Name: Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo In Vitro Modello sperimentale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Scopri come costruire reti neuronali tridimensionali accoppiate a microelettrodi (MEA) usando microsfere di vetro come scaffold. Questo modello in vitro offre connettività avanzata per studi elettrofisiologici.

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Gli autori ringraziano Giorgio Carlini per il supporto tecnico per lo sviluppo della struttura di confinamento e dott. Ornella LoBrutto per l&#39;accurata revisione del manoscritto. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal 7 ° programma quadro dell&#39;Unione europea (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET giovani esploratori schema), contratto di sovvenzione 284.772 CERVELLO ARCO (www.brainbowproject.eu).

Il protocollo sperimentale è stato approvato dalla cura degli animali Legislazione Europea (2010/63 / UE), dal Ministero della Salute italiano, secondo la DL 116/1992 e dalle linee guida dell&#39;Università di Genova (Prot. N. 13130, maggio 2011). Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre il numero di animali per il progetto e per ridurre al minimo la loro sofferenza. 1. Preparazione dei Materiali e supporti <ol><li> Costruire lo stampo per costruire le PDMS (Poly-dimetil-silossano) vincolo mediante un CNC (Computer Numerical Control) fresatrice. Tale stampo è realizzato in policarbonato con cilindro centrale in politetrafluoroetilene (PTFE). Questo materiale consente una più facile estrazione della maschera quando il PDMS è indurito. NOTA: Il design dello stampo è stata eseguita da Computer-Aided-Design (CAD) e poi consegnato alla fresatrice CNC. </li><li> Preparare l&#39;elastomero PDMS. PDMS è un polimero organico. Esso è composto da due elementi, Un agente di indurimento e un polimero. Mescolare con un rapporto volumetrico 1:10, una parte di agente indurente e nove parti di polimero. Mettere i due componenti in una capsula di Petri, agitare e inserire la miscela nella camera a vuoto per 10 minuti per eliminare le bolle d&#39;aria. 3 g di PDMS sono sufficienti per un vincolo. </li><li> Costruire il vincolo PDMS. Inserire il materiale PDMS nel modellatore e metterla in forno per 30 minuti a 120 ° C. Il vincolo PDMS ha la forma di un cilindro ideale, con un diametro esterno e interno di 22,0 mm e 3,0, rispettivamente, e un&#39;altezza di 650 micron. </li><li> Il giorno prima della placcatura, coppia la maschera per l&#39;area attiva delle matrici Micro-elettrodo (MEA) per mezzo di una pinzetta allo stereomicroscopio e sterilizzare la maschera PDMS in forno a 120 ° C. </li><li> Sterilizzare le microsfere di vetro (diametro nominale di 40 ± 2 micron; diametro medio certificato di 42,3 ± 1,1 micron) in etanolo al 70% per 2 ore in un flaconcino conica e ruotare every 30 minuti per esporre tutte le microsfere. </li><li> Rimuovere la soluzione di etanolo dal flaconcino e lavare le microsfere due volte con acqua sterilizzata. </li><li> Condizionare la parte centrale della zona MEA delimitata dalla maschera PDMS (diametro pari a 3,0 mm) con 24 ml di soluzione mista di poli-D-lisina e laminina a 0,05 ug / ml. </li><li> Rivestire le microsfere con proteine ​​di adesione, laminina e Poly-D-lisina a 0,05 mg / ml e lasciare per una notte in incubatore a 37 ° C, per ottenere una rete neuronale stabile e duratura. </li><li> Rimuovere i fattori di adesione sia dalla superficie del vetro del MEA e dalle microsfere di vetro. Aspirare circa il 95% della soluzione di rivestimento con una pipetta e applicare una piccola volume- 24μl- di acqua sterile sulla superficie MEA. Aspirare ancora più del 95% dell&#39;acqua e lasciare che il MEA secca sotto il cofano laminare per 1 ora prima della placcatura cellule. NOTA: Nel caso di microsfere invece, aspirare il rivestimentosoluzione e fare un primo lavaggio con acqua sterilizzata e un secondo con il mezzo basale e il suo supplemento come B27, per condizionare la superficie di vetro in cui verranno piastrate neuroni. Non lasciate che le microsfere asciugare. Lasciarli in sospensione nel mezzo di coltura all&#39;interno del flacone. </li><li> Distribuire, mediante una pipetta -200 μl-, la sospensione di microsfere trattate (circa 32.000) su una piastra multipozzetto con inserto di membrana (diametro dei pori 0,4 micron) in cui si auto-assemblano formare uno strato uniforme. </li><li> Riempire ciascun pozzetto della membrana con 0,5 ml di terreno e metterlo in incubatrice (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) fino a quando i neuroni sono pronte per essere placcato (3.2). </li></ol> 2. Dissezione degli embrioni e la dissociazione di tessuto <ol><li> Casa ratti femmina adulti (200-250 g) ad una temperatura costante (22 ± 1 ° C) e umidità relativa (50%) sotto una pianificazione luce-buio normale (light-on 7 AM-7 PM) nelstabulario. Assicurarsi che il cibo e l&#39;acqua sono liberamente disponibili. </li><li> Anestetizzare un topo femmina incinta dopo 18 giorni di sviluppo (E18) utilizzando 3% isoflurano. Poi, sacrifica l&#39;animale per dislocazione cervicale. </li><li> Rimuovere ippocampi da ogni embrione di ratto e metterli in una soluzione salina bilanciata ghiacciata di Hank senza Ca 2 + e Mg 2+. Al giorno 18 di ippocampo di sviluppo e dei tessuti della corteccia sono molto morbidi e non hanno bisogno di essere tagliato