Name: Ponteggi composto di fibre di interfacce polielettrolita per rilascio controllato di Biomolecole temporalmente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri come creare ponteggi polimerici con fibre IPC per il rilascio controllato di biomolecole nell'ingegneria tissutale. Questo metodo consente la liberazione sostenuta di fattori di crescita con controllo spaziale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale delle Ricerche Singapore amministrata da uno dei suoi Centri di Ricerca di eccellenza, l&#39;Istituto mechanobiology, Singapore. MFAC è sostenuta dall&#39;Agenzia per la Scienza, Tecnologia e Ricerca (Singapore) e l&#39;Agenzia Nazionale per la Ricerca (Francia) programma comune con il numero 1122703037. BKKT progetto è sostenuto dall&#39;Istituto mechanobiology. Ringraziamo il Sig Daniel HC Wong per il manoscritto e la signora Alba JH Neo per contribuire alla realizzazione di video di lettura a prova di.

1. Preparazione di polielettrolita Solutions <ol><li> Purificare chitosano, come dettagliato in Liao et al. Brevemente, creare un 1% (w / v) di chitosano a 2% (v / v) di acido acetico e filtro di vuoto usando grade 93 carta da filtro. Neutralizzare il filtrato utilizzando 5M NaOH fino a pH stabilizzato per 7. Centrifugare chitosano precipitato a 1.200 xg per 10 min. Decantare il surnatante e aggiungere acqua deionizzata per lavare il chitosano. Ripetere la fase di centrifugazione e lavaggio altre due volte. Congelare il chitosano precipitato a -80 ° C e lyophilize O / N avere la forma purificata. Conservare chitosano purificato in un armadio deumidificato. </li><li> Pesare 1 g di chitosano purificato in un piatto di coltura tissutale sterili. Posizionare il chitosano nella cultura piatto tessuti più vicino possibile alla lampada UV nella cappa di sicurezza biologica ed esporre alla luce UV per 15 min. Utilizzando pinze sterili, collocare il chitosano sterilizzato in un contenitore di vetro. Sciogliere chitosano utilizzando filtrato 0.15M acido acetico ad una concentrazione finale compresa tra 0,5% e 1% (w / v). </li><li> Pesare 0,1 g del sale sodico dell&#39;acido alginico e sciogliere in 10 ml deionizzata (DDI) di acqua distillata per ottenere una soluzione all&#39;1% (w / v). Mescolare il sale sodico dell&#39;acido alginico per almeno 2 ore sul vortex per garantire la completa dissoluzione. Filtrare la soluzione di alginato attraverso 0,2 micron filtro siringa. Conservare la soluzione di alginato a 4 ° C. </li><li> Ricostituire fattori umani ricombinanti crescita come fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) o beta - nerve growth factor (NGF), come raccomandato dal costruttore. </li></ol> 2. Disegno di fibre IPC <ol><li> Mescolare proteine, fattori di crescita o altre biomolecole in 10-20 microlitri aliquota della soluzione polielettrolita che ha una carica netta simile. Molecole biologiche con carica negativa (ad esempio albumina di siero bovino [ASC]) al netto deve essere miscelato con la soluzione di alginato. Molecole biologiche con carica positiva netta (ad esempio VEGF) devono essere mescolati consoluzione chitosano. </li><li> Inserire piccole aliquote (10-20 mL) di chitosano e alginato su una superficie piana e stabile che è coperto con parafilm. Le goccioline di chitosano e alginato devono essere posti in prossimità ma non in contatto tra loro. </li><li> Leggermente immergere ogni punta su un paio di pinze nelle chitosano e alginato goccioline. Portare le goccioline di polielettroliti insieme stringendo la pinza. Quando le goccioline entrano in contatto tra loro, tirare lentamente la pinza verticalmente verso l&#39;alto per disegnare la fibra IPC dall&#39;interfaccia delle due gocce (Figura 1A). </li><li> Posizionare accuratamente l&#39;estremità della fibra IPC disegnato sulla pinza su un collettore, ad esempio una matrice polimerica piatta apposto su un mandrino rotante (vedere la sezione 3 e 4). Ruotare il mandrino ad una velocità fissa di 10 mm / sec per permettere la formazione di uniforme e beadless fibre IPC. Aumentando la velocità di trarre le fibre IPC formeranno perline, che provocherà una raffica di rilascio incorporataterminazione fibra biochimica e prematura. 