Name: Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Impara a registrare l'attività elettrofisiologica del ritmo respiratorio su preparati isolati di tronco encefalico e midollo spinale di roditore neonato. Questa tecnica consente studi farmacologici e valutazioni di stimoli respiratori.

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Gli autori ringraziano sinceramente il Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 e la Star Foundation for Children's Health Research, insieme alla Molly Towell Foundation, per la fornitura della struttura di ricerca e il sostegno finanziario. Gli autori ringraziano sinceramente anche il Dr. Kinkead Richard per la correzione di bozze e i consigli del manoscritto.

Questo metodo richiede l&#39;utilizzo di soggetti animali, consentite dalla Laval University comitato etico degli animali (protocollo # 2012-170). 1. Impostazione e preparazione <ol><li> Soluzioni <ol><li> Preparare soluzioni aCSF secondo le seguenti ricette 7,17. Altre ricette con variazioni di concentrazione sono disponibili in letteratura. Soluzioni memoria Stock a 4 ° C per un massimo di un mese. <ol><li> Soluzione salina: aggiungere 75,39 g di NaCl (129 mm finale); 2,5 g di KCl (3,35 mM finale); 0,81 g di NaH2PO4 (0,58 mM finale); 2,33 g di MgCl2 (1,15 mM finale); 1,85 g di CaCl2 (1,26 mM). Sciogliere in 800 ml di acqua distillata poi riempire a 1 L con acqua distillata. </li><li> Soluzione di bicarbonato: aggiungere 17,65 g di NaHCO 3 (21 mm finale). Sciogliere in 900 ml di acqua distillata poi riempire a 1 L con acqua distillata. Variazioni della concentrazione di bicarbonato provocheranno variazioni di pH. </li><li> Soluzione di glucosio: aggiungi 54.06g di glucosio (30 mM finale). Sciogliere in 400 ml di acqua distillata poi riempire a 500 ml con acqua distillata. </li></ol></li><li> Preparare aCSF diluendo 100 ml di soluzione salina, 100 ml di soluzione di bicarbonato, e 50 ml di soluzione di glucosio in 1 L di acqua distillata. Conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare un elettrodo di vetro riscaldando e si estende un tubo di vetro fino a rompersi. Sand giù la punta prima dell&#39;uso. L&#39;elettrodo può essere riutilizzato molte volte finché rimane pulito. </li></ol></li><li> Setup sperimentale Nota: I dati di set-up sono presentati nella figura 2. <ol><li> Accendere l&#39;amplificatore, averager, sistema di acquisizione dati, controllo della temperatura e della pompa in movimento. Controllare l&#39;amplificazione del segnale (guadagno = 10.000), la filtrazione (soglia bassa, 10 Hz; soglia alta, 5 kHz), e la frequenza di campionamento della conversione da analogico a digitale del segnale grezzo (2,5 kHz). </li><li> Riempire una bottiglia con aCSF e bolla con CarboGen (95% O 2 </sub&gt;, 5% di CO 2). Inducono una bubbled- e riscaldato aCSF flusso nella camera di registrazione (volume 5 ml) a 4 ml / min. Mantenere la temperatura nella camera di registrazione a 26 (± 1) ° C. pH deve essere 7,4 in queste condizioni standard. </li><li> Conservare 50 ml di RT e CarboGen-bolle aCSF in una siringa da 50 ml in prossimità della camera di dissezione. </li><li> Accendere il computer e avviare il software di registrazione. </li></ol></li></ol> 2. Dissection <ol><li> Pesare e determinare visivamente il sesso dell&#39;animale (i maschi hanno un ano-genitale distanza più lunga, mentre le femmine hanno un breve tratto ano-genitale, i maschi genitali sono spesso oscuro mentre genitali femminili sono di colore rosa). </li><li> Anestetizzare i roditori neonati da una delle seguenti opzioni: cryoanesthesia (immergere completamente l&#39;animale in ghiaccio per 4 - 5 min 18), iniezione (equitensine a 4 ml / kg) 19 o inalazione di anestetici volatili (isoflurano 20 o etere 21). Confirm un piano adeguata di anestetici dall&#39;assenza di un ritiro riflesso zampa. </li><li> Posto l&#39;animale in panchina, faccia ventrale giù. Sezione della parte rostrale della testa coronale con un bisturi a livello di bregma (visibile attraverso la pelle e il cranio). Eseguire questo passaggio subito dopo che l&#39;animale è anestetizzato. </li><li> Sezione coronale il corpo con un bisturi sotto i membri anteriori. </li><li> Togliere la pelle, i muscoli, tessuti grassi e viscere con le forbici chirurgiche e sottili e pinze. Dal momento che le ossa sono morbidi a questa età, essere prudenti per non danneggiare il sistema nervoso. Eseguire questo passaggio in panchina. </li><li> Posizionare la preparazione nella camera dissezione. Utilizzare il aCSF memorizzato nella siringa per ossigenare preparazione. Da questo punto alla fine della registrazione, utilizzare un microscopio. </li><li> Sulla faccia dorsale del preparato, tagliare il cranio e vertebre dal rostrale alla parte caudale lungo l&#39;asse medio con forbici chirurgiche e sottili e pinze. Aprire il cranio taglioe vertebre, al fine di esporre