in piccoli pezzi. Ulteriori dettagli possono essere trovati 18,19. </li><li> Dissociare il tessuto 0,125% di soluzione di tripsina / Hank contenente lo 0,05% di DNAsi per 18-20 minuti a 37 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione surnatante con una pipetta Pasteur e fermare la digestione enzimatica aggiungendo mezzo con siero fetale bovino 10% (FBS) per 5 min. </li><li> Rimuovere il mezzo con FBS e lavare una volta con il mezzo con il suo complemento, 1% L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml. Rimuovere di nuovo il supporto con un pip Pasteurette e riempire nuovamente con una piccola quantità (500 ml) di mezzo di crescita con il suo complemento, 1% L-glutamina, gentamicina 10 ug / ml. </li><li> Dissociare il precipitato di tessuto meccanicamente con una pipetta Pasteur stretta fino una sospensione lattiginosa di cellule è evidente. Non è necessario centrifugare la sospensione cellulare. </li><li> Diluire il piccolo volume di sospensione cellulare con il terreno di coltura per ottenere un volume finale di 2,0 ml. Contare il concentrazione cellulare ottenuto con una camera emocitometro. Diluire la concentrazione a 1: 5 per ottenere la concentrazione desiderata di cellule 600-700 cellule / microlitro. </li></ol> 3. cellule placcatura <ol><li> Cellule piastra ad una densità di circa 2.000 cellule / mm 2 sulla zona attiva del MEA, definiti dal vincolo PDMS per creare una rete neuronale 2D. NOTA: Ogni ippocampo contiene circa 5 x 10 5 cellule, (1 x 10 6 per un singolo embrione). Sezionare 6 embrioni per ottenere un importo totale di 6 x 106 cellule in 2 ml, e una concentrazione stimata di 3.000 cellule / microlitro. Diluire la concentrazione a 1: 5 per ottenere la concentrazione desiderata e piastra di cellule circa 600-700 cellule / ml. Se l&#39;area MEA delimitata dal vincolo PDMS è di circa 7.065 mm 2, e il numero totale di cellule piastrate 600 cellule / ml x 24 ml = 14.400 cellule, la densità finale di 2.038 cellule / mm 2. </li><li> Posizionare i dispositivi MEA nel incubatore umidificato con CO2 nell&#39;atmosfera (5%) a 37 ° C. </li><li> Distribuire 160 microlitri della sospensione con una concentrazione cellulare di 600-700 cellule / microlitro (circa 100.000 cellule) sulla superficie del monostrato microsfere posizionato all&#39;interno delle piastre multipozzetto per completare la fase preliminare per la costruzione della cultura tridimensionale. Mettere le piastre a pozzetti multipli nell&#39;incubatore con umidificata CO 2 nell&#39;atmosfera (5%) a 37 ° C. </li></ol> Edilizia 4. 3D Rete neuronale <ol><li> 6-8 ore dopo la placcatura, trasferire la sospensione (microsfere con neuroni) dalle piastre multipozzetto attentamente all&#39;interno dell&#39;area delimitata dal vincolo PDMS utilizzando una pipetta impostato per un volume di circa 30-40 ml. Dopo ogni trasferimento, attendere circa mezzo minuto, per consentire le microsfere di auto-assemblarsi in una struttura compatta esagonale. </li><li> Una volta che tutti gli strati sono depositati e spontaneamente assemblati, riempire con una grande goccia di circa 300 ml di mezzo della parte superiore dell&#39;area delimitata dal vincolo PDMS. </li><li> Mettere la struttura 3D accoppiato al MEA in incubatore (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) per 48 ore prima di aggiungere un volume finale (circa 1 ml) di crescita terreno di coltura con il suo supplemento. NOTA: Si consideri il numero totale di perline su piastre multipozzetto con inserto membrana (30.000) e il numero di perle su un singolo strato sul dispositivo MEA (6000). La struttura 3D risultante è composta da 5 strati di microbeads e cellule. Tenendo conto che la rete neuronale 3D non è geometricamente perfetta, la struttura 3D risultante potrebbe essere composta di 5-8 strati. </li><li> Il giorno dopo la placcatura, aggiungere con attenzione il volume finale del mezzo (circa 900 ml) all&#39;interno dell&#39;anello MEA. Mantenere le culture 3D in un umidificata CO 2 nell&#39;atmosfera (5%) a 37 ° C per 4-5 settimane. Sostituire la metà del mezzo una volta alla settimana. </li></ol> 5. Microscopia confocale Acquisizione <ol><li> Fissare i campioni biologici alla fase del microscopio in un supporto. Posizionare il laser (Argon, 496-555 nm), la velocità di scansione (400 Hz) di acquisire l&#39;immagine, il guadagno e offset (-0,3%) di PMT per ogni immagine di catturare il filtro per le emissioni di banda corretta e in ordine per evitare la saturazione e per aumentare il rapporto segnale-rumore. La Sezione I risultati sono riportati i valori utilizzati per acquisire le immagini di figura 4. </li><li> Per l&#39;acquisizione del z impili sequenza, abetest selezionare, il valore della posizione z della parte superiore e lo strato inferiore del campione, e quindi selezionare il passo di rendere l&#39;acquisizione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In questo lavoro, un romanzo sperimentale in vitro piattaforma costituita da 3D progettato colture neuronali accoppiati a MEA per elettrofisiologia rete è stata presentata. L&#39;uso di microsfere come impalcatura per consentire la conseguenza neuritica lungo la z -axis è stata adattata per essere integrato con il MEA planare. In questo modo, i risultati ottenuti micro-sistema in vitro modello 3D valida ed affidabile per studiare le dinamiche emergenti elettrofisiologici 16.</sup...