10 </li><li> Per determinare l&#39;efficienza di incorporazione, raccogliere tutte le rimanenti liquidi lasciati sul parafilm diluendo con 500 ml di 1X tampone fosfato salino (PBS). Misurare la proteina o la crescita dei contenuti fattore residuo attraverso BCA assay (per BSA), ELISA (per VEGF e NGF) o un test appropriato per rilevare biomolecola incorporato. </li></ol> 3. Realizzazione di composito Hydrogel impalcatura di Pullulan-destrano (PD) polisaccaride e Fibre IPC <ol><li> Realizzazione telaio pullulan sacrificale per la raccolta fibra IPC <ol><li> Pesare polisaccaride pullulan e mescolare con deionizzata distillata (DDI) acqua per creare un 20% (w / v) in soluzione acquosa. Mescolare la soluzione pullulan O / N per assicurare l&#39;omogeneità. </li><li> Cast 15 g di soluzione di pullulano in un 10 centimetri coltura di tessuti diametro polistirene (TCPS) piatto. Asciugare la soluzione pullulan O / N a 37 ° C. Tagliare i film pullulano in 7mm x 7 mm cornici quadrate. </li></ol></li><li> Preparazione soluzione polisaccaride pullulano destrano <ol><li> Creazione di un 30% (w / v) di polisaccaridi pullulan e destrano (rapporto 3: 1) in acqua DDI. Mescolare O / N per assicurare l&#39;omogeneità della soluzione polisaccaride. Aggiungere lentamente in bicarbonato di sodio alla soluzione di polisaccaride per ottenere una concentrazione finale del 20% (w / v). Mescolare O / N per assicurare l&#39;omogeneità della soluzione. Conservare la soluzione polisaccaride a 4 ° C. </li></ol></li><li> Raccolta fibre IPC sul telaio pullulano <ol><li> Fissare il telaio pullulan sacrificale (punto 3.1) con un coccodrillo. Stick il coccodrillo e cornice pullulan sull&#39;estremità del mandrino rotante con nastro adesivo plastificato. Ruotare il mandrino con il telaio affisso a una velocità costante di 10 mm / sec. Il telaio pullulan può essere apposto sul mandrino rotante orientamenti desiderati. </li></ol></li><li> Disegnare le fibre IPC con un paio di pinze (sezione 1) e attach fine disegnato delle fibre IPC sul telaio pullulan rotante. Disegnare le fibre IPC a velocità costante. Raggiunta l&#39;estremità terminale della fibra IPC, asciugare il costrutto O fibre-on-frame / N a RT. </li><li> Incorporare fibre IPC nel PD idrogel ponteggio </li><li> Per reticolare ogni grammo di soluzione pullulan-destrano, aggiungere 100 ml di 11% (w / v) di sodio trimetafosfato soluzione acquosa e idrossido di sodio 10M 100 microlitri. 7 Mescolare la soluzione a 60 rpm con una stirplate per 1 a 2 min. Dopo l&#39;aggiunta di trimetafosfato di sodio e idrossido di sodio, la soluzione polisaccaride sarà reticolare quasi immediatamente. Versare la soluzione polisaccaride viscosa sul costrutto fibre-on-frame da incorporare completamente le fibre IPC. Incubare le fibre pullulan-destrano-IPC combinate (PD-IPC) a 60 ° C per 30 minuti per formare un reticolato chimicamente scaffold compositi (Figura 1B). </li><li> ATTENZIONE: Eseguire il punto 3.3.2 della cappa e il corretto utilizzo equi di protezionepment come acido acetico è un corrosivo e infiammabile. </li><li> Per indurre la formazione di pori nella scaffold PD-IPC, immergere l&#39;intera impalcatura nel 20% (w / v) di acido acetico per 20 min. </li><li> Rimuovere i reagenti che non hanno reagito per lavaggio impalcature PD-IPC in 1X PBS per 5 minuti agitando a 100 rpm. Ripetere questa operazione 2 volte. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di PBS e congelare immediatamente i ponteggi PD-IPC a -80 ° CO / N. Lyophilize i ponteggi, almeno 24 ore prima dell&#39;utilizzo in qualsiasi rilascio o di bioattività dosaggi controllati. </li></ol> 4. Realizzazione di composito impalcatura di PCL e fibre IPC ATTENZIONE: diclorometano è una sostanza pericolosa. Utilizzare la cappa e dispositivi di protezione personale quando si impiega diclorometano. <ol><li> Creazione incontaminate e fantasia PDMS substrati <ol><li> Creare un polidimetilsilossano incontaminato (PDMS) substrato elastomerico con un pezzo di TCPS di dimensione desiderata mediante processo di litografia soffice. Crea pattePDMS rned substrati utilizzando metodi litografiche soft di serie di poli (metilmetacrilato) modelli con la topografia desiderata. 