Tissue tritata in Compressed Collagene: A Biotransplant cellulare contenente per la riparazione singolo-messa in scena Ricostruttiva

L'obiettivo generale della seguente procedura è trapiantare tessuto autologo al fine della sua espansione durante un intervento chirurgico ricostruttivo. Questo viene realizzato innanzitutto prelevando una biopsia dal tessuto di interesse. Successivamente, la biopsia viene tritata e viene costruito un autoinnesto in policaprolattone compresso plastico, o PCL, e collagene.

Il PCL e i tessuti autologhi tritati vengono quindi integrati per creare lo scaffold 3D. Abbiamo utilizzato un tasso di espansione da uno a sei. Successivamente, lo scaffold viene trapiantato nuovamente nel soggetto.

In definitiva, la rigenerazione del tessuto autotrapiantato può essere valutata mediante analisi immunohistochimica della proliferazione e della riorganizzazione delle cellule all'interno degli scaffold e delle particelle di tessuto tritato. Questo metodo verrà dimostrato in un modello animale, su cute e su urotelio. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento di tessuti gravemente malformati o dopo traumi in casi in cui vi sia una grave carenza di tessuto per la riparazione chirurgica.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la coltura in vitro, è che questo metodo può essere eseguito come procedura chirurgica in un unico stadio. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi dal prelievo del tessuto fino al trapianto devono essere effettuati in condizioni sterili. Per ottenere un campione di biopsia della vescica di suino, innanzitutto afferrare la vescica con la pinza e utilizzare un nastro metrico sterilizzato per determinare le dimensioni del tessuto.

Successivamente, utilizzare una penna sterilizzata per delimitare una biopsia di forma ellittica di due per un centimetro, mirando a un rapporto di espansione da uno a sei. Quindi, escindere il tessuto marcato con un bisturi e posizionare il campione di biopsia della vescica in DMEM in condizioni sterili. Per prelevare un campione di biopsia cutanea, utilizzare un dermatomo per ottenere un campione parzialmente spesso di 0,3 millimetri.

Quindi, posizionare il tessuto in DMEM e coprire l'area della ferita con una medicazione. Successivamente, lavare la biopsia della vescica due volte in DMEM e trasferire il tessuto su una piastra di dissezione sterilizzata, con la mucosa rivolta verso l'alto. Utilizzando perni da dissezione, fissare un lato del campione alla piastra e usare forbici fini e pinzette per separare il tessuto mucoso dal muscolo detrusore.

Quindi, posizionare un dispositivo per il tritamento sulla mucosa e passarlo verticalmente e orizzontalmente da un'estremità del tessuto all'altra per ottenere pezzi tritati di dimensioni pari a 0,8 per 0,8 millimetri. Si noti che il dispositivo per il tritamento deve essere premuto sul tessuto mentre lo si muove sopra di esso. Per preparare un innesto autologo di collagene compresso in plastica, aggiungere innanzitutto una goccia di idrossido di sodio normale, goccia a goccia, in DMEM 10X integrato con collagene di tipo I fino a quando il mezzo non passa dal giallo intenso al rosa.

Dopo aver verificato un pH compreso tra 7,4 e 8, mescolare attentamente due millilitri di DMEM nella soluzione. Successivamente, versare circa due millilitri di collagene in una cavità di uno stampo rettangolare in acciaio di dimensioni 20x30x10 millimetri e incubare il collagene per dieci minuti. Una volta che il collagene si è solidificato, aggiungere il volume appropriato di biomateriale PCL sulla superficie del collagene gelificato e versare i rimanenti sei millilitri di collagene sopra il PCL.

Rimettere lo stampo nell'incubatrice per altri 20 minuti. Successivamente, impilare uno strato spesso di garze su una superficie sterile. Poi, posizionare una maglia in acciaio inossidabile dello spessore di 400 micron sopra la garza, seguita da un foglio in maglia di nylon dello spessore di 110 micron.

Trasferire delicatamente il gel di collagene sulla maglia di nylon e rimuovere con attenzione lo stampo di acciaio rettangolare. Trasferire il tessuto tritato sul collagene. In questo caso, si mira a un tasso di espansione da uno a sei.

Quindi, posizionare un nuovo strato di rete in nylon sopra il gel di collagene e il tessuto, quindi collocare una seconda rete in acciaio sopra la rete in nylon, seguita da una piastra di carico dal peso minimo di 120 grammi. Dopo cinque minuti, rimuovere il peso, le reti in acciaio e il nylon dall'autotrapianto. Per la coltura in vitro dell'autotrapianto, tagliare innanzitutto la costruzione sottile in pezzi abbastanza piccoli da poter essere inseriti in piastre a 12 pozzetti.

Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo per cheratinociti in ogni pozzetto e coltivare i tessuti per tre-sei settimane. Per trapiantare un autotrapianto con mucosa vescicale tritata in una vescica di suino, inumidire l'innesto con DMEM. Successivamente, innestare la costruzione nel tessuto sano mediante suture continue monofilamento sottili.

Verificare che l'innesto sia impermeabile riempiendo la vescica con soluzione salina attraverso il catetere urinario a permanenza. Per trapiantare un innesto autologo con epidermide cutanea tritata in una ferita a tutto spessore, inumidire l'innesto con DMEM. Successivamente, utilizzando punti di sutura interrotti agli angoli e al centro dell'innesto autologo, fissare la costruzione alla base della ferita cutanea a tutto spessore.

Infine, coprire la ferita con una medicazione in plastica per mantenerla umida. Come osservato in questa immagine di un autotrapianto di pelle tritata, il biotrapianto composito può resistere a trazione, sutura e manipolazione chirurgica. L'immunohistochimica eseguita in diversi momenti durante la coltura in vitro rivela che le cellule proliferano, migrano e si riorganizzano in un epitelio continuo con una microarchitettura tipica del fenotipo cellulare.

Ad esempio, dopo due settimane, lo strato cellulare sulla superficie dell'autotrapianto cutaneo è spesso circa due strati. A destra, l'epitelio della vescica è spesso circa otto strati dopo lo stesso periodo di coltura. Dopo cinque-sei settimane, l'epitelio continuo è spesso circa otto-dieci strati cellulari sia negli autotrapianti di epitelio cutaneo tritato che nella mucosa vescicale tritata.

Rispetto all'espansione dei tessuti in vitro, questo metodo è rapido, richiede meno manodopera e non necessita di risorse di laboratorio sofisticate. Inoltre, tutte le componenti sono approvate dalla FDA, consentendone l'uso in un normale contesto chirurgico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare il gel, i biotransplantati e i tessuti autologhi in condizioni sterili.

Seguendo questa procedura e altri metodi come la coltura in vitro delle cellule, è possibile affrontare ulteriori domande riguardo alla proliferazione e differenziazione cellulare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrebbe aprire la strada a ricercatori nel campo della medicina rigenerativa. In questo modo, potremmo trattare malformazioni gravi della pelle o del sistema urinario con trapianti ingegnerizzati di tessuto autologo.