Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo In Vitro Modello sperimentale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di presentare un nuovo modello di reti neuronali tridimensionali in vitro accoppiate a micro array di elettrodi. Ciò si ottiene condizionando prima la parte centrale del MEA con una soluzione mista di polide lisina e laminina, quindi rivestendo le microsfere con proteine di adesione, laminina e polilisina. Il secondo passo consiste nel distribuire la sospensione delle microsfere trattate su una piastra multipozzetto dove si autoassembleranno e formeranno uno strato uniforme.

Il terzo passo della procedura consiste nel placcare le cellule sull'area attiva del MEA a una densità di 2000 cellule per millimetro quadrato per creare reti neuronali 2D. Da sei a otto ore dopo il trasferimento della sospensione dalla piastra multipozzetto al MEA e le microsfere possono autoassemblarsi in una struttura compatta esagonale. In definitiva, la microscopia confocale viene utilizzata per visualizzare le reti 3D, che vengono confrontate con le reti neuronali 2D convenzionali cresciute su MEA.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le colture cellulari dimensionali BDI in vitro, è che in un modello dimensionale BDI, i somata e i coni di crescita sono appiattiti, l'andone e l'aumento non possono diffondersi in tutte le direzioni. Inoltre, l'attività di bursting domina la dinamica elettrofisiologica delle reti dimensionali BDI mentre in una tridimensionale coesiste anche un'attività di specking casuale. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo letto l'articolo di ricerca di Sophie Potto pubblicato su Nature Method nel 2008, in cui ha utilizzato MICROBITS come impalcatura per costruire reti di ne tridimensionali.

Abbiamo poi adattato questo metodo a me per realizzare le prime registrazioni tridimensionali in vitro. Per preparare l'elastomero PDMS, mescolare l'agente indurente e un polimero con un rapporto in volume da uno a nove in una piastra di Petri. Agitate quindi il composto e ponetelo nella camera a vuoto per 10 minuti per eliminare le bolle d'aria.

Per costruire il vincolo PDMS, inserire il materiale PDMS nel più vecchio modellatore, quindi metterlo in forno per 30 minuti a 120 gradi Celsius. Il vincolo PDMS dovrebbe avere la forma di un cilindro con un diametro esterno e interno rispettivamente di 22,0 e 3,0 millimetri e un'altezza di 650 micrometri il giorno prima della placcatura. Accoppiare la maschera all'area attiva del MEA sotto uno stereomicroscopio, quindi sterilizzare la maschera PDMS nel forno a 120 gradi Celsius.

Successivamente, sterilizzare le microsfere di vetro in una fiala conica di etanolo al 70% per due ore, ruotata ogni 30 minuti per esporre successivamente tutte le microsfere. Rimuovere la soluzione di etanolo dal flaconcino e sciacquare le microsfere due volte con acqua sterilizzata. Quindi condizionare la parte centrale dell'area MEA delimitata dalla maschera PDMS con 24 microlitri di soluzione mista di polilisina e laminina a 0,05 microgrammi per millilitro.

Rivestire le microsfere con proteine di adesione, laminato e polilisina a 0,05 microgrammi per millilitro. Successivamente, mettili nell'incubatrice per una notte a 37 gradi Celsius per ottenere una rete neuronale stabile e duratura. Successivamente, distribuire la sospensione delle microsfere trattate sulla piastra multipozzetto con un inserto a membrana dove si autoassembleranno e formeranno uno strato uniforme.

Quindi riempire ogni pozzetto della membrana con 0,5 millilitri di terreno. Mettilo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino a quando i neuroni non sono pronti per essere placcati in questo passaggio. Dopo aver sacrificato una femmina di ratto incinta E 18, ottenere gli embrioni di ratto, quindi rimuovere i campi di ippopotamo da ogni embrione di ratto.

Mettili in matasse ghiacciate. Soluzione salina bilanciata senza calcio e magnesio. Successivamente, dissociare il tessuto nello 0,125% della soluzione di tryin Hanks contenente lo 0,05% di DNA per 18-20 minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, rimuovere il surnatante con una pipetta di pepe. Interrompere la digestione enzimatica aggiungendo un terreno con il 10% di FBS per cinque minuti. Quindi rimuovere il terreno con FBS e lavare una volta con il terreno di crescita, il suo integratore 1% di L-glutammina e gentamicina a 10 microgrammi per millilitro.

Successivamente, rimuovere il mezzo. Ricaricalo di nuovo con 500 microlitri di crescita. Medio. Il suo integratore 1% di L-glutammina e gentamicina a 10 microgrammi per millilitro.

Dissociare meccanicamente il pellet di tessuto con una pipetta stretta di PEs fino a quando non è evidente una sospensione lattiginosa di cellule. Successivamente, diluire un piccolo volume di sospensione cellulare con il terreno di coltura per ottenere un volume finale di 2,0 millilitri. Contare la concentrazione cellulare ottenuta con la camera emocitometrica.

Quindi diluire questa concentrazione in un rapporto da uno a cinque per ottenere la concentrazione cellulare desiderata di 600-700 cellule per microlitro. Piastra le cellule a una densità di 2000 cellule per millimetro quadrato sull'area attiva del MEA definita dal vincolo PDMS per creare una rete neuronale 2D. Quindi, posizionare il dispositivo MEA nell'incubatore con un'atmosfera di anidride carbonica umidificata al 5% a 37 gradi Celsius.

Per completare la fase preliminare per la costruzione della coltura 3D, distribuire 160 microlitri di sospensione con una concentrazione cellulare da 600 a 700 cellule per microlitro sulla superficie del monostrato di microsfere posizionato all'interno delle piastre multipozzetto. Quindi posizionare le piastre multipozzetto nell'incubatore con un'atmosfera di anidride carbonica umidificata al 5% a 37 gradi Celsius, da sei a otto ore dopo il trasferimento della placcatura da 30 a 40 microlitri di sospensione con microsfere e neuroni nell'area del MEA delimitata dal vincolo PDMS. Dopo ogni trasferimento, attendere circa mezzo minuto per consentire alle microsfere di autoassemblarsi in una struttura esagonale.

Una volta che tutti gli strati sono depositati e assemblati spontaneamente a 300 microlitri di terreno sulla sommità dell'area delimitata dal vincolo PDMS. Mettere la struttura 3D accoppiata al MEA nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 48 ore. Dopodiché, aggiungere un millilitro di terreno di coltura con il suo integratore dopo tre settimane in vitro, la struttura 3D è stabile anche senza il vincolo PDMS mostrato.

Ecco un'immagine DIC di un singolo strato di perline accoppiate alla superficie MEA. La posizione dei punti neri rappresenta la disposizione spaziale degli elettrodi. La colorazione immunofluorescente per la mappa due, che viene riflessa dal segnale rosso, mostra la distribuzione dell'arborizzazione dendritica e dell'ADA dei neuroni attorno alle microsfere direttamente accoppiate al piano dell'elettrodo del MEA.

Questa immagine mostra la massima proiezione di una sequenza Zack di una coltura 3D che mostra una rete altamente interconnessa in cui i neuroni sono marcati per il nuovo N espresso nei neuroni post-mitotici maturi. E per gaba, ecco la registrazione elettrofisiologica rappresentativa delle reti ippocampali in configurazione 3D. Ed ecco la registrazione elettrofisiologica rappresentativa delle reti ippocampali in configurazione 2D.

Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in sette ore. Tuttavia, vale la pena notare che, poiché la procedura ha diversi passaggi che sono stati eseguiti durante giorni diversi, la stima del tempo per realizzare l'intera procedura è solo un'indicazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prima placcare uno strato 2D di diuretico neuronale sull'elettrodo del mea, quindi trasferire con molta attenzione la sospensione di microbiti e neuroni dalla piastra multipozzetto al mea per realizzare la struttura 3D dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze computazionali per esplorare come la connettività di rete possa modellare le dinamiche di rete emergenti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire una rete neuronale tridimensionale in vitro accoppiata a micro array di elettrodi.