12 </li></ol></li><li> Realizzazione sacrificale telaio PCL per la raccolta fibra IPC <ol><li> Pesare PCL e sciogliere in diclorometano per creare un 0,9% (w / v). Per ogni 1 cm 2 superficie del substrato PDMS, goccia 500 ml di soluzione di PCL 0,9%. Consentire tutto il solvente diclorometano di evaporare completamente nella cappa. Ripetere il processo di colata 0,9% PCL per addensare il film fino allo spessore desiderato. Rimuovere la pellicola PCL essiccato dal substrato PDMS. Creare un foro nel telaio PCL utilizzando un perforatore di dimensioni adeguate. 2 </li></ol></li><li> Raccolta fibre IPC sul telaio PCL <ol><li> Fissare il telaio PCL sacrificale con foro (da 4.2.1) in un coccodrillo. Attaccare il coccodrillo sul mandrino rotante utilizzando nastro adesivo plastificato. Collegare l&#39;estremità tratto della fibra IPC sul fram PCLe prima di iniziare la rotazione ad una velocità costante di 10 mm / sec (sezione 2). Dopo la fine del IPC filatura della fibra, asciugare la fibra-on-frame costrutto O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Incorporare fibra-on-frame costrutto in fantasia substrato PCL <ol><li> Cada 500 ml di soluzione di PCL 0,9% sul substrato PDMS di creare una base PCL incontaminata o fantasia, come richiesto. Cast strati multipli di soluzione PCL 0,9% per ottenere un ponteggio con lo spessore desiderato. Consentire tutto il solvente diclorometano di evaporare completamente nella cappa. </li><li> Posizionare il costrutto fibra-on-frame (sezione 4.3.1) sulla parte superiore della base PCL. Aggiungere la soluzione PCL 0,9% sui più volte fibra-on-frame costruire per ottenere lo spessore desiderato e incorporare completamente le fibre IPC, fabbricare un ponteggio composita PCL-IPC (Figura 1C). </li></ol></li></ol> 5. Misura di emissione di agenti biologici da Composite IPC Ponteggi <ol><li> Mettere in composito PD-IPC oImpalcature PCL-IPC e stand-alone fibre IPC separatamente in una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Immergere il patibolo e stand-alone fibre IPC con 500 ml di PBS 1X. Incubare i campioni a 37 ° C. Raccogliere PBS in vari momenti (Comunicato stampa) e sostituirlo con 500 ml di PBS 1X. </li><li> Misurare la quantità di proteine ​​o di fattore di crescita nei mezzi di rilascio utilizzando un saggio BCA (BSA), ELISA (VEGF e NGF) o altri test appropriato calcolare il profilo di rilascio cumulativo per la biomolecola incorporato. </li></ol> 6. Semina di Celle compositi IPC Ponteggi testare bioattività di agenti biologici Usciti <ol><li> Sterilizzare i liofilizzati PD-IPC o PCL-IPC ponteggi compositi usando la luce UV nella cappa di sicurezza biologica per almeno 20 minuti. </li><li> Utilizzare tecniche standard di coltura cellulare per ottenere una sospensione di cellule di 2 x 10 5 cellule in 200 microlitri terreni di crescita. Seme la sospensione cellulare concentrata sulle impalcature compositi. After 20 min, top-up il volume di terreni di crescita per immergere completamente i ponteggi. </li><li> Misurare l&#39;attività delle cellule attraverso tecniche standard quali Alamar blu metabolico attività di analisi, PC12 neurite saggio escrescenza o immunofluorescenza. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Fibre IPC sono formate dall&#39;interazione di due polielettroliti carica opposta. Il processo utilizza l&#39;estrazione del complesso dall&#39;interfaccia dei polielettroliti, facilitando il processo di auto-assemblaggio di fibra formazione stabile. Il meccanismo di formazione della fibra IPC garantisce che qualsiasi biomolecola aggiunto nella polielettroliti con carica simile può essere incorporato durante il processo di complessazione. 10,11 contrario, l&#39;aggiunta di una biomolecola nel polielettrolita ...