In vitro bidimensionali (2D) reti neurali accoppiati a micro-elettrodi Array (MEA) arethe modello sperimentale gold-standard adottato per studiare l&#39;interazione tra la dinamica neuronale e la connettività di base. Durante lo sviluppo, i neuroni ricreano reti complesse che mostrano ben definedspatio-temporalpatternsof attività 1,2 (cioè, scoppi, esplosioni di rete, attività chiodare casuale). MEA registrare l&#39;attività elettrofisiologica da molti siti (da decine a migliaia di microelettrodi), che consente un esame approfondito delle dinamiche espresse a livello di rete. Inoltre, l&#39;uso di colture dissociate rende possibile progettare-reti ingegnerizzati. È facile capire in questo modo le relazioni funzionali tra dell&#39;attività elettrofisiologica registrata ei parametri dell&#39;organizzazione network come densità cellulare 3, grado di modularità 4,5, presenza di eterogenea pop neuronaleulations 6, ecc, tuttavia, tutti gli studi in vitro su cellule in coltura dissociate sono basati su reti neuronali 2D. Questo approccio porta a semplificazioni rispetto al sistema in vivo (intrinsecamente 3-dimensionale, 3D): (i) in un modello 2D, somata e coni di crescita sono appiattite e la conseguenza assoni-dendriti non può diffondere in tutte le direzioni 7. (ii) 2D in vitro reti mostra stereotipata dinamiche elettrofisiologiche dominati da scoppio attività che comporti la maggior parte dei neuroni della rete 8. Recentemente, diverse soluzioni sono state sviluppate per consentire la costruzione di in vitro 3D dissociato reti neuronali. L&#39;idea comune consiste nella creazione di un ponteggio in cui i neuroni possono crescere in modo 3D. Tale impalcatura può essere realizzato con gel polimerici e solidi matrici porose 9-13. Sfruttando le proprietà meccaniche dei polimeri, è possibile incorporare all&#39;interno delle cellule these strutture definendo un blocco omogeneo di culture 3D di neurosfere 11. La caratteristica principale di questo approccio è la proprietà meccanica rigida delle neurosfere 9,12. Tuttavia, questi materiali hanno limitato la porosità, e non garantisce la migrazione delle cellule all&#39;interno della matrice. Per ovviare a questo inconveniente, una possibile soluzione consiste nel tagliare la matrice in moduli &#39;unità&#39;. Purtroppo, la dimensione e la forma delle particelle diversità potrebbe ostacolare l&#39;imballaggio in strutture stratificate regolare. In 7, Cullen e colleghi hanno progettato un costrutto neuronale 3D fatta di neuroni e / o astrociti all&#39;interno di un ponteggio a matrice extracellulare bioattivi. Tale tessuto neurale progettata consentito in Studi in vitro per studiare e manipolare le risposte neurobiologiche all&#39;interno di micro-ambienti 3D. Questo modello consisteva di neuroni e glia distribuiti in tutta la matrice extracellulare (ECM) e / o ponteggi idrogel (spessore 500-600 micron). In questo condition, una vitalità cellulare ottimale (superiore al 90%) è stato trovato placcando le cellule ad una densità finale di circa 3.750 - 5.000 cellule / mm3. Si deve notare che tale valore di densità è di gran lunga inferiore a quello nella condizione in vivo, in cui la densità delle cellule della corteccia cerebrale mouse è circa 90.000 cellule / mm 3 14. Per superare questa limitazione Pautot e collaboratori 15 realizzato un sistema 3D in vitro dove la densità cellulare e la connettività di rete sono controllati per assomigliare in condizioni in vivo consentendo imaging in tempo reale della rete. In pratica, questo metodo si basa sul concetto che dissociata neuroni in coltura sono in grado di crescere su microsfere di silice. Queste perle forniscono una superficie di crescita abbastanza grande per i corpi cellulari neuronali di aderire e per i loro arborizzazioni per crescere, maturare, estendere, e definire contatti sinaptici con altri neuroni. Questo metodo sfrutta le proprietà di assemblaggio spontanei di perline monodisperse a form 3D strati array esagonale contenenti sottoinsiemi distinti di neuroni su livelli diversi con connettività vincolata tra i neuroni in diverse sfere. La densità cellulare ottenuta con questo metodo è stato di circa 75.000 cellule / mm3. Recentemente, abbiamo adattato il metodo di Pautot di MEA 16: i risultati ottenuti mostrano che l&#39;attività elettrofisiologica 3D presenta un repertorio più ampia di attività rispetto a quello espresso dalle reti 2D. Culture mature 3D mostrano una dinamica rafforzata cui sia scoppio rete e casuale coesistono attività picco. Analogamente, Tang-Schomer e collaboratori 17 realizzato uno scaffold poroso a base di proteina di seta che mantiene una cultura corticale primaria in vitro per alcuni mesi, e registrato l&#39;attività elettrofisiologica mediante un elettrodo di tungsteno. In questo lavoro, le procedure sperimentali per costruire reti neuronali 3D accoppiati a MEA sarà descritta.

