Name: 3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Scopri la coltura di condrociti articolari umani in idrogel 3D biomimetici per ingegneria tissutale. Questo metodo supporta espansione cellulare e maturazione per rigenerazione cartilaginea.

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Gli autori ringraziano il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica di Stanford e la Stanford Coulter Translational Seed Grant per il finanziamento. J.H.L. ringrazia la National Science Foundation Graduate Fellowship e la DARE Doctoral Fellowship per il supporto.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dei soggetti Stanford University Umani e approvati protocollo Institutional Review Board. Isolamento 1. articolare di condrociti <ol><li> Ottenere la cartilagine da tessuti scartati durante protesi totale di ginocchio e sezionare come descritto in precedenza 8. </li><li> Visivamente selezionare i condili femorali mediale o laterale di campioni di cartilagine per superfici lisce e rendere incisione alla superficie della cartilagine attraverso un bisturi per rimuovere 4-5 biopsie mm cartilagine senza influenzare l&#39;osso subcondrale. </li><li> Isolare condrociti dalla matrice extracellulare per dissociazione enzimatica del tessuto con il trattamento / N O con collagenasi purificata. Utilizzare rapporto 1: 1 di collagenasi II (125 U / ml) e Collagenasi IV (160 U / ml) in terreni di coltura di condrociti a 37 ° C. </li><li> Il giorno seguente, filtrare il tessuto digerito contenente le cellule dissociate attraverso un 70mm pori maglie di dimensione nylon. Lavare due volte con 20 ml di DMEM / F12 e centrifugare a 600 xg per 5 min. </li><li> Piastra le condrociti isolati ad una densità di 1 x 10 6 cellule / 60 mm piatto di coltura dopo risospensione in DMEM / F12 addizionato con 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 25 mg / ascorbato ml, 2 mM L-glutammina, antimicrobici (100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,25 mg / ml Fungizone). Conservare le piastre a 37 ° C e mantenere le colture di condrociti primari come un monostrato alta densità prima incapsulamento in idrogel biomimetici. </li></ol> 2. Biomimetic Hydrogel Fabrication NOTA: Questo metodo permette la sintesi di un idrogel biomimetico contenente poli (etilene glicol diacrilato) (PEGDA, MW 5000 g / mole), condroitin solfato-metacrilato (CS-MA) in DPBS. L&#39;aggiunta di fotoiniziatore permette reticolazione fotoattivato. La composizione idrogel finale contiene il 7% pesaret / Volume (w / v) di PEGDA, 3% w / v di CS-MA, e 0,05% w / v di fotoiniziatore. <ol><li> Sintetizzare CS-MA per funzionalizzazione CS polimero con gruppi di metacrilato. <ol><li> Preparare la soluzione tampone di 50 mM di acido 2-morpholinoethanesulfonic (MES) e 0,5 M di cloruro di sodio (NaCl) sciogliendo 1,952 g di MES e 5,84 g di NaCl in 200 ml di acqua deionizzata (DIH 2 O). Sciogliere 5 g di sale di condroitin solfato sodico nella soluzione tamponata. </li><li> Aggiungere 0,532 g (4,62 mmol) N-idrossisuccinimmide (NHS) e 1.771 g (9.24 mmol) 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) cloridrato -carbodiimide (EDC) (rapporto molare di NHS: EDC = 1: 2) a la soluzione e mescolare per 5 min. </li><li> Aggiungere 0,765 g (4,62 mmol) metacrilato di 2-amminoetil (Aema) (rapporto molare di NHS: EDC: Aema = 1: 2: 1) alla soluzione e mantenere la reazione a temperatura ambiente per 24 ore. </li><li> Purificare il composto con la dialisi contro acqua deionizzata (diH 2 O) per 4 giorni usando tubo di dialisi (12-14 kDa MWCO). </li><li> Filtrare la purified soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e posizionare i tubi aperti contenenti la soluzione in un essiccatore sotto vuoto e O / N. Assicurarsi che tutti i tubi siano protetti dalla luce. Conservare il polimero sciolto a -20 ° C al riparo dalla luce e dall&#39;umidità. </li></ol></li></ol> Incapsulamento 3. cellulare <ol><li> Autoclave i film e cilindrici aste PCR (per punzonatura gli idrogel 3D cell-carico) e sterilizzare lo stampo gel cilindrica su misura per immersione in 0,2 micron filtrato etanolo al 70% in