso l'alto su un supporto appositamente realizzato.

Quindi posizionare questo supporto sulla bottiglia a bocca larga contenente l'HMDS pre-riscaldato e incubare per 70 minuti. Successivamente, trasferire la capillare su un supporto metallico. In seguito, collocarla nel forno preriscaldato per due ore al fine di asciugare entrambi i compartimenti dopo la colonizzazione; mantenere la capillare asciutta nel desiccante fino all'uso.

Nel giorno dell'esperimento, preparare l'elettrodo selettivo per ioni riempiendo la punta del barile silanizzato con due o tre microlitri del sensore selettivo per ioni. Successivamente, riempire il barile con cloruro di sodio 100 millimolare per un microelettrodo sensibile al sodio o con soluzione salina di cloruro di potassio 100 millimolare per un microelettrodo sensibile al potassio. Prestare attenzione a non introdurre bolle d'aria aggiuntive durante questa procedura.

Se la silanizzazione ha successo e il sensore è stato riempito correttamente, la superficie del sensore dovrebbe apparire come una superficie concava chiaramente visibile rispetto al materiale di riempimento posteriore. Successivamente, riempire il canale di riferimento, quindi inserire i fili di argento clorurato in entrambi i barilotti e sigillare ciascun barilotto con cera dentale. In questa procedura, tirare un capillare di due millimetri nel tiratore orizzontale in modo da ottenere una conicità breve e un diametro della punta di quattro micron.

Immediatamente prima dell'uso, riempire il capillare silanizzato con 0,2 microlitri di sensore. Per preparare il capillare interno, tirare un capillare di piccolo diametro in modo da ottenere due capillari con coni allungati e punte affilate. Quindi riempirli con soluzione salina di cloruro di sodio 100 millimolare o cloruro di potassio 100 millimolare.

Posizionare i capillari riempiti con il sensore e quelli riempiti con soluzione salina direttamente in linea tra loro su un tappo appositamente realizzato con coprioggetti. Inserire parzialmente il capillare più piccolo all'interno del capillare più grande. Successivamente, fissare i capillari su un altro coprioggetto.

Utilizzando argilla da modellare, trasferire i capillari sul piano di un microscopio e osservarli con un'ingrandimento di 100x. Con l'aiuto di un'asta di vetro montata su un micromanipolatore, avanzare lentamente il capillare esterno sopra il capillare interno finché la distanza tra le loro punte è approssimativamente di cinque micron. Fissare l'estremità aperta del capillare esterno al capillare interno utilizzando cera da dentista e inserire un filo di argento.

Per preparare l'elettrodo di riferimento, tirare una capillare con filamento in un tiratore verticale, scartare la pipetta superiore, quindi aprire la morsa inferiore e sollevare la pipetta inferiore di circa cinque millimetri. Chiudere nuovamente la morsa e sollevarla fino a quando la punta dell'elettrodo inferiore si trova posizionata a circa cinque millimetri sopra la bobina riscaldante. Successivamente, riscaldare la bobina e utilizzare una pinzetta per piegare la punta di circa 45 gradi lateralmente.

Piegare nuovamente di circa meno 45 gradi per riportare la punta in parallelo con l'asta principale. Quindi riempire il barile di riferimento con abbondante soluzione salina tamponata. Inserire un filo di argento clorurato e sigillare il barile con cera da dentista.

In questo passaggio, collegare entrambi gli elettrodi sensibili agli ioni e di riferimento ai micromanipolatori e abbassarli in una camera sperimentale perfusa con A CSF. Sotto il microscopio stereoscopico, collegare i fili di argento clorurato agli ingressi corrispondenti della testa dell'amplificatore differenziale. Quindi determinare le resistenze degli elettrodi.

Successivamente, regolare i segnali di tensione a zero e iniziare la registrazione per la calibrazione. Dopo aver ottenuto una baseline stabile, passare alla soluzione salina contenente concentrazioni definite dell'ione da misurare. Ora, trasferire una sezione di ippocampo spessa 250 micron nella camera sperimentale e fissarla con una griglia.

Abbassare l'elettrodo microelettrico selettivo per ioni calibrato sulla superficie della sezione. Successivamente, abbassare ulteriormente l'elettrodo di circa 50 micron nello strato radiatum della regione CA1. Per applicare l'agonista del trasmettitore, riempire la pipetta di applicazione con 0,5 millimoli di glutammato.

Collegare la pipetta a un micro manipolatore e connetterla a un dispositivo di applicazione della pressione. Successivamente, abbassare la pipetta nell'organo e posizionarla con attenzione in prossimità della punta dell'elettrodo microscopico selettivo agli ioni. Iniziare l'applicazione della pressione a 40 millibar.

Qui viene mostrata la variazione di tensione dei barili di riferimento di un elettrodo a doppio barile e di un elettrodo concentrico in risposta alle variazioni della concentrazione di sodio nella soluzione. E queste sono le variazioni della tensione del potenziale di sodio di un elettrodo a doppio barile e di un elettrodo concentrico in risposta alle variazioni della concentrazione di sodio nella soluzione. Questa figura mostra il grafico semilogaritmico della concentrazione di sodio nella soluzione in funzione della tensione del potenziale di sodio di entrambi gli elettrodi.

I grafici lineari mostrano una pendenza di circa 48 millivolt per entrambi gli elettrodi. Qui è riportata la risposta di un elettrodo a doppio canale e di uno concentrico a un rapido cambiamento nella soluzione. Concentrazione di sodio da 152 millimolare a 70 millimolare.

Si noti che il tempo di risposta dell'elettrodo concentrico è significativamente più rapido. Questa figura mostra il transitorio di sodio extracellulare rilevato da elettrodi doppi canali ed elettrodi concentrici; le variazioni transitorie della tensione nei canali di riferimento e la concentrazione extracellulare di sodio sono state indotte da perfusione del bagno con 10 millimolare di aspartato per 120 secondi, come indicato dalla barra. In questa figura, le variazioni transitorie della tensione nei canali di riferimento e della concentrazione di sodio extracellulare sono state indotte da applicazione locale sotto pressione di 10 millimolare di glutammato per 0,2 secondi.

Si noti che il tempo di risposta dell'elettrodo conico è significativamente più rapido in queste condizioni. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante tenere presente che un corretto isolamento è il passaggio chiave per la produzione con successo di microelettrodi selettivi per il ferro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare e utilizzare questi elettrodi per la rilevazione del ferro extracellulare transiente nel tessuto cerebrale.