<table><tbody><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>0.05 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>0,05 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>diluito allo 0,125% 1:2 in HBSS senza CA++, MG++</td></tr><tr><td>DNAasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>diluito allo 0,05% in soluzione di Hanks</td></tr><tr>Terreno di <td>coltura</td><td>Neurobasal</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21103049</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>17504044</td><td>2% supplente</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td>10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>0,5 mM</td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G.1272</td><td>5 mg/L</td></tr><tr><td>Poli-Dimetil-Silossano (PDMS)</td><td>Corning Sigma</td><td>481939</td><td>agente indurente e il polimero</td></tr><tr><td>Micro-Electrode Arrays Multi Channel Systems</td><td>(MCS)</td><td>60MEA200/30-Ti-pr</td><td>MEA con: Griglia di elettrodi 8x8; Interasse e diametro degli elettrodi 200 e 30 &; m, rispettivamente; anello in plastica senza filettatura</td></tr><tr><td>Microbead</td><td>Distrilab-Duke Scientific</td><td>9040</td><td>&nbsp; 1 gr Parte in Vetro. Formato Stds 40 &micro; m</td></tr><tr><td>Piastre multipozzetto Transwell</td><td>Costar Sigma</td><td>CLS 3413</td><td>con inserto a membrana (diametro 6,5 mm, poroso 0,4 &; m)</td></tr><tr><td>HBSS w\o Ca++ ,Mg++&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14175-052</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone Hanks&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Teflon</td><td>Sigma</td><td>430935-5G</td><td>politetrafluoroetilene</td></tr><tr><td>Rat</td><td>Sprague Dawley</td><td>Wistar Rat</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia confocale verticale</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>20.0x0.50 Obiettivo ACQUA</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40.0x0.80 Obiettivo ACQUA</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>25.0x0.95 Obiettivo ACQUA</td><td>Leica</td><td>HCX IRAPO L</td><td></td></tr></tbody></table>

