Name: Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Scopri la microscopia intravitale per studiare le interazioni leucociti-endotelio e piastrine-leucociti nelle vene mesenteriche di topi durante l'infiammazione. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale per analizzare le dinamiche cellulari in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla legge sulla protezione degli animali tedesca (TierSchG). I topi sono stati alloggiati e trattati in conformità alle buone pratiche di origine animale come definito da FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) e il corpo al benessere degli animali nazionale GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Il comitato benessere degli animali dell&#39;Università di Friburgo, così come le autorità locali (Regierungspräsidium Freiburg) ha approvato tutti gli esperimenti su animali. 1. Animal Handling, Preparazione e induzione di infiammazione <ol><li> Utilizzare 4-6 settimane di età topi maschi con una gamma di peso di 16 - 20 g. Nota: se i topi sono più vecchi o più pesante che presentano grasso eccessivo che circonda la nave, limitando l&#39;osservazione microscopica. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti e tavolo microscopio prima di un intervento chirurgico. </li><li> Iniettare 20 mg / kg LPS (lipopolisaccaride) per via intraperitoneale 4 ore prima di microscopia nel mouse vivente di indurre un inflamm battericazione. </li><li> Preriscaldare una soluzione salina allo 0,9% a bagnomaria a 37 ° C per umidificare la camera di plastica e il tessuto mesentere. </li><li> Anestetizzare il mouse con iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) subito prima della procedura di microscopia. Anestesia alternativi possono essere utilizzati, ad esempio, 2% inalazione isoflurano. Verificare il corretto anestesia dalla perdita di risposta alla stimolazione riflessa (punta o la coda pizzico di pressione costante). </li><li> Depilate l&#39;addome con un rasoio elettrico e rimuovere i capelli sciolti con una garza saturato con etanolo al 70%. </li><li> Applicare veterinario pomata sugli occhi del mouse per prevenire la secchezza, mentre sotto anestesia. </li></ol> 2. Chirurgia <ol><li> Sterilizzare l&#39;addome, utilizzando il 70% di etanolo. Questo metodo non è un metodo sterile e potrebbe essere letale alla fine dell&#39;esperimento. </li><li> Eseguire una laparotomia mediana: Aprire la pelle addominale con piccoli, pinze curve e forbicine. Identificare il epivasi gastrical e aprire il peritoneo nella regione della linea alba, per proteggere i vasi. </li><li> Applicare alcune gocce di soluzione salina preriscaldata nella cavità addominale per mantenere il tessuto umido. </li><li> Leucociti etichette e piastrine fluorescently iniettando 50 microlitri rodamina 6G (1 mg / ml) retro-orbitale come descritto prima 9,10. </li><li> Esteriorizzarmi un&#39;ansa ileumand posto in un petridish con un diametro di 10 cm e assicurarsi di mantenere il tessuto umido applicando il 37 ° C preriscaldata soluzione salina (0,9%) ogni minuto. </li></ol> 3. intravitale Microscopia <ol><li> Posizionare il mouse sotto il microscopio e portare la vena mesentere con un diametro di 200-300 micron nel centro di vista. Scegliere una nave senza un ambiente grasso visibile. </li><li> Non toccare i vasi mesentere evitando in tal modo la stimolazione dell&#39;endotelio. Maneggiare il ciclo ileo cautela. </li><li> Visualizza interazioni delle cellule endoteliali nel sanguecon un microscopio invertito o verticale e una telecamera utilizzando un software microscopio. Record di sangue interazioni delle cellule endoteliali per 1 minuto a 4 diverse vene per mouse. </li><li> Euthanize il mouse per dislocazione cervicale dopo il completamento di esperimenti di imaging. </li></ol> 4. Analisi <ol><li> Effettuare l&#39;analisi offline e accecato per tutti i parametri. Effettuare analisi utilizzando qualsiasi programma software adatto. </li><li> Confermare condizioni stabili e interindividually comparabili flusso sanguigno in alta risoluzione tempo cine-clip (frame rate massimo) incentrati sul flusso di globuli endoluminale. </li><li> Quantificare il numero di leucociti rotolamento. Perciò tracciare una linea verticale attraverso la vena e contare tutti i leucociti che attraversano questa linea in 1 min. </li><li> Determinare velocità di rotazione misurando il tempo di un singolo leucociti deve passare una distanza di 50 micron mentre stabilmente rotola su endotelio. Per questo, tracciare due linee verticali in una distanza di 50 micron tttraverso la vena. <ol><li> Misurare il tempo di leucociti rappresentante deve ottenere da una riga alla other.Calculate la velocità dei leucociti dividendo 50 micron attraverso il tempo necessario (micron / s). </li></ol></li><li> Misurare adesione dei leucociti in un campo di 0,04 mm 2. Per fare questo, disegnare un quadrato con la lunghezza del lato 200 micron nella vena. <ol><li> Contare i leucociti aderenti dell&#39;impresa, definiti come nessun movimento visibile per 30 secondi, all&#39;interno di questa piazza. </li></ol></li><li> Contare il numero di piastrine legate a uno dei leucociti quantificare le interazioni di piastrine-leucociti. </li></ol>

<ol><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Atherton, A., Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+investigations+of+the+adhesiveness+of+circulating+polymorphonuclear+leucocytes+to+blood+vessel+walls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls.</a> The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+platelet+receptor+shedding+by+tumor+necrosis+factor-alpha-converting+enzyme+%28ADAM17%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17).</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).</li>
<li>Chauhan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS13%3A+a+new+link+between+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+endoscopy%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+serotonin+promotes+the+recruitment+of+neutrophils+to+sites+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice.</a> Blood. 121, 1008-1015 (2013).</li>
<li>Herr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+fluoxetine+treatment+induces+slow+rolling+of+leukocytes+on+endothelium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice.</a> PloS one. 9, e88316(2014).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+functions+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immune functions of platelets.</a> Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).</li>
<li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+and+interaction+with+leucocytes+in+patients+with+sepsis+or+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure.</a> European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).</li>
<li>Sarma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platelet+binding+to+circulating+monocytes+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes.</a> Circulation. 105, 2166-2171 (2002).</li>
<li>Sumagin, R., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+activation+of+arterioles+and+venules+alters+distribution+and+levels+of+ICAM-1+and+affects+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui si descrive la preparazione e l&#39;esecuzione di microscopia intravitale delle vene mesentere di topi in vivo. Questo metodo ci dà l&#39;opportunità di osservare le interazioni leucociti-endotelio e piastrine-endotelio 11 direttamente nell&#39;organismo vivente. Come risposta precoce alla infiammazione dell&#39;endotelio viene attivato e interagisce con leucociti e piastrine con conseguente rotolamento, aderenza e la trasmigrazione 12. Ma leucociti interag...

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere una tecnica semplificata della microscopia intravitale delle vene mesentere in topi viventi per l&#39;osservazione diretta di interazioni leucociti-endoteliale e leucociti-piastrine in condizioni infiammatorie. Microscopia intravitale è stato sviluppato per studiare le interazioni leucociti-endotelio in vivo in condizioni infiammatorie 1,2, che non è banale, ma importante per la comprensione infiammatorio reclutamento e la funzione dei leucociti. Il metodo che descriviamo in questo protocollo è stato sviluppato sulla base di pubblicazioni precedentemente pubblicati. Simile alla visualizzazione piastrinica incorporazione in un trombo crescente 3 e parallelo a quello che è stato pubblicato in precedenza 4, un mesentere vena esteriorizzato viene esaminato al microscopio luce trasmessa. Ci sono vari altri modelli di microscopia intra-vitale, come il muscolo cremastere di ratti 5 o al fegato di topo e ratti 6. Microscopia intravitale di mesentere vena è stata sviluppata e applicata in precedenti studi da diversi gruppi. Abbiamo usato questa tecnica per osservare le differenze nel reclutamento dei leucociti tra topi wild-type e triptofano hydroxylase1 (TPH1) - / - topi, che sono carenti di serotonina non neuronale e confrontato i risultati al topo il cui serotonina piastrinica è stata farmacologicamente impoverito da a lungo termine la domanda di un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina fluoxetina 7. Abbiamo anche esaminato le interazioni leucociti-endotelio dopo il trattamento con fluoxetina acuta 8. In questo protocollo ci concentriamo sulla microscopia intravitale di vene mesentere, perché questo modello è possibile eseguire in modo rapido, e consente misure valide di interazioni leucociti-endotelio e piastrine-leucociti. Questo è molto più difficile e in microscopia intravitale di altri organi, come le ossa, fegato, pelle, o muscolo cremastere richiede tempo. La modal qui descritto è ideale per la valutazione riproducibile di interazione cellula-cellula infiammatoria dopo stimolante con uno stimolo infiammatorio, come l&#39;iniezione intraperitoneale di lipopolisaccaride.

<table><tbody><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> 989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi da Escherichia coli 055:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2637&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

interazioni intravitale microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in mesenterial vene mice

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Microscopia intravitale è un metodo che può essere utilizzato per studiare processi diversi in diverse regioni e vasi negli animali viventi. In questo protocollo, si descrive la microscopia intravitale delle vene mesentere. Questo può essere eseguito in un breve periodo di tempo con risultati riproducibili mostrano interazioni leucociti-endotelio in vivo. Descriviamo un ambiente infiammatorio dopo LPS sfida dell&#39;endotelio. Ma in questo modello si può applicare diversi tipi di patologie infiammatorie, come batteri, chimica o biologica e indagare la somministrazione di farmaci e dei loro effetti diretti sul animale vivente e il suo impatto sul reclutamento dei leucociti. Questo protocollo è stato applicato con successo per un certo numero di diversi trattamenti di topi ei loro effetti sulla risposta infiammatoria nei vasi. Qui, si descrive la visualizzazione dei leucociti e piastrine etichettando fluorescente questi con rodamina 6G. Inoltre, qualsiasi immagini specifico può essere performed utilizzando mirati molecole fluorescente.

Una panoramica dell&#39;impostazione sperimentale descritto in questo protocollo è mostrato in Figura 1. Essa mostra un mouse con un ileo-loop esteriorizzato e sue navi, che può essere osservata in microscopia intravitale. Figura 2 mostra certo grado di attivazione in animali non trattati a causa la procedura stessa. Ma non c&#39;è quasi rotolamento lento o ferma adesione dei leucociti, rispetto ai topi LPS-trattati. La figura 2 mostra anche i diversi risultati della mi...

Questa applicazione semplificata della microscopia intravitale delle vene mesenterarie nei topi può essere utilizzata in diversi modelli di infiammazione per osservare le interazioni leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le interazioni tra leucociti, cellule endoteliali e piastrine-leucociti durante l'infiammazione in vivo. Questo viene ottenuto pretrattando innanzitutto un topo con le sostanze di interesse ed etichettando le cellule del sangue; un'ansa dell'ileo e i vasi mesenterici adiacenti vengono quindi esteriorizzati, e le interazioni cellulari STO che avvengono all'interno di una vena mesenterica selezionata vengono visualizzate mediante microscopia intravitale. Infine, è possibile analizzare le interazioni tra leucociti e piastrine con le cellule endoteliali o tra loro.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'infiammazione, ad esempio quali tipi di interazioni tra leucociti ed endotelio o tra piastrine e leucociti avvengono in vivo durante diversi modelli di infiammazione o dopo diversi pre-trattamenti di interesse. Quattro ore prima dell'acquisizione intravitale, iniettare 20 milligrammi per chilogrammo di LPS IP in un topo maschio di 16-20 grammi, di età compresa tra quattro e sei settimane, per indurre una risposta infiammatoria batterica simulata. In questo momento, preriscaldare una soluzione salina

intravital-microscopy-leukocyte-endothelial-platelet-leukocyte

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Microscopia intravitale di seguire gli eventi emodinamici infiammatori e temporale e spaziale del microcircolo piale.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

In questo video, dimostriamo la visualizzazione in tempo reale delle interazioni cellula del sangue-endoteliale nelle vene mesenteriali di un modello murino iniettato per via intraperitoneale con lipopolisaccaride.

Microscopia intravitale per analizzare le interazioni tra cellule del sangue ed endoteliali in un modello murino di infiammazione

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.

Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

Questo protocollo presenta un metodo per indurre il danno da ischemia-riperfusione mesenterica e visualizzare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) nelle venule mesenteriche utilizzando la microscopia intravitale. Il flusso sanguigno nell'arteria mesenterica superiore è stato limitato per 1 ora, seguito da riperfusione, consentendo la quantificazione diretta dell'adesione leucocitaria e della NETosi.

Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale

Una tecnica per l'esecuzione di microscopia intravitale del linfonodo inguinale (LN) è delineato. Tale tecnica permette in tempo...

Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

Scopri la microscopia intravitale per studiare le interazioni leucociti-endotelio e piastrine-leucociti nelle vene mesenteriche di topi durante l'infiammazione. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale per analizzare le dinamiche cellulari in vivo.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Esplora altri video