il tessuto nervoso. Utilizzare il aCSF strored nella siringa per ossigenare la preparazione. </li><li> Con le pinze, rimuovere la membrana aracnoidea, un sottile tessuto che ricopre la superficie del tessuto nervoso. Conservare la pia madre e vasi sanguigni contro il tessuto nervoso. Utilizzare il aCSF memorizzato nella siringa per ossigenare preparazione. </li><li> Posizionare la preparazione con il dorso rivolto verso il basso, e con attenzione abbassare il tronco encefalico e del midollo spinale tagliando i nervi e tessuto connettivo con le forbici mentre si tiene la preparazione sul posto. Un approccio dorsale è anche possibile. Mantenere le radici e nervi più a lungo possibile. Togliere le ossa per isolare il tronco encefalico e del midollo spinale. Utilizzare il aCSF memorizzato nella siringa per ossigenare preparazione. </li><li> Rimuovere il cervelletto e rimanendo strutture rostrali da loro sezionamento con il bisturi. Utilizzare il aCSF memorizzato nel ago per ossigenare preparazione. </li><li> Opzionalmente seconda sperimenprogettazione tal, rimuovere il ponte con il bisturi da una sezione anteriore coronale alla inferiore arteria cerebellare 22. Notare che mantenendo tutta ponte rallenterà il ritmo in ratti e completamente inibirla in topi. Preparazioni che includono solo la parte caudale del ponte mostrano una attività respiratoria simile con una frequenza stabile alla radice C4. </li></ol> 3. Registrazione <ol><li> Mettere il preparato in camera di registrazione, ventrale a faccia in su. Fissare la preparazione con perni nella parte più bassa del midollo spinale e rostrale-maggior parte del tronco cerebrale. </li><li> Utilizzando una siringa collegata all&#39;elettrodo dal suo ago, indurre una depressione nell&#39;elettrodo (diametro punta di vetro: 150 - 225 micron) tirando il pistone della siringa, per riempire parzialmente l&#39;elettrodo con aCSF. </li><li> Utilizzando un micromanipolatore, posizionare accuratamente l&#39;elettrodo vicino ad una delle quarte radici ventrali. Altre radici ventrali potrebbero anche presentare una delle vie respiratorie come l&#39;attività (e.g., XII nervo cranico, C1 radice ventrale). </li><li> Inducono una depressione nel serbatoio dell&#39;elettrodo tramite la siringa estraendo lo stantuffo per aspirare delicatamente il rootlet nervo. Quindi spostare accuratamente l&#39;elettrodo di applicare contro il midollo spinale. Nota: Idealmente la dimensione del rootlet corrisponde alla dimensione dell&#39;apertura elettrodo e crea una tenuta tra i compartimenti interni ed esterni dell&#39;elettrodo così. Poiché gli amplificatori differenziali sono comunemente utilizzati per tali registrazioni, ogni apertura tra l&#39;interno dell&#39;elettrodo e la camera di registrazione riduce la qualità del segnale e rende difficile per eliminare il rumore di fondo. </li><li> Avviare la registrazione. </li><li> Registra il ritmo prodotto dalla preparazione in condizioni di normossia (cioè, aCSF gorgogliare con CarboGen: 95% O 2 e 5% CO 2) per almeno 20 minuti per determinare i parametri di base della preparazione. </li><li> Passare la perfusione da CarboGen-bolle aCSF astimolo aCSF (cioè, con il 95% gorgogliare N 2 e 5% di CO 2 per ipossia stimolo) per 15 min. Alter durata dell&#39;esposizione a seconda del protocollo sperimentale. Registrare la durata dell&#39;esposizione sulla registrazione degli animali e scheda tecnica. Utilizzare tubi in acciaio inossidabile tra il flacone e la camera aCSF quando possibile per evitare la diffusione di gas verso l&#39;esterno del tubo. </li><li> Accendere la perfusione torna a aCSF CarboGen-bolle standard per almeno 15 minuti per una registrazione di recupero. Registrare questo sulla registrazione degli animali e scheda tecnica. </li><li> Terminare la registrazione. </li></ol> 4. Analisi statistica <ol><li> Dal segnale integrato, calcolare la frequenza del numero di burst per minuto (espressa in burst / min), l&#39;ampiezza come differenza tra la linea di base e il picco del burst (espressa in mV), la durata di scoppio della durata da l&#39;inizio e la fine del burst (espresso in s), l&#39;area di scoppio come l&#39;area sotto la curve del burst sul segnale integrato (espressa in mV · s) (Figura 3). </li><li> Calcolare la frequenza, ampiezza, durata scoppiare e zona scoppiare sotto normossia (baseline), ipossia (stimolo) e post-ipossia condizioni (post-stimolo) di recupero come la media degli ultimi 5 minuti delle registrazioni per ogni condizione. Non analizzare la prima porzione di ciascuna condizione perché c&#39;è un ritardo tra l&#39;accensione e perfusione aCSF omogeneizzazione nella camera di registrazione. </li><li> Express poi stimolo (cioè, ipossia) e post-stimolo (cioè, dopo ipossia) valori di recupero come percentuale dei valori di base per la registrazione corrispondente. Esprimere i risultati come media ± SD </li></ol>