interfacciamento 3d engineered neuronali culture a micro-electrode array: un innovativo<em&gt; in vitro</em&gt; modello sperimentale

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Attualmente, le reti su larga scala derivate da neuroni dissociati che crescono e si sviluppano in vitro su dispositivi micro-trasduttori extracellulari sono il modello sperimentale gold standard per studiare i meccanismi neurofisiologici di base coinvolti nella formazione e nel mantenimento degli assemblaggi cellulari neuronali. Tuttavia, gli studi in vitro si sono limitati alla registrazione dell'attività elettrofisiologica generata dalle reti neurali bidimensionali (2D). Tuttavia, data l'intricata relazione tra struttura e dinamica, è necessario un miglioramento significativo per studiare la formazione e lo sviluppo delle dinamiche di reti tridimensionali (3D). In questo lavoro, viene presentata una nuova piattaforma sperimentale in cui le reti ippocampali o corticali 3D sono accoppiate a array di microelettrodi planari (MEA). Le reti 3D sono realizzate seminando i neuroni in un'impalcatura costituita da microsfere di vetro (30-40 μm di diametro) su cui i neuroni sono in grado di crescere e formare complessi assemblaggi 3D interconnessi. In questo modo, è possibile progettare reti 3D ingegnerizzate composte da 5-8 strati con una densità di celle finale prevista. La crescente complessità nell'organizzazione morfologica dell'assemblaggio 3D induce un miglioramento dei pattern elettrofisiologici mostrati da questo tipo di reti. Rispetto alle reti 2D standard, dove emerge un'attività di bursting altamente stereotipata, la struttura 3D altera l'attività di bursting in termini di durata e frequenza, oltre a consentire l'osservazione di un'attività di spiking più casuale. In questo senso, il modello 3D sviluppato assomiglia più da vicino alle reti neurali in vivo.

. In questa procedura sperimentale, un ruolo importante è giocato dalle microsfere che definiscono l&#39;impalcatura meccanica per la crescita della rete neuronale 3D Figure 1A e B mostra la disposizione delle microsfere (diametro nominale di 40 ± 2 micron; diametro medio certificata di 42.3 ± 1.1 micron) nel piano. La particolarità di tali strutture è che microsfere spontaneamente auto-assemblano definendo una geometria esagonale compatto (Figura 1B e C). L&#39;impalcatura così generat...

In questo lavoro, un nuovo modello sperimentale in cui le colture neuronali 3D sono accoppiate a array di microelettrodi planari (MEA) è presented. 3D le reti sono costruite seminando i neuroni in un'impalcatura composta da microsfere di vetro su cui i neuroni crescono e formano strutture 3D interconnesse.

Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello sperimentale

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è presentare un nuovo modello di reti neuronali tridimensionali in vitro accoppiate a microarray di elettrodi. Questo viene realizzato innanzitutto condizionando la parte centrale dell'MEA con una soluzione mista di polilisina e laminina, quindi ricoprendo le microperle con proteine adesive, laminina e polilisina. Il secondo passaggio consiste nel distribuire la sospensione di microperle trattate in una piastra multi-pozzetto, dove si autorganizzeranno formando uno strato uniforme.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'allestire le cellule sull'area attiva della MEA a una densità di 2000 cellule per millimetro quadrato per creare reti neuronali 2D. Da sei a otto ore dopo l'allestimento, la sospensione viene trasferita dalle piastre multipozzetto alla MEA e ai microsferette viene consentito di autoassemblarsi in una struttura compatta esagonale. Infine, la microscopia confocale viene utilizzata per visualizzare le reti 3D, che vengono confrontate con le reti neuronali 2D convenzionali coltivate sulla MEA.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le colture cellulari tridimensionali in vitro BDI, è che in un modello tridimensionale BDI, i corpi cellulari e i coni di crescita sono appiattiti e l'Andon e la crescita non possono espandersi in tutte le direzioni. Inoltre, l'attività a scarica domina la dinamica elettrofisiologica delle reti BDI tridimensionali, mentre in una rete tridimensionale coesiste anche un'attività casuale a scintillio. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo leggendo l'articolo di ricerca di Sophie Potto pubblicato su Nature Methods nel 2008, in cui utilizzava MICROBITS come impalcatura per costruire reti neurali tridimensionali.Abbiamo quindi adattato questo metodo per effettuare le prime registrazioni tridimensionali in vitro. Per preparare l'elastomero in PDMS, mescolare l'agente indurente e il polimero in rapporto di volume di uno a nove in una piastra di Petri. Quindi agitare la miscela e collocarla nella camera a vuoto per 10 minuti per eliminare le bolle d'aria.Per costruire il vincolo in PDMS, inserire il materiale PDMS nello stampo, quindi metterlo in forno per 30 minuti a 120 gradi Celsius. Il vincolo in PDMS deve avere la forma di un cilindro con un diametro esterno e interno rispettivamente di 22,0 e 3,0 millimetri, e un'altezza di 650 micrometri il giorno precedente la semina. Accoppiare la maschera all'area attiva della MEA sotto un microscopio stereoscopico, quindi sterilizzare la maschera in PDMS in forno a 120 gradi Celsius.Successivamente, sterilizzare le microsfere di vetro in un vial conico contenente etanolo al 70% per due ore, ruotando ogni 30 minuti per esporre tutte le microsfere. Rimuovere la soluzione di etanolo dal vial e risciacquare le microsfere due volte con acqua sterilizzata. Quindi condizionare la parte centrale dell'area MEA delimitata dalla maschera in PDMS con 24 microlitri di soluzione mista di polilisina e laminina a 0,05 microgrammi per millilitro.Rivestire le microsfere con proteine adesive, laminina e polilisina a 0,05 microgrammi per millilitro. Successivamente, collocarle nell'incubatrice per tutta la notte a 37 gradi Celsius per ottenere una rete neuronale stabile e duratura. In seguito, distribuire la sospensione delle microsfere trattate nella piastra a pozzetti con inserto a membrana, dove si autoassembleranno e formeranno uno strato uniforme.Quindi aggiungere 0,5 millilitri di mezzo in ogni pozzetto della membrana. Collocare in incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando i neuroni non sono pronti per essere seminati in questo passaggio. Dopo l'eutanasia di un ratto femmina incinta al giorno E18, ottenere gli embrioni di ratto, quindi rimuovere gli ippocampi da ciascun embrione di ratto.Posizionarli in soluzione fredda di Hanks equilibrata con sali, priva di calcio e magnesio. Successivamente, dissociare il tessuto in soluzione di Hanks contenente 0,125% di tripsina e 0,05% di DNAasi per 18-20 minuti a 37 gradi Celsius.Successivamente, rimuovere il soprannatante con una pipetta Pasteur. Arrestare la digestione