Generazione e analisi quantitativa della pulsato a bassa frequenza ad ultrasuoni per determinare la sensibilità di Sonic di non trattata e trattata cellule neoplastiche

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'efficacia e la riproducibilità degli ultrasuoni a impulsi e bassa frequenza nel danneggiare popolazioni di cellule leucemiche umane in assenza o in presenza di un agente depletore del colesterolo. Questo viene ottenuto pulendo il sistema di sonicazione e valutandone la stabilità. Le cellule leucemiche umane vengono quindi sottoposte a sonicazione in assenza e in presenza di metil-beta-ciclodestrina.

In seguito, i contatori automatici di cellule vengono utilizzati per valutare la vitalità cellulare e gli effetti della sonificazione e della deplezione del colesterolo. L'attività mitocondriale delle cellule leucemiche viene valutata mediante saggio XTT. Alla fine, i dati suggeriscono che gli ultrasuoni a bassa frequenza possono essere utilizzati per danneggiare le cellule maligne, effetto che viene potenziato dall'uso di un agente depletivo del colesterolo.

Il nostro laboratorio si interessa della terapia sonar namp, una nuova modalità terapeutica che combina gli effetti anti-neoplastici degli ultrasuoni con agenti specializzati per amplificare gli effetti del suono. Il nostro protocollo valuta la sensibilità sonica di cellule neoplastiche e normali al fine di determinare possibili approcci anochemioterapici che meritano ulteriori indagini precliniche. Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo possono incontrare difficoltà con l'apparecchiatura utilizzata per valutare la stabilità del sistema so, poiché può richiedere del tempo imparare a utilizzare in modo ottimale tali dispositivi.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le procedure di pulizia e stabilizzazione utilizzate per valutare il sistema di sonificazione sono essenziali per ottenere risultati riproducibili. Prima di iniziare un esperimento, utilizzare il cloroformio e un bastoncino di cotone per pulire il collegamento tra il corno e il convertitore. Successivamente, applicare un leggero strato di olio sui filetti del corno e del convertitore.

Per rimuovere ulteriori trucioli metallici, ruggine o accumuli di ossidazione, quindi eliminare l'olio e qualsiasi altro contaminante dal raccordo con altro cloroformio e riattaccare il cornetto al convertitore. Per serrare correttamente il sistema, estrarre il cornetto dalla parte inferiore del bicchiere e inserire una chiave a forchetta all'interno di uno dei tre piccoli fori vicino alla sommità del convertitore. Posizionare ora un dinamometro munito di un'estremità piatta da mezzo pollice sulla parte scanalata del cornetto e stringere nel senso orario standard fino a quando il misuratore di coppia indica 39,99 libbre-piede.

Dopo aver serrato, reinserire il convertitore e il corno nella coppa e montare le parti su un supporto ad anelli in posizione verticale; ricollegare il convertitore all'alimentazione e impostare il sistema per dosaggio a impulsi. Utilizzare un secondo di sonificazione con un secondo di intervallo tra gli impulsi, quindi regolare il sistema alle ampiezze desiderate per valutare l'intensità e il funzionamento del sistema sauna Fire. Iniziare tenendo il misuratore di cavitazione a 1,5 centimetri, avendo cura che non siano presenti bolle sulla superficie della sonda del misuratore.

Leggere lo schermo del misuratore di cavitazione per verificare che il sistema stia funzionando all'intensità appropriata. Successivamente, immergere completamente il sensore dell'idrofono in una provetta contenente 12,5 millilitri di acqua e utilizzare il supporto ad anelli per sostenere l'idrofono. Per confermare la stabilità delle caratteristiche dell'onda, collegare l'idrofono all'ingresso dell'oscilloscopio e verificare la presenza di un'onda sinusoidale chiara, poiché onde anomale possono alterare la frequenza del sistema.

Per preparare le cellule per la sonica, innanzitutto seminale a una concentrazione di quattro volte 10 alla quarta cellule per millilitro in un’area di 25 centimetri quadrati utilizzando mezzo appena preparato. Dopo aver determinato il numero di cellule vitali mediante esclusione al triam blu, incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando la coltura avrà raggiunto la concentrazione desiderata. Quando le cellule sono pronte per la sonica, utilizzare un vuoto e un pallone di Buchner per disgasare un volume di acqua deionizzata e distillata.

Quindi utilizzare l'acqua per riempire il corno della coppa fino a 15 millimetri sopra la sommità del corno. Far funzionare il sistema con l'acqua disgassata per circa sette minuti. Successivamente, trasferire tre millilitri di cellule in un vial di vetro da 20 millilitri per scintillazione e fissare il vial al dispositivo di ritenzione.