<ol><li>Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+rhythm+of+breathing%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).</li>
<li>Taylor, A. C., Kollros, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+normal+development+of+Rana+pipiens+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stages in the normal development of Rana pipiens larvae.</a> Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).</li>
<li>Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+potentials+of+bulbar+respiratory+neurons+of+the+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle.</a> Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).</li>
<li>Bouverot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+breathing+in+birds+compared+with+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of breathing in birds compared with mammals.</a> Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).</li>
<li>Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+changes+in+the+isolated+brain+stem+of+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish.</a> J Physiol. 71, 121-135 (1931).</li>
<li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li>
<li>Fournier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+stress+promotes+pathological+apneas+and+sex-specific+disruption+of+respiratory+control+development+in+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat.</a> J Neurosci. 33, 563-573 (2013).</li>
<li>Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-natal+hypoxic+activity+of+the+central+respiratory+command+is+improved+in+transgenic+mice+overexpressing+Epo+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain.</a> Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).</li>
<li>Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mechanisms+of+respiratory+rhythm+generation%3A+an+approach+using+in+vitro+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation.</a> Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).</li>
<li>Onimaru, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+respiratory+center+using+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations.</a> Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).</li>
<li>Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+network+function+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats.</a> Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).</li>
<li>Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+maturation+of+the+mouse+respiratory+rhythm-generator%3A+in+vivo+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies.</a> Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).</li>
<li>Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+state-dependent+mechanisms+for+respiratory+rhythm+and+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation.</a> Prog Brain Res. , 165-201 (2007).</li>
<li>Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+respiratory+rhythm+generator+by+the+pontine+noradrenergic+A5+and+A6+groups+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).</li>
<li>Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+pons+in+hypoxic+respiratory+depression+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat.</a> Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).</li>
<li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions%3A+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li>
<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+regulation+in+the+brain%3A+implications+for+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li>
<li>Danneman, P. J., Mandrell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+agents%2Fmethods+for+anesthesia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).</li>
<li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).</li>
<li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> J App Physiol. 116, 47-53 (2014).</li>
<li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane%2C+propofol%2C+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+on+extracellular+Ca2%2B%2FK%2B+antagonism+of+inspiratory+centre+rhythms+in+slices+and+en+bloc+preparations+of+newborn+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem.</a> J Physiol. 584, 489-508 (2007).</li>
<li>Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT+acting+on+5-HT%281%2F2%29+receptors+does+not+participate+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+recordings+from+respiratory+neurons+in+the+medulla+of+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).</li>
<li>Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+of+pre-+and+post-inspiratory+neurones+during+central+apnoea+in+mature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice.</a> J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).</li>
<li>Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+NMDA+receptors+in+the+respiratory+phase+transition+is+different+in+the+adult+guinea+pig+in+vivo+and+in+the+isolated+brain+stem+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation.</a> J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).</li>
<li>Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+volatile+anesthetics+on+respiratory+activity+and+chemosensitivity+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+the+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hokkaido+Igaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat.</a> Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).</li>
<li>Gestreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Task2+potassium+channels+set+central+respiratory+CO2+and+O2+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity.</a> PNAS. 107, 2325-2330 (2010).</li>
<li>Caravagna, C., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+and+MEK+molecular+pathways+are+involved+in+the+erythropoietin-mediated+regulation+of+the+central+respiratory+command%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command.</a> Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).</li>
<li>Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anandamide+centrally+depresses+the+respiratory+rhythm+generator+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice.</a> Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).</li>
<li>Arata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+activity+of+the+neonatal+dorsolateral+pons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro.</a> Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+functional+neuron+group+for+respiratory+rhythm+generation+in+the+ventral+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla.</a> J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).</li>
<li>St-John, W. M., Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizations+of+eupnea%2C+apneusis+and+gasping+in+a+perfused+rat+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation.</a> Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse da rivelare.