La matrice extracellulare ha segnali biochimici e biofisici intrinseci che dirigono i comportamenti cellulari. L'imitazione di questo microambiente fisiologico tridimensionale (3D) è una strategia ampiamente esplorata per la medicina rigenerativa e le applicazioni di ingegneria tissutale. Ad esempio, sia i substrati di origine naturale che quelli sintetici sono stati modificati con segnali topografici come mezzo per imitare l'ambiente cellulare biofisico. 1 Ad esempio, gli scaffold in policaprolattone (PCL) possono essere facilmente modellati mediante colata su substrati PDMS modellati. 2 Tuttavia, la maggior parte degli scaffold sintetici non riassume adeguatamente l'ambiente biochimico controllato in vivo. La modifica del volume o della superficie dei materiali sintetici presenta solo segnali biochimici per l'adesione cellulare, ma manca ancora di regolazione temporale del rilascio biochimico. 3 Pertanto, c'è bisogno di scaffold ottimali in grado di imitare il sistema di rilascio biochimico temporalmente regolato della matrice extracellulare. 
I sistemi di consegna biochimica come le microsfere sono afflitti da problemi di perdita di bioattività e bassa efficienza di incorporazione a causa della gravità e della complessità del processo di sintesi a più fasi. 4-6 È stato dimostrato che i metodi alternativi che utilizzano un metodo di fabbricazione e incorporazione in un'unica fase hanno un eccellente potenziale per creare un microambiente biochimico favorevole senza l'inefficienza e la perdita di bioattività che ne derivano. Una soluzione praticabile è l'uso di fibre interfacciali di complessazione polielettrolitica (IPC) per veicolare e proteggere gli agenti biologici. Quando due soluzioni acquose di polielettrolita caricate in modo opposto vengono riunite, le fibre IPC possono essere estratte dall'interfaccia. Praticamente qualsiasi tipo di biomolecola idrofila in soluzione acquosa può essere aggiunta alla soluzione polielettrolitica caricata negativamente o positivamente, facilitando così l'incorporazione di biomolecole utili nella fibra IPC durante il processo di complessazione. Inoltre, questo processo richiede solo condizioni acquose e ambientali, riducendo così il rischio di perdita di bioattività. Utilizzando questo metodo, sono stati somministrati con successo fattori di crescita attivi2,7 ecellule pari 8,9. Inoltre, il semplice metodo di formatura delle fibre IPC consente lo stampaggio in qualsiasi forma o orientamento. La stabilità di tali fibre è stata vantaggiosa nella loro incorporazione sia in polimeri idrofobici2 che idrofili7 per creare scaffold compositi. Questi scaffold compositi con fibre IPC sono utili per creare un ambiente biochimico fisiologicamente rilevante, fornendo al contempo un ancoraggio fisico per le cellule. 
In questo studio, mostriamo un metodo per incorporare fibre IPC in un'impalcatura idrofila e idrofobica con topografia per il rilascio controllato di biomolecole attive. Come prova di concetto, incorporiamo fibre IPC a base di chitosano e alginato nell'idrogel idrofilo pullulano-destrano biocompatibile, non immunogenico e non antigenico o nello scaffold idrofobico policaprolattone biocompatibile.

<table><tbody><tr><td>Pullulan&nbsp;</td><td>Hayashibara Inc, Okayama, Giappone</td><td></td><td>, Peso molecolare (MW): 200 kDa. Questo materiale è il pullulan di grado farmaceutico utilizzato per realizzare telai pullulan e scaffold PD-IPC.</td></tr><tr><td>destrano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1037</td><td>MW 500 kDa. Questo materiale non viene più prodotto da Sigma Aldrich. L'alternativa suggerita è il numero di catalogo 31392 (Sigma Aldrich). Questo materiale viene utilizzato per realizzare scaffold PD-IPC.</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio&nbsp;</td>Il bicarbonato di sodio <td>Sigma</td><td>Aldrich S5761</td><td>deve essere aggiunto lentamente alla soluzione polisaccaridica pullulano-destrano. L'aggiunta rapida di bicarbonato di sodio provocherà precipitazioni.</td></tr><tr><td>Trimetafosfato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5508</td><td>Questa sostanza chimica è igroscopica e deve essere conservata nell'armadio di deumidificazione. La soluzione acquosa di trimetafosfato di sodio deve essere sempre fresca.</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Questo materiale è pericoloso e deve essere maneggiato con dispositivi di protezione adeguati come guanti in nitrile.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448877</td><td>MW 190-310 kDa. Grado di acetilazione dal 75% all'85%. La purificazione del chitosano è necessaria per creare fibre IPC stabili.