Successivamente, fissare il dispositivo di ritenzione sulla parte superiore del corno della coppa e utilizzare il meccanismo scorrevole per posizionare il dispositivo di ritenzione a un'altezza di 15 millimetri rispetto alla sommità del corno, al livello della superficie dell'acqua. Ora sottoporre le cellule a sonificazione mediante tre impulsi di ultrasuoni di un secondo ciascuno, intervallati da un secondo di pausa, con un'ampiezza del 33 e del 50%, quindi valutare la vitalità cellulare dopo la sonificazione mediante esclusione del blu di triam. Per valutare il danno cellulare, risciacquare l'apertura di un analizzatore di particelle Z due almeno due volte con soluzione salina isotonica.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di cellule sonicate in 20 millilitri di soluzione salina isotonica e trasferire il campione cellulare nel portacampioni del contatore. Quindi sollevare la piattaforma fino all'apertura e analizzare il danno cellulare, la vitalità e i detriti secondo le istruzioni del produttore. Per valutare la vitalità delle cellule sonicate mediante saggio XTT, sottoporre le cellule a sonica in un intervallo compreso tra uno e tre.

Pulsi di un secondo distanziati di un secondo per indurre un range di danno da valutare con il kit XTT, quindi centrifugare le cellule e risospendere i pellet a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro in mezzo di crescita appena preparato. Successivamente, seminare 100 microlitri di cellule per pozzetto in piastre microtitolazione flat-bottom da 96 pozzetti, in triplicato, inclusi tre pozzetti controllo contenenti 100 microlitri di mezzo di crescita completo senza cellule per le letture di assorbanza di bianco.

Incubare le cellule per 24 ore al mattino del giorno del saggio; agitare delicatamente aliquote di reagente XTT e reagente di attivazione riscaldati a 37 gradi Celsius finché le soluzioni non diventano limpide. Aggiungere quindi 0,1 millilitri del reagente di attivazione a cinque millilitri di reagente XTT Eloqua. Successivamente, aggiungere 50 microlitri della soluzione XTT attivata in ciascun pozzetto delle piastre inoculate con U 9 37 e THP-1 e reinserire le cellule nell'incubatore per colture cellulari.

Dopo due ore, agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente il colorante arancione nei pozzetti positivi e misurare l'assorbanza con un lettore per piastre microtitolazione tra 450 e 500 nanometri. Infine, misurare nuovamente l'assorbanza di tutti i pozzetti del saggio tra 630 e 690 nanometri. Come previsto, si osserva un danno cellulare più esteso nella popolazione cellulare sottoposta a sonica al 50% rispetto al 33% di ampiezza.

L'ampiezza al 33%, tuttavia, consente la rilevazione di ulteriori danni quando vengono applicati agenti. Come in questo esperimento, in cui gli effetti dose-dipendenti dell'agente depleto di colesterolo metil beta ciclodestrina sulla potenziazione della sensibilità ultrasonica delle cellule U 937 sono stati valutati.

Sebbene le cellule trattate con metil beta ciclodestrina nons mostrassero una vitalità simile a quella delle cellule nons non trattate, la vitalità è notevolmente diminuita dopo tre impulsi di ultrasuoni di un secondo a 40 kilohertz. Inoltre, la riduzione della vitalità dopo la sonicazione sembra essere stata dipendente dalla dose, poiché cinque millimolari dell'agente depleto di colesterolo hanno prodotto la maggiore diminuzione del numero cellulare, seguiti dai trattamenti con metil beta ciclodestrina a uno millimolare e a 0,5 millimolare, come valutato mediante saggio XTT. Sebbene le cellule THP-1 apparissero leggermente più resistenti alla sonicazione rispetto alle cellule U-937, entrambe le linee cellulari di leucemia umana sono state danneggiate in maniera dipendente dalla dose.

Inoltre, l'accoppiamento di concentrazioni più elevate di metil beta ciclodestrina con un numero maggiore di impulsi ultrasonici ha prodotto la riduzione più bassa del XTT in un derivato solubile di colore arancione brillante sia per le cellule U 9 37 che per le cellule THP-1, corrispondente a una minore vitalità cellulare e attività mitocondriale per entrambe le linee cellulari. Seguendo questa procedura, altri agenti sensibilizzanti agli ultrasuoni, come agenti diretti sul citoscheletro o produttori di specie reattive, possono essere valutati per la loro capacità di potenziare la sensibilità sonica, stabilendo così nuovi approcci terapeutici che possono essere indagati per la loro efficacia pleoclinica. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di organizzare adeguatamente i dati SON acquisiti dai contatori TC e Z2 poiché forniscono informazioni dettagliate sull'efficacia del protocollo di trattamento che potrebbero andare perdute.

Se non viene utilizzato alcun schema logistico, dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare gli ultrasuoni a bassa frequenza in combinazione con potenziali sensibilizzatori ano in modelli preclinici in vitro per valutare la loro potenziale utilità terapeutica.