enzimatica aggiungendo il mezzo con il 10% di FBS per cinque minuti. Quindi rimuovere il mezzo con FBS e lavare una volta con il mezzo di crescita, il suo supplemento 1% L-glutammina e la gentamicina a 10 microgrammi per millilitro.Successivamente, rimuovere il mezzo. Ricaricare nuovamente con 500 microlitri di mezzo di crescita. Integralo con 1% di L-glutammina e gentamicina a 10 microgrammi per millilitro.Dissociare il pellet di tessuto meccanicamente con una pipetta PES stretta fino a ottenere una sospensione lattiginosa di cellule. Successivamente, diluire un piccolo volume di sospensione cellulare con il mezzo di crescita per ottenere un volume finale di 2,0 millilitri. Contare la concentrazione cellulare ottenuta utilizzando la camera per emocitometro.Quindi diluire questa concentrazione in un rapporto di uno a cinque per ottenere la concentrazione cellulare desiderata di 600-700 cellule per microlitro. Piastrare le cellule a una densità di 2000 cellule per millimetro quadrato nell'area attiva della MEA definita dal vincolo in PDMS per creare una rete neuronale bidimensionale. Successivamente, posizionare il dispositivo MEA nell'incubatrice con un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.Per completare il passaggio preliminare per la costruzione della coltura 3D, distribuire 160 microlitri della sospensione con una concentrazione cellulare di 600-700 cellule per microlitro sulla superficie del monostrato di microperle posizionato all'interno delle piastre multipozzetto. Successivamente, collocare le piastre multipozzetto nell'incubatrice con atmosfera di anidride carbonica umidificata al 5% a 37 °C; da sei a otto ore dopo il seeding, trasferire da 30 a 40 microlitri della sospensione contenente microperle e neuroni nell'area dell'MEA delimitata dal vincolo in PDMS. Dopo ogni trasferimento, attendere circa mezzo minuto per consentire alle microperle di autoassemblarsi in una struttura esagonale.Dopo che tutti gli strati sono stati depositati e si sono assemblati spontaneamente, aggiungere 300 microlitri di mezzo sulla parte superiore dell'area delimitata dal vincolo in PDMS. Posizionare la struttura 3D accoppiata alla MEA nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore. Dopo questo periodo, aggiungere un millilitro di mezzo di crescita con il relativo supplemento; dopo tre settimane in coltura, la struttura 3D risulta stabile anche in assenza del vincolo in PDMS, come mostrato.Di seguito è riportata un'immagine DIC di un singolo strato di microsferette accoppiate alla superficie della MEA. La posizione dei punti neri rappresenta la disposizione spaziale degli elettrodi. La colorazione immunofluorescente per la map2, visibile come segnale rosso, mostra la distribuzione dell'arborizzazione dendritica e dell'ADA dei neuroni attorno alle microsferette direttamente accoppiate al piano degli elettrodi della MEA.Questa immagine mostra la proiezione massima di una sequenza Zack di una coltura 3D che evidenzia una rete altamente interconnessa in cui i neuroni sono marcati per il nuovo N espresso nei neuroni maturi post-mitotici. Ecco un esempio rappresentativo di registrazione elettrofisiologica delle reti ippocampali in configurazione 3D. Ecco un esempio rappresentativo di registrazione elettrofisiologica delle reti ippocampali in configurazione 2D.Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in sette ore. Tuttavia, è importante notare che poiché la procedura comprende diversi passaggi effettuati in giorni diversi, la stima del tempo necessario per completare l'intero processo è puramente indicativa. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di piastrare innanzitutto uno strato bidimensionale di neuroni diuretici sull'elettrodo della MEA, per poi trasferire con estrema cautela la sospensione di microbit e neuroni dalla piastra multi-pozzetto alla MEA al fine di realizzare la struttura tridimensionale dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroscienza computazionale per esplorare come la connettività della rete possa modellare la dinamica emergente della rete. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire una rete neuronale tridimensionale in vitro accoppiata ad array di microelettrodi.

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Questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per l'impostazione, la cura, la registrazione e stimolando elettricamente culture su MEA.

Come la cultura, record e stimolare reti neuronali sulla micro-array di elettrodi (MEA)

Questo video dimostra lo sviluppo di una coltura neuronale 3D accoppiata a un array di microelettrodi planari con neuroni ippocampali. I neuroni isolati formano una rete 2D sull'area attiva dell'array di microelettrodi e aderiscono alle microsfere di vetro in una piastra multipozzetto con un inserto a membrana. Dopo aver trasferito queste microsfere rivestite di neuroni all'elettrodo, si organizzano in una rete neurale 3D interconnessa.

Costruzione di reti neuronali tridimensionali accoppiate a array di microelettrodi

Questo video mostra la procedura di utilizzo dell'array multielettrodo (MEA) per misurare la fisiologia sinaptica in sfere di cocoltura 3D. Questo metodo consente di comprendere le dinamiche della rete neurale e l'attività del burst della rete sinaptica all'interno delle sfere 3D.

Utilizzo di array multielettrodo per misurare la fisiologia sinaptica in sfere di cocoltura 3D

Questo manoscritto descrive un protocollo di crescere in vitro reti modulari composti da spazialmente confinate, circuiti neuronali funzionalmente interconnessi. Una maschera polimerica viene usata per modello uno strato proteico per favorire l'adesione cellulare su substrato di coltura. Neuroni placcato crescono su aree rivestite stabilire connessioni spontanee e che presentano attività elettrofisiologica.

Design, Trattamento delle superfici, Cellular placcatura, e Coltura di neuronali modulari reti composte di circuiti funzionalmente interconnessi

Presentiamo un protocollo per la coltura di espianti di neuroni gangliari murini a spirale primaria su array multi-elettrodi per studiare i profili di risposta neuronale e ottimizzare i parametri di stimolazione. Tali studi mirano a migliorare l'interfaccia neurone-elettrodo degli impianti cocleari a vantaggio dell'udito nei pazienti e del consumo energetico del dispositivo.

Ganglio spirale Neuron Espianto cultura e Elettrofisiologia su Multi Electrode Array

Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

In questo protocollo, ci proponiamo di descrivere un metodo riproducibile per combinare dissociato pluripotenti umane su cellule staminali neuroni e astrociti insieme in 3D sfera cocultures, mantenendo queste sfere in condizioni galleggiante libera e successivamente misurazione dell'attività sinaptica circuito delle sfere con immunoanalysis e registrazioni di matrice multielettrodo.

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo mira a dimostrare come combinare in vitro microelettrodi con dispositivi microfluidici per lo studio della trasmissione del potenziale d'azione in colture neuronali. Analisi dei dati, vale a dire l'individuazione e la caratterizzazione dei materiali di moltiplicazione di potenziali di azione, è eseguita utilizzando un nuovo avanzato, ma facile da usare e liberamente disponibile, strumento computazionale.

Microfluidica di interfacciamento con microelettrodi per studiare comunicazione neuronale e propagazione del segnale assonale

La stampa 3D su scala micrometrica consente la prototipazione rapida di dispositivi polimerici per colture cellulari neuronali. Come prova di principio, le connessioni strutturali tra i neuroni sono state vincolate creando barriere e canali che influenzano la crescita dei neuriti, mentre le conseguenze funzionali di tale manipolazione sono state osservate dall'elettrofisiologia extracellulare.

Stampa 3D a polimerizzazione a due fotoni di dispositivi di coltura cellulare neuronale su microscala

Qui, impieghiamo l'HD-MEA per approfondire le dinamiche computazionali di insiemi neuronali su larga scala, in particolare nell'ippocampo, nei circuiti del bulbo olfattivo e nelle reti neuronali umane. L'acquisizione dell'attività spazio-temporale, combinata con strumenti computazionali, fornisce informazioni sulla complessità dell'insieme neuronale. Il metodo migliora la comprensione delle funzioni cerebrali, identificando potenzialmente biomarcatori e trattamenti per i disturbi neurologici.

Registrazione e analisi della dinamica di ensemble neuronali multimodali su larga scala su array di microelettrodi ad alta densità integrati in CMOS

Questo protocollo mira a placcare stabilmente assembloidi fusi dorsale-ventrale su array multi-elettrodi per modellare l'epilessia in vitro.

Una piattaforma di array multi-elettrodo per la modellazione dell'epilessia utilizzando assembloidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Scopri come costruire reti neuronali tridimensionali accoppiate a microelettrodi (MEA) usando microsfere di vetro come scaffold. Questo modello in vitro offre connettività avanzata per studi elettrofisiologici.

Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo

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