Quantificazione accurata dell&#39;attività respiratoria può essere impegnativo. Infatti, la respirazione è una funzione che può essere sia automatica e volontaria, e che è modulata in base all&#39;ambiente, le esigenze del corpo, lo stato emotivo ed il comportamento. Il vantaggio di questa tecnica è l&#39;isolamento degli elementi neurali responsabili della produzione del comando respiratoria. Così, registrazioni elettrofisiologiche di preparati midollo spinale e tronco-pletismografia sono tecniche complementari per stu...

La respirazione è un complesso e vitale attività controllata dal cervello, permettendo diossigeno (O 2) e l&#39;assorbimento di anidride carbonica (CO 2) eliminazione. Il drive respiratorio centrale è generato da una complessa rete situata nel tronco cerebrale in entrambi i mammiferi 1, 2 anfibi, rettili, uccelli 3 4 5 e pesci. Anche se lo studio di respirazione può essere elaborata in vivo, precise indagini meccanicistiche richiedono l&#39;accesso diretto alla rete di controllo respiratorio. A tal fine, Adrian e Buytendijk sviluppato una ridotta preparazione pesci rossi, in cui elettrodi posti sulla superficie del tronco cerebrale record ritmo generato associato ventilazione gill 5. Questo approccio è stato in seguito adattato da Suzue nel 1984 6 per l&#39;impiego nei roditori appena nati. L&#39;avvento di questa preparazione ha portato a significativi progressi nella neurobiologia respiratoria. Poiché è relativamente semplice, la tecnica presentato here è suscettibile di una vasta gamma di ricerche di base di comportamenti motori ritmici e le loro origini nei roditori appena nati. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di registrare il correlato neurale di attività inspiratoria, un ritmo respiratorio simile chiamato respirazione fittizia, prodotta dalla rete respiratoria. Questo metodo può essere impiegato in una vasta gamma di obiettivi di ricerca, puntando risposte inspiratori alle variazioni respiratorie o farmacologia in entrambi i selvatici tipo 7 e 8 animali transgenici. Dato che gli esperimenti vengono eseguiti a bassa temperatura, senza afferenti sensoriali, e in condizioni in cui le concentrazioni di glucosio e O 2 ai aCSF sono alti, questioni sono state sollevate per quanto riguarda la rilevanza fisiologica del segnale registrato. Mentre vi sono chiare differenze tra in vivo e in vitro condizioni (ad es., La frequenza di raffiche inspiratori) resta il fatto che la presenza digli elementi fondamentali della rete respiratoria 6 permettono di studiare un ritmo robusto associato ad una funzione omeostatica vitale 9,10. La logica dietro lo sviluppo e l&#39;utilizzo di questa tecnica è quello di facilitare l&#39;accesso diretto agli elementi del tronco della rete respiratoria, che sono difficilmente accessibili in vivo, soprattutto nei neonati. Il tronco encefalico è posto in condizioni rigorosamente controllate: il ritmo registrato non è modulato da input afferenti periferici dai polmoni o gli organismi carotidei, permettendo lo studio di concentrarsi sul drive respiratorio centrale stessa 11. Così, questo accesso è utilizzato per applicare stimoli e registrare il segnale di uscita. In contrasto con pletismografia registrazioni, il ritmo respiratorio è modulata da tutti i suoi componenti in tutto il corpo (ad es., Distensione polmonare, chemosensori periferiche), rendendo difficile applicare stimoli