</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Merck</td><td></td><td>Questo può essere sostituito da un altro tipo di marca. Questo materiale è corrosivo e infiammabile. Quando si maneggia questa sostanza chimica nella cappa aspirante, è necessario indossare dispositivi di protezione come visiera, guanti in nitrile, camice da laboratorio e copriscarpe.</td></tr><tr><td>Acido alginico sale sodico da alghe brune, bassa viscosità</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2158</td><td>Sciogliere in acqua per una notte. Filtra attraverso sterile 0,2&nbsp; &micro; m filtro siringa prima dell'uso. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Reagente</td><td></td> chimico <td>dell'albumina sinopharm del siero bovino</td><td>Sciogliere in PBS sterile e filtrare utilizzando 0,2 &micro; m filtro siringa prima dell'uso.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di analisi BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Questo kit è stato utilizzato per misurare il rilascio di BSA dagli scaffold PD-IPC.</td></tr><tr><td>Fattore di crescita endoteliale vascolare ricombinante umano</td><td>R& Sistemi D</td><td>293-VE</td><td>Sciogliere il fattore di crescita in una soluzione di eparina allo 0,2% ad una concentrazione finale di 5&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Sale sodico di eparina da suino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Questo può essere sostituito da un altro tipo di marca. Sciogliere il sale di eparina in acqua sterile ad una concentrazione finale dell'1% e filtrare attraverso 0,2&micro; m filtro siringa prima dell'uso.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>Questo tipo di cellula primaria è stato utilizzato nel test per determinare la bioattività del VEGF dopo il rilascio da scaffold PD-IPC.</td></tr><tr><td>Alamar blue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>Viene utilizzato per misurare l'attività metabolica cellulare. Incubare il blu di Alamar con le cellule e mantenerlo in condizioni standard di coltura cellulare per 2-4 ore. Misurare l'assorbanza a 570 nm per determinare la percentuale di riduzione del blu Alamar, che è correlata all'attività cellulare.</td></tr><tr><td>Liofilizzatore ScanVac Coolsafe</td><td>Labogene</td><td>7.001.200.060</td><td>Si tratta di un liofilizzatore non programmabile che funziona da -105 a -110&nbsp; &deg;C. Questo può essere sostituito da altri liofilizzatori da laboratorio standard.</td></tr><tr><td>Policaprolattone (PCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181609</td><td>MW 65 kDa. Questo non è più prodotto da Sigma Aldrich. Questo può essere sostituito dal numero di catalogo Sigma Aldrich 704105.</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V800151</td><td>Questo può essere sostituito da un altro tipo di marca. Questo materiale è pericoloso e deve essere maneggiato nella cappa aspirante. I dispositivi di protezione devono essere indossati in ogni momento quando si maneggia questa sostanza chimica.</td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS; kit di elastomeri siliconici 184)</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>Il kit di elastomeri viene fornito con base polimerica e reticolante. Mescolando la base polimerica e il reticolante in rapporti diversi si otterrà una diversa rigidità del PDMS.</td></tr><tr><td>Fattore di crescita beta-nervoso ricombinante umano (NGF)</td><td>R& Sistemi D</td><td>256-GF</td><td>Ricostituito in acqua deionizzata sterile ad una concentrazione finale di 100&nbsp; &micro; g&#8288;/&#8288;ml. Aliquotare e conservare in -20 &deg; C fino all'uso.</td></tr><tr><td>Cellule staminali mesenchimali umane (hMSC)</td><td>Cambrex</td><td></td><td>Questo tipo di cellula è stato utilizzato nel test per determinare l'effetto sinergico dell'NGF e della nanotopografia.</td></tr><tr><td>Cellule di feocromocitoma PC12 di ratto&nbsp;</td><td>ATCC</td><td></td><td>Questo tipo di cellula è stato utilizzato nel saggio di crescita dei neuriti per determinare la bioattività dell'NGF. Dopo l'esposizione al terreno di rilascio con NGF, misurare il numero di cellule con estensioni neuritiche e normalizzare al numero totale di cellule.</td></tr><tr><td>Carta da filtro grado 93</td><td>Whatman</td><td>Z699675</td><td>Viene utilizzata per la purificazione del chitosano dopo la sua precipitazione con idrossido di sodio a pH 7.</td></tr><tr><td>Centrifuga a secchiello oscillante</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Da utilizzare durante la purificazione del chitosano utilizzando una velocità di 1.200 x g.</td></tr><tr><td>Motore con mandrino rotante a velocità costante</td><td>Rhymebus</td><td>RM5E</td><td>Il motore viene utilizzato per la fabbricazione di fibre IPC su telaio pullulan o PCL.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>FirstBase</td><td></td><td>Sterilize per filtrazione (0,2 & micro; m filtro) e autoclave.