cappuccio coltura tissutale sotto raggi UV. </li><li> Sigillare il fondo dello stampo gel con pellicola PCR autoclave senza bolle d&#39;aria o lacune per impedire perdite. Tenerlo in una piastra sterile, 150 millimetri. </li><li> Il giorno prima di incapsulamento delle cellule in idrogel biomimetica, dissociare il condrociti monostrato ad alta densità con trattamento O / N in Collagenase II e soluzione Collagenasi IV. Utilizzare 125 U / ml per Collagenasi II e 160 U / ml per Collagenasi VI ciascuno in crescita di condrociti dei mediaa 37 ° C. </li><li> Dai tubo da 50 ml e si aggiungono 5% peso / volume (w / v) di poli (etilene glicol diacrilato) (PEGDA, MW = 5,000 g / mole), 3% w / v condroitin solfato-metacrilato (CS-MA), e 0.05% w / v fotoiniziatore in DPBS. Agitare la provetta per miscelare la soluzione e tenerlo da parte. Proteggere il tubo dalla luce. </li><li> Raccogliere le cellule dissociate in un tubo Falcon da 50 ml, contare e centrifugare a 460 xg per 5 min. Aspirare tutti i media dal tubo cellule e aggiungere il materiale sopra il gel miscelato risospendere le cellule ad una densità di 15 × 10 6 cellule / ml. Mescolare 30 volte a fondo, evitando la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Dispensare 72 ml di sospensione cellulare-idrogel o da soli idrogel nello stampo gel cilindrica su misura e indurre gelificazione attraverso l&#39;esposizione alla luce UV (365 nm) a 3 mW / m 2 per 5 min. Preparare una soluzione idrogel senza contenuto della cella. Utilizzare questi costrutti come controlli negativi per il futuro i test biochimici e meccanici. Misure l&#39;intensità della luce UV con un misuratore di intensità UV. Per regolare l&#39;intensità, modificare la distanza tra la sorgente di luce UV e il ponteggio idrogel durante la gelificazione. NOTA: Dal momento che l&#39;idrogel contiene CS, il contributo acellulare viene sottratto dal contenuto GAG biochimica degli idrogel cellulari carichi di rappresentare solo il GAG cellulare. </li><li> Utilizzare un bisturi per tagliare il film per easy peel e rimuovere con cautela. Con l&#39;aiuto delle aste cilindriche, spingere fuori il gel in una piastra ben 6 con 5 ml di DPBS sterili per lavare gel polimerizzato e cellule allentati. </li><li> Culture idrogel cellulari carichi in piastre da 24 pozzetti contenenti 1,5 ml di terreni di crescita di condrociti in ogni pozzetto. Utilizzare una spatola monouso per trasferire i idrogel lavati nel pozzo. </li><li> Valutare la vitalità cellulare del morto in diretta colorazione 24 ore post-incapsulamento utilizzando un kit di sopravvivenza / citotossicità. Cultura idrogel cellulari carichi e gli idrogeli vuote per 3-6 settimane che cambiano a gro chondrocyte freschiwth dei media ogni 2 giorni prima della raccolta per le analisi. </li></ol> 4. RNA Estrazione e Gene Expression analisi <ol><li> Aspirare accuratamente la memoria e poi PBS sterile 1X sulla cellula-carico nonché gli idrogeli controllo vuote. </li><li> Con l&#39;aiuto di una spatola sterile, trasferire ogni idrogel di clean 1,5 ml provetta Eppendorf e aggiungere 250 ml di Tri-reattivo ad ogni provetta. Seguire le istruzioni del produttore per isolare l&#39;RNA. </li><li> Dopo l&#39;isolamento di RNA e quantificazione uso 1 mg di esso da ogni campione e di eseguire una trascrizione inversa in cDNA utilizzando l&#39;alta capacità cDNA corredo d&#39;inversione di trascrizione. </li><li> Per PCR quantitativa utilizzare TaqMan array di espressione genica per l&#39;esame dell&#39;espressione di geni di interesse. Normalizzare i livelli di espressione genica internamente per GAPDH. </li><li> Per le condizioni di PCR includere un 2 min di incubazione a 50 ° C per inattivare ampliconi precedenti con glicosilasi uracile-DNA, seguito da 1060; min di incubazione a 95 ° C per attivare la polimerasi Taq. Quindi eseguire cicli di PCR quaranta, costituito da 15 sec a 95 ° C, e 1 minuto a 60 ° C. </li></ol> 5. Analisi biochimiche <ol><li> Per ogni costruzioni cellulari-idrogel quantificare il DNA e glicosaminoglicani solfato (sGAG) la produzione come segue. </li><li> Aspirare accuratamente la memoria e poi PBS sterile 1X sulla cellula-carico nonché gli idrogeli controllo vuote. Pesare un tubo vuoto e mettere l&#39;idrogel all&#39;interno dopo assorbente su carta velina e registrare il peso o il peso umido degli idrogel. </li><li> Congelare ogni idrogel a -20 ° C in un tubo separato ml eppendorf 1.5 per digestione enzimatica e successivamente utilizzare una aliquota di prodotto digerita eseguire PicoGreen dosaggio (DNA) e dimetil-metilene assay blu (GAG). </li><li> Preparare la soluzione papainase per digestione enzimatica degli idrogel. <ol><li> Per prima cosa preparate il buffer PBE pesando 7,1 g di sodio phosphate bibasico (Na 2 HPO 4) e 1,6 g di acido etilendiamminotetracetico disodico sale (EDTA-Na 2). Sciogliere in 500 ml di dH 2 O, regolare il pH a 6,5 e filtrare la soluzione purificata attraverso un filtro 0.22 mm. </li><li> Sciogliere 0,035 g di L-cisteina in 20 ml di tampone PBE. Filtrare la soluzione e 100 ml di sterile papaina enzima. </li></ol></li><li> Al momento di eseguire saggi, prendere le provette da -20 ° C e aggiungere 300 microlitri della soluzione papaina pronto a idrogel congelati. Schiacciare il gel con un mortaio e pestello e mescolare bene con il pestello motore. </li><li> Portare il volume a 500 ml con soluzione papaina aggiuntivo. Eseguire la stessa procedura per i gel di controllo. Incubare a 60 ° C per 16 ore 3,9. La soluzione contenente l&#39;idrogel digerito può quindi utilizzato per il DNA e GAG ​​quantificazione. Misurare il contenuto di DNA con il saggio PicoGreen con Lambda fago DNA di serie seguente pr del produttoreotocol. </li><li> Quantificare il contenuto solfato-GAG utilizzando il blu 1,9-metilmetilene (DMMB)-dye legame test con squalo condroitin solfato di serie 10. Determinare il contenuto di GAG dividendo l&#39;importo di GAG per la corrispondente peso umido. </li></ol> 6. Prove meccaniche <ol><li> Eseguire prove di compressione non confinati usando un sistema di prova Instron 5944 dotato di una cella di carico di 10 N. <ol><li> Dopo i giorni desiderati di coltura in vitro, eseguire il test di compressione sull&#39;impalcatura cellula-idrogel e gli idrogeli controllo acellulari. </li><li> Immergere i campioni in un bagno PBS a temperatura ambiente e comprimere ad un tasso del 1% ceppo / sec per un ceppo massimo del 15% 11,12 dal momento che la sforzo fisico vissuta da tessuto cartilagineo sotto condizioni di carico è stato segnalato per essere 10-20% 13,14. </li></ol></li><li> Creare lo stress contro curve deformazione e la curva in forma con un terzo ordine un&#39;equazione polinomiale. Determinare i compressive tangente modulo dalla curva equazione forma in valori di deformazione del 15%. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Come riportato in questo protocollo, gli idrogel 3D sono in grado di mantenere condrociti fenotipo nella cultura, evitando il processo di de-differenziazione delle cellule in cellule fibrocartilagine riscontrate in genere con colture monostrato 15. Inoltre, le colture a lungo termine di idrogel costrutto chondrocytes- rivelato un ambiente favorevole che mantiene le caratteristiche intrinseche delle cellule associate con l&#39;età e la malattia. L&#39;uso di un idrogel biomimetico 3D ha diversi vantaggi. In primo luogo, l&#39;inclusione di condroitin solfato (CS), uno dei principali componenti trovati nella cartilagine articolare, attivare le cellule di degradare la matrice idrogel secernendo condroitinasi e stabilire la cartilagine nuova sintesi extracellulare matrice 5, 16. Inoltre, CS è stato dimostrato per avere proprietà anti-infiammatorie nel giunto artritico. L&#39;idrogel biomimetico può anche essere usato come materiale per la consegna ponteggio cella riparazione della cartilagine, e può essere modificato chimicamenteper facilitare una migliore integrazione dei tessuti 17,18-biomateriale. L&#39;uso degli idrogel PEG-CS consente colture a lungo termine di condrociti e la valutazione delle proprietà biochimiche e meccaniche. Qui mostriamo come questa piattaforma può essere utile per le analisi comparative delle varie fonti di condrociti differenziati al fine di definire il tipo cellