Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

Presentiamo un protocollo sperimentale per formare un doppio strato lipidico supportato su substrati solidi senza utilizzare vescicole lipidiche. Si dimostra un metodo di uno stadio per formare un doppio strato lipidico di diossido di silicio e oro così come membrane supportate con dominio colesterolo arricchita per varie applicazioni biologiche.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare membrane supportate con il metodo del doppio strato lipidico assistito da solvente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle membrane, come la comprensione delle proprietà fondamentali dei lipidi e delle proteine di membrana, nonché per consentire applicazioni come la scoperta di farmaci e la diagnostica molecolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che in molti casi può fabbricare lipidi di supporto per strato, cosa che non è possibile con il metodo convenzionale.

La procedura è anche facile da usare e richiede una preparazione minima del campione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla nostra terapia e diagnosi perché consente di studiare importanti bersagli farmacologici come le proteine di membrana. Il metodo può essere utilizzato anche per fabbricare substrati biocompatibili per applicazioni di scienza dei materiali.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo discusso la difficoltà dei metodi convenzionali di fabbricazione delle membrane dimostrando che la procedura sarà media e SHA per gli studenti laureati graduali del nostro laboratorio. Preparare una soluzione madre lipidica di 10 milligrammi per millilitro di lipidi DOPC sciogliendo la polvere lipidica in una soluzione di isopropanolo. Quindi sciogliere la polvere lipidica DOPE marcata con rumina in una soluzione di isopropanolo per ottenere una soluzione madre lipidica di un milligrammo per millilitro.

Diluire e mescolare le soluzioni madre in isopropanolo per preparare la miscela lipidica desiderata alla concentrazione finale per la fluorescenza, la microscopia e il recupero della fluorescenza dopo esperimenti di fotosbiancamento o frap, lo 0,5% in peso di R domine marcato DOPE deve essere incluso nella miscela lipidica. Iniettare la miscela lipidica in isopropanolo nel canale microfluidico fino a riempirlo. Incubare la miscela lipidica sulla superficie del vetro per circa 10 minuti.

Lo scambio salino deve essere effettuato a una portata molto bassa, altrimenti la qualità del doppio strato sarà bassa. Sostituire gradualmente la soluzione lipidica con acqua o soluzione tampone utilizzando una pompa peristaltica a portata molto bassa. Quindi sciacquare accuratamente il canale con il tampone in eccesso per rimuovere l'isopropanolo residuo per la formazione di membrane supportate arricchite di colesterolo.

Preparare una soluzione madre contenente DOPC, colesterolo lipidico e rho domina, marcata come lipidi DOPE, sciogliendo prima le rispettive polveri in isopropanolo, quindi ripetendo lo stesso protocollo di prima per eseguire il test di fluidità della membrana. Per prima cosa immergere il bicchiere, far scivolare in una soluzione di solfato ESAL all'1% di sodio per 10 minuti. Quindi lavare accuratamente i vetrini con acqua deionizzata e risciacquare con etanolo.

Asciugare i vetrini con un leggero getto di azoto. Quindi esporre i vetrini al plasma di ossigeno per 30 secondi alla massima potenza a radiofrequenza nella camera al plasma di ossigeno. Quindi, rimuovere il rivestimento protettivo della pellicola protettiva della camera microfluidica commerciale senza fondo utilizzando una pinzetta e fissare il vetrino sul lato adesivo della camera.

Assemblare i connettori e i tubi nelle posizioni di ingresso e uscita della camera e posizionare il canale microfluidico sul tavolino del microscopio per formare un doppio strato lipidico supportato marcato in fluorescenza nel canale microfluidico come prima, utilizzando la composizione lipidica desiderata, incluso un rho domino dello 0,5% in peso, etichettato come solvente inorganico lipidico DOPE. Quindi, individua il piano a doppio strato con un obiettivo a immersione in olio 60x. Per acquisire le immagini, in primo luogo, scattare due immagini preble prima del fotosbiancamento.

Riscaldare il laser fino a quando la sua intensità non si è stabilizzata. Quindi fotosbiancare uno spot circolare largo 30 micron con un raggio laser da 532 nanometri e 100 milliwatt. Subito dopo il fotosbiancamento.

Cattura una serie di immagini ogni secondo per due minuti per seguire il recupero e l'intensità della fluorescenza nel punto di candeggina per eseguire la quantificazione del colesterolo. Innanzitutto, esporre il chip del sensore in cristallo di quarzo rivestito di biossido di silicio al plasma di ossigeno per 30 secondi alla massima potenza a radiofrequenza nella camera al plasma di ossigeno. Rimuovere il chip dalla camera e montare immediatamente il chip nella camera di misurazione, qui viene utilizzata la microbilancia in cristallo di quarzo a quattro canali Q Sense E quattro A quattro canali prima dell'esperimento.

Acquisisci la frequenza e la dissipazione della censura e dell'aria per garantire un montaggio adeguato. Per fare ciò, eseguire il programma software qof. Fare clic su acquisizione e selezionare la misurazione dell'impostazione nella nuova finestra, che appare, controllare i 3, 5, 7, 9, 11 e 13 armonici.

Quindi fare clic su Trova ed esegui. Per controllare gli spettri di risonanza, impostare la temperatura a 24 gradi Celsius. Una volta ottenuto il montaggio corretto, avviare la pompa peristaltica e la soluzione tampone di flusso nella camera di misura a una portata di 100 microlitri al minuto nel programma software, fare clic su acquisizione e selezionare riavvia misurazione per registrare la frequenza di risonanza e i segnali di dissipazione dell'energia.

Ripetere questo passaggio fino a ottenere una linea di base stabile. Per gli spostamenti di frequenza e dissipazione. Iniettare l'isopropanolo senza lipidi per 10 minuti.

Seguire con l'iniezione della miscela di lipidi e colesterolo DOPC al rapporto molare desiderato con la concentrazione lipica totale di 0,5 milligrammi per millilitro in isopropanolo per 10 minuti. Successivamente, iniettare il tampone per 20 minuti a una velocità di flusso di 100 microlitri al minuto. Quindi iniettare una soluzione di un millimolare di metil-beta ciclodestrina preparata in tampone fino a quando il segnale di frequenza raggiunge un valore stabile.

Misurare le variazioni di frequenza positive relative causate dalla fase di trattamento con metil-beta ciclodestrina e calcolare il colesterolo massivo e i lipidi DOPC come descritto nel protocollo di testo. Quindi calcola la frazione molare del colesterolo nel doppio strato lipidico supportato, tenendo conto dei pesi molecolari del lipide DOPC e del colesterolo. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa al microscopio a fluorescenza del doppio strato lipidico A-D-O-P-C contenente lo 0,5% in peso di lipidi DOPE marcati con rumina formatisi su superfici di vetro tramite il metodo SAL.

Il recupero fluorescente dopo l'esperimento di fotosbiancamento ha mostrato un recupero quasi completo della fluorescenza, indicando la fluidità laterale del doppio strato lipidico. Qui, curve QCMD rappresentative degli spostamenti di frequenza e dissipazione per la formazione a doppio strato supportata. Utilizzando il metodo SAL vengono mostrati gli spostamenti finali della frequenza di risonanza e gli spostamenti di dissipazione sono stati raggiunti, che corrispondono alla formazione di un doppio strato pialla Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare biomembrane supportate utilizzando il metodo del doppio strato lipidico assistito da solvente Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare nuove soluzioni lipidiche prima dell'esperimento e di ottimizzare il fluoruro a scambio solvente a seconda della configurazione sperimentale che segue questa procedura, altri metodi come la microscopia a forza atomica possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come la formazione di domini di membrana.