</td></tr><tr><td>Piatto di polistirene per colture tissutali di 10 mm di diametro (TCPS)</td><td>Greiner</td><td></td><td>Il piatto TCPS viene utilizzato per la colata del telaio in pullulano.</td></tr><tr><td>Kit ELISA VEGF umano</td><td>R& D systems</td><td>DVE00</td><td>Il kit ELISA viene utilizzato per il rilevamento di VEGF nel mezzo di rilascio.</td></tr><tr><td>Kit ELISA NGF umano</td><td>R& D systems</td><td>DY256</td><td>Il kit ELISA viene utilizzato per il rilevamento di NGF nel mezzo di rilascio.</td></tr><tr><td>Nastro adesivo plastificato</td><td>Bel-Art</td><td>9040336</td><td>Il nastro adesivo viene utilizzato per attaccare saldamente la clip a coccodrillo al mandrino rotante</td></tr></tbody></table>

ponteggi composto di fibre di interfacce polielettrolita per rilascio controllato di biomolecole temporalmente

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Vari scaffold utilizzati nell'ingegneria tissutale richiedono un ambiente biochimico controllato per imitare la nicchia cellulare fisiologica. Le fibre interfacciali di complessazione polielettrolitica (IPC) possono essere utilizzate per la somministrazione controllata di vari agenti biologici come farmaci a piccole molecole, cellule, proteine e fattori di crescita. La semplicità della metodologia nella produzione di fibre IPC offre flessibilità nella sua applicazione per la somministrazione controllata di biomolecole. Qui, descriviamo un metodo per incorporare fibre IPC in due diversi scaffold polimerici, polisaccaride idrofilo e policaprolattone idrofobo, per creare uno scaffold composito multicomponente. Abbiamo dimostrato che le fibre di IPC possono essere facilmente incorporate in queste strutture polimeriche, migliorando la capacità di rilascio prolungato e una migliore conservazione delle biomolecole. Abbiamo anche creato un'impalcatura polimerica composita con segnali topografici e rilascio biochimico prolungato che può avere effetti sinergici sul comportamento cellulare. Gli scaffold polimerici compositi con fibre IPC rappresentano un metodo nuovo e semplice per ricreare la nicchia cellulare.

In questo articolo, abbiamo cercato di creare impalcature compositi con fibre IPC per il rilascio prolungato di diverse biomolecole. Caratteristiche delle biomolecole utilizzati in questo studio sono presentati nella tabella 1. Fibre IPC sono stati incorporati in un PD idrogel idrofila per creare un&#39;impalcatura composita PD-IPC (Figura 1B). Modello molecola BSA è stata testata prima di determinare la possibilità di utilizzare un ponteggio in composito per il rilascio controllato bio...

Gli scaffold per l'ingegneria tissutale devono ricapitolare il complesso microambiente biochimico e biofisico della nicchia cellulare. Qui, mostriamo l'uso di fibre interfacciali di complessazione polielettrolitica come piattaforma per creare scaffold polimerici compositi e multicomponente con rilascio biochimico sostenuto.

Ponteggi composto di fibre di interfacce polielettrolita per rilascio controllato di Biomolecole temporalmente

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un rilascio controllato di biomolecole con controllo spaziale, al fine di mimare la nicchia cellulare mediante impalcature composite polimeriche idrofile o idrofobe. Questo risultato si ottiene innanzitutto creando un'impalcatura sacrificiale costituita dai polimeri desiderati, che fornisce l'organizzazione spaziale delle fibre di rilascio delle biomolecole, chiamate fibre di polielettroliti all'interfaccia, o fibre IPC. Il secondo passaggio consiste nell'incorporare fibre IPC contenenti la biomolecola idrofila mirata all'interno di un telaio sacrificiale.Successivamente, le fibre IPC sui costrutti del telaio vengono incorporate in un'impalcatura più grande utilizzando un substrato a microschema come stampo di colata, integrando segnali topografici nel substrato. L'ultimo passaggio prevede l'assimilazione completa delle fibre sul telaio, il consolidamento del costrutto e la solidificazione dei polimeri per creare substrati non patternizzati o patternizzati a livello microscopico. Infine, è possibile utilizzare saggi standard per dimostrare i profili di rilascio e l'attività biologica delle molecole bersaglio.