precisi. In unratto ewborn, il protocollo consiste nel registrare il quarto segnale ventrale root su un tronco isolato e midollo spinale troncato, mantenuto in fluido cerebrospinale artificiale (aCSF). Il ritmo generato dai preparativi del midollo spinale tronco-è composto da singole raffiche lenti che sono collegati al segnale inspiratorio 9. Isolato preparativi del midollo spinale tronco-sono facilmente registrabili in ratti da post-natale giorno 0-4 (P0 - P4) 7. Questo approccio è comunemente utilizzato per valutare la risposta ipossica della rete respiratoria, e anche la risposta ai ipercapnia, acidosi o droghe. Un protocollo acuta all&#39;ipossia è presentato qui. Questa stimolazione è ottenuto dal prelievo di O 2 nel aCSF; questo approccio è comunemente utilizzato per valutare la tolleranza e la risposta agli insulti ipossici. Il protocollo induce una depressione ritmo dal primo minuto fino alla fine dell&#39;esposizione ipossia (Figura 1) 12. Questa depressione è invertitadurante la post-ipossica 12 recupero. Per quanto riguarda il disegno sperimentale, è importante notare che il ponte, si trovano nella parte rostrale del tronco cerebrale, ha un&#39;azione inibitoria sul generatore ritmo 8. Così, preparazioni di piena del tronco encefalico e del midollo spinale rostrale mostrano un ritmo inferiore. L&#39;inclusione del ponte del campione isolata per la registrazione è determinato secondo il fine dell&#39;esperimento 13; studio dell&#39;influenza pontino sulla rete midollo allungato richiederebbe registrazioni con e senza il ponte di confrontare i risultati 14. Inoltre, uno dei vantaggi di questa tecnica è la possibilità di estendere la parte rostrale della preparazione per includere mesencefalico e / o regioni diencefaliche 15,16, che consenta di valutare l&#39;effetto di queste regioni della rete respiratoria ponto-midollare.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td>Utilizzo sotto il cofano</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioshop</td><td>MAG510</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>SPM306</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Linde</td><td>343-02-0006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo di aspirazione</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>modello 573000</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore CA differenziale</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>modello 1700</td><td></td></tr><tr><td>Media mobile</td><td>CWE, Ardmore, PA, USA</td><td>modello MA-821</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td> <td>di acquisizione datiDataq Instruments, Akron, OH, USA</td><td>modello DI-720</td><td></td></tr><tr><td>Software LabChart</td><td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism sofware</td><td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera di dissezione</td><td>Scatola di plastica (ad es. scatola di Petri) farà</td><td></td><td></td></tr> Camera <tr><td>di registrazione</td><td>Base fatta</td><td></td><td></td>in casa</tr><tr><td>Kanetec</td><td>, Bensenville, IL, </td><td></td><td></td>USA</tr><tr><td>MB Micromanipolatore</td><td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>MINIPULS 3</td><td></td></tr><tr><td>Faraday Cage</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale ammassi di newborn roditore consente neural network respiratoria registrazione uscita

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Sebbene sia ben noto che l'impulso respiratorio centrale si trova nel tronco encefalico, diversi aspetti della sua funzione di base, dello sviluppo e della risposta agli stimoli rimangono da comprendere appieno. Per superare la difficoltà di accesso al tronco encefalico nell'intero animale, viene eseguito l'isolamento del tronco encefalico e di parte del midollo spinale. Questo preparato viene mantenuto nel liquido cerebro-spinale artificiale dove i gas, le concentrazioni e la temperatura sono controllati e monitorati. Il segnale di uscita dalla rete respiratoria viene registrato da un elettrodo di aspirazione posto sulla quarta radice ventrale. In questo modo, gli stimoli possono essere applicati direttamente sul tronco encefalico e l'effetto può essere registrato direttamente. Il segnale registrato è collegato al segnale inspiratorio inviato al diaframma attraverso il nervo frenico e può essere descritto come burst (circa 8 burst al minuto). L'analisi di queste esplosioni (frequenza, ampiezza, lunghezza e area sotto la curva) consente una caratterizzazione precisa dell'effetto dello stimolo sulla rete respiratoria. Il limite principale di questo metodo è la fattibilità della preparazione oltre le prime fasi post-natali. Pertanto, questo metodo si concentra molto sullo studio dell'intera rete senza gli input periferici nel ratto neonato.

Come accennato nell&#39;introduzione, uno dei vantaggi più importanti di questa tecnica è l&#39;accesso diretto al tronco cerebrale applicare vari stimoli. Come esempio, ipossia stato applicato qui. Figura 1. AB mostra una registrazione completa protocollo, con entrambe le condizioni normossia e ipossia. Figura 1.CE visualizza il ritmo registrata in condizioni di normossia (cioè, aCSF gorgogliare con 95% O 2 e 5% CO 2 a 26 ° C). Come già illustrato in ques...

L'unità respiratoria centrale si trova nel tronco encefalico. L'output motorio respiratorio spontaneo da un midollo encefalico isolato viene registrato posizionando un elettrodo sulla quarta radice ventrale. Questo approccio sperimentale è prezioso per indagini farmacologiche o per la valutazione di sfide respiratorie e manipolazioni genetiche sul comportamento motorio ritmico.

Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare il ritmo generato dai nuclei respiratori del tronco encefalico in assenza di E periferica in diverse condizioni. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il collo e la parte superiore della schiena del ratto, dove si trova il tronco encefalico. Il secondo passaggio consiste nell'isolare il sistema nervoso e rimuovere le ossa craniche e vertebrali.Successivamente, posizionare l'elettrodo sulla quarta radice ventrale e iniziare la registrazione. Alla fine, le registrazioni elettrofisiologiche sul bulbo allungato e sul midollo spinale isolati vengono utilizzate per mostrare il ritmo generato dal bulbo allungato in risposta a vari stimoli.Questo metodo può contribuire a rispondere a una domanda fondamentale nel campo della fisiologia respiratoria, ad esempio se una molecola sia coinvolta nel ritmo respiratorio. La generazione del controllo R indica quale effetto il trattamento medico esercita sul nucleo respiratorio. Iniziare questa procedura posizionando un ratto neonato anestetizzato su una piastra.Rimuovere immediatamente la parte rostrale della testa al livello del bgma, in senso coronale, utilizzando un bisturi. Successivamente, rimuovere il corpo sotto le zampe anteriori Corona. Poi, asportare i muscoli cutanei e i tessuti adiposi sovrastanti il cranio.Successivamente, rimuovere il liquido vischioso avendo cura di non danneggiare il sistema nervoso. Quindi trasferire il preparato nella camera di dissezione. Posizionare la camera di dissezione sotto il microscopio.Successivamente applicare il liquido cerebrospinale A ossigenato utilizzando una siringa per ossigenare il preparato sulla faccia dorsale. Tagliare il cranio lungo l'asse mediano ed aprirlo per esporre il tessuto nervoso. Eseguire la stessa procedura per le vertebre.Quindi applicare il liquido cerebrospinale A ossigenato per ossigenare il preparato. Successivamente, posizionare il preparato con il lato dorsale rivolto verso il basso. Isolare con attenzione l'encefalo, il tronco encefalico e il midollo spinale recidendo i nervi e i tessuti connettivi, mantenendo fermo il preparato.Quindi rimuovere il cervelletto e le restanti strutture rostrali. Applicare la soluzione A CSF ossigenata al preparato. In questa procedura, posizionare il tessuto nervoso nella camera di registrazione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Fissarlo con dei perni nella parte più bassa del midollo spinale e nella porzione più rostrale del tronco encefalico.Successivamente, rimuovere la membrana aracnoidea, che è un tessuto sottile che ricopre la superficie del tessuto nervoso. Fare attenzione a non rimuovere la pia madre e i vasi sanguigni del tessuto nervoso. Successivamente, riempire l'elettrodo con un CSF.Utilizzando un micromanipolatore, posizionare con attenzione l'elettrodo vicino alla quarta radice ventrale. Aspirare delicatamente il lembo nervoso utilizzando la siringa. Successivamente, posizionare l'elettrodo con il lembo nervoso contro il midollo spinale.Successivamente, registrare le attività elettrofisiologiche generate dal tessuto nervoso in condizioni normossiche per almeno 20 minuti. Per determinare i parametri di base del preparato, passare la soluzione di perfusione da A CSF gassata con carbogen a A CSF con stimolo di ipossia e registrare per 15 minuti. Dopodiché, riportare la soluzione di perfusione alla condizione standard con carbogen.Continuare a insufflare A CSF e registrare per almeno altri 15 minuti prima di terminare la registrazione mostrata. Qui sono riportati i segnali respiratori registrati dalla radice ventrale C4 del preparato encefalo-midollare di un ratto P4 in condizioni di normossia, ipossia e recupero post-ipossico. Questo è il segnale integrato e questo è il segnale grezzo.Ecco le registrazioni ingrandite e i singoli burst per ogni condizione dopo lo sviluppo. Questo metodo apre la strada ai ricercatori nel campo della respirazione per esplorare i gruppi neuronali e i meccanismi molecolari coinvolti nel controllo e nella generazione della respirazione nel neonato.

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Neuroscienze

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Registrazioni elettrofisiologiche di preparazioni del tronco encefalico-midollo spinale da un roditore appena nato

Un metodo chirurgico è descritto per esporre il cranio ventrale nei ratti neonati. Usando questo approccio, è possibile aprire una craniotomia per eseguire elettrofisiologia acuta e esperimenti di microscopia a due fotoni nel tronco cerebrale dei cuccioli anestetizzati.

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L&#39;induzione di uno Stato Isoelectric cervello per studiare l&#39;impatto di endogeno Synaptic attività su NEURONALE<em&gt; In Vivo</em

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In questo studio viene presentata la metodologia su come eseguire registrazioni elettrofisiologiche in vivo multi-site dal percorso iperdirezionale in anestesia uretanica.

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Questo protocollo sia visivamente comunica la preparazione del tronco cerebrale-spinale e chiarisce la preparazione di sezioni trasversali del tronco cerebrale in maniera completa e dettagliata. È stato progettato per aumentare la riproducibilità e aumentare la probabilità di ottenere fette praticabile, duraturi, ritmicamente-attivo per la registrazione di output neurali dalle regioni respiratori del tronco cerebrale.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

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Impara a registrare l'attività elettrofisiologica del ritmo respiratorio su preparati isolati di tronco encefalico e midollo spinale di roditore neonato. Questa tecnica consente studi farmacologici e valutazioni di stimoli respiratori.

Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita (Video) | JoVE Journal

Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita

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