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come la microincapsulazione, è che l'incorporazione di biomolecole idrofile in una vasta gamma di scaffold polimerici idrofili o idrofobici può ora essere effettuata mediante un processo semplice di incorporazione e fabbricazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della somministrazione di farmaci, tra cui il rilascio biochimico regolato in modo multiplo, il gradiente biochimico e l'effetto sinergico tra segnali topografici e rilascio biochimico prolungato sul comportamento cellulare. La dimostrazione visiva della formazione di fibre di polielettrolita è fondamentale poiché le fasi risultano difficili da apprendere.La velocità, la concentrazione e la purezza della soluzione di polielettrolita sono tutti fattori critici per la formazione stabile delle fibre IPC. Per iniziare, mescolare le proteine, i fattori di crescita o altre biomolecole di interesse in aliquote di 10-20 microlitri delle soluzioni di polielettrolita come descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, posizionare piccole gocce di 10-20 microlitri di chitosano e alginato su una superficie piana e stabile ricoperta di paraform. Le gocce di chitosano e alginato devono essere posizionate in prossimità l'una dell'altra, ma senza entrare in contatto.Inserire leggermente una punta di un paio di pinzette nella goccia di soluzione di alginato e l'altra punta nella goccia di soluzione di chitosano. Successivamente, avvicinare le due gocce di polielettroliti stringendo le pinzette. Quando le gocce entrano in contatto tra loro, tirare lentamente le pinzette in verticale per estrarre una fibra formata dalla complessazione interfaciale dei polielettroliti, nota come fibra IPC, dall'interfaccia tra le due gocce.Posizionare con attenzione l'estremit&agrave; della fibra IPC estrusa su un collettore costituito da un impalcatura polimerica piatta fissata su un mandrino rotante. Far ruotare il mandrino a una velocit&agrave; costante di 10 millimetri al secondo per consentire la formazione di fibre IPC uniformi e prive di noduli. Aumentare la velocit&agrave; di estrusione delle fibre IPC provocher&agrave; la formazione di noduli, che determineranno un rilascio burst dei composti biochimici incorporati e una terminazione prematura della fibra.In accordo con l'osservazione di Liao et al. e KO et al., quando la fibra termina, diluire il liquido residuo con 500 microlitri di PBS e misurare la concentrazione residua di proteine o fattori di crescita. Per determinare l'efficienza di incorporazione delle biomolecole, pesare tre grammi di polisaccaride di Polonia e aggiungerli a 15 millilitri di acqua distillata deionizzata.Per preparare una soluzione acquosa al 20%, mescolare la soluzione Poland durante la notte per garantire l'omogeneità il giorno successivo. Versare 15 millilitri della soluzione Poland in una piastra in polistirene per colture cellulari di 10 centimetri di diametro. Far asciugare la soluzione durante la notte a 37 gradi Celsius; una volta asciutta, tagliare i film in quadri di sette millimetri per sette millimetri da utilizzare come telai sacrificali Poland.Successivamente, preparare una soluzione al 30% dei polisaccaridi Poland e destrina in acqua distillata deionizzata in un rapporto di tre a uno. Mescolare per tutta la notte per garantire l'omogeneità; aggiungere lentamente bicarbonato di sodio alla soluzione di polisaccaridi per ottenere una concentrazione finale del 20%. Mescolare la soluzione per tutta la notte e conservare la soluzione finale di polisaccaridi a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Fissare il telaio sacrificabile Poland in un'orientazione desiderata al mandrino rotante utilizzando una pinza a coccodrillo e del nastro adesivo rivestito di plastica.Ruotare il mandrino con il telaio fissato a una velocità costante di 10 millimetri al secondo. Quindi iniziare a trarre le fibre IPC come mostrato nella sezione precedente. Tuttavia, questa volta, fissare l'estremità tratta delle fibre IPC sul telaio rotante di Polonia.Attendere il completamento della trazione della fibra IPC. Far asciugare le fibre sul telaio costruito per tutta la notte a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il telaio dal mandrino rotante staccandolo dalla pinza a coccodrillo.Posizionare il costrutto sul tappo di una provetta da microcentrifuga. Successivamente, versare cinque grammi della soluzione di Destrina Poland in un becher e iniziare a mescolare a 60 giri al minuto. Utilizzando un agitatore magnetico, aggiungere 500 microlitri di una soluzione al 11% di fosfato trisodico e 500 microlitri di idrossido di sodio 10 molare.Per indurre il legame incrociato della soluzione. Continuare a mescolare la soluzione per uno o due minuti, quindi versare la soluzione viscosa di polisaccaride sulle fibre del costrutto su telaio, in modo da incorporare completamente le fibre IPC. Incubare il costrutto a 60 gradi Celsius per 30 minuti per formare un impalcatura composita chimicamente reticolata, inducendo la formazione di pori nell'impalcatura composita.Immergere completamente l'impalcatura in una soluzione di acido acetico al 20% per 20 minuti. Quindi lavare l'impalcatura tre volte in PBS per cinque minuti, agitando a 100 giri al minuto. Per rimuovere eventuali reagenti non reagiti residui, eliminare l'eccesso di PBS e congelare immediatamente le impalcature composite a meno 80 gradi Celsius durante la notte.Successivamente, liofilizzare le impalcature per almeno 24 ore prima di utilizzarle in saggi di rilascio controllato o di bioattività. Iniziare creando un substrato di PDMS pristino e strutturato con una topografia desiderata, utilizzando metodi standard di litografia morbida. Successivamente, preparare sia il telaio sacrificabile di PCL per la raccolta delle fibre IPC sia la base di PCL strutturata, sciogliendo prima lo 0,9% di PCL nel diclorometano.Per ogni centimetro quadrato dell'area dello stampo per film in PDMS, versare 500 microlitri della soluzione di PCL allo 0,9% sullo stampo. Lasciare evaporare completamente il solvente nella cappa aspirante, quindi ripetere il processo di colatura del PCL allo 0,9% per aumentare lo spessore del film. Successivamente, preparare il telaio sacrificabile posizionando 500 microlitri alla volta della soluzione di PCL allo 0,9% su un substrato in PDMS pristino separato.Per creare un supporto di base di PCL puro, stratificare più strati di PCL per ottenere un impalcatura con lo spessore desiderato. Lasciare evaporare completamente tutto il solvente clorometano sotto cappa quando è stato raggiunto lo spessore desiderato. Rimuovere il film di PCL essiccato dal substrato di PDMS puro e praticare un foro nella cornice di PCL utilizzando un perforatore di dimensioni PSAP.Successivamente, montare il telaio in PCL sul mandrino di raccolta e iniziare ad avvolgere la fibra IPC sul telaio come descritto in precedenza. Al termine dell'avvolgimento della fibra IPC, rimuovere il costrutto di fibra sul telaio e lasciarlo asciugare tutta la notte a 25 gradi Celsius. Posizionare il costrutto di fibra sul telaio sopra la base in PCL stampata e aggiungere più volte la soluzione di PCL allo 0,9% sul costrutto di fibra sul telaio per ottenere lo spessore desiderato e assicurare un completo incapsulamento delle fibre IPC.L'albumina sierica bovina o BSA rilasciata dal composito IPD a base di destrina della Polonia ha mostrato una cinetica quasi lineare con un iniziale rilascio burst attenuato, seguito da uno stato stazionario concomitante. Dopo due mesi, la BSA ha raggiunto un rilascio totale del 97%. Al contrario, le fibre IPC autonome hanno mostrato un rilascio rapido dell'80% della BSA entro quattro ore. Utilizzando lo stesso composito, anche un fattore di crescita vascolare è stato in grado di essere rilasciato in modo sostenibile dalle fibre, impiegando cellule endoteliali di vena ombelicale umana come piattaforma di prova.È stato riscontrato che il fattore di crescita rilasciato fosse biologicamente attivo dopo il suo rilascio ad ogni punto temporale. In questo esempio, il fattore di crescita nervoso è stato caricato nelle fibre nell'arco di 18 giorni. Circa l'80% del fattore di crescita nervoso caricato è stato rilasciato dal composto P-C-L-I-P-C in modo sostenuto e lineare, come dimostrato da un saggio di fuoriuscita dei neuriti PC12.La quantità di fattore di crescita nervoso bioattivo rilasciata dall'impalcatura nel mezzo a ogni punto temporale ha avuto un effetto sulla crescita dei neuriti simile a quello ottenuto aggiungendo 30 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita nervoso a un mezzo semplice. Le impalcature composite P-C-L-I-P-C, che contengono sia topografia sia rilascio controllato di fattore di crescita nervoso, potrebbero avere un effetto sinergico sul comportamento cellulare. Le cellule staminali mesenchimali umane coltivate su impalcature composite con nanostruttura hanno mostrato un livello maggiore di differenziazione neuronale rispetto alle cellule esposte singolarmente alla topografia o al fattore di crescita.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mescolare la molecola idrofila desiderata nella soluzione di polielettrolita con la stessa carica netta per incorporarla nelle fibre. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare un impalcatura polimerica composita con la capacità di rilascio controllato di molecole bar. Il notevole vantaggio mostrato in questo video dovrebbe consentire di creare un'impalcatura polmonare con la capacità di rilascio prolungato di fattori di crescita, rilascio di più fattori di crescita e di creare un gradiente di segnali biochimici in grado di riprodurre la nicchia fisiologica.Non dimenticare che lavorare con acido acetico, idrossido di sodio e clorometano può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale e della cappa a flusso laminare devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Modifica multi-scala di impianti metallici con gradienti poro, polielettroliti e il loro monitoraggio indiretto<em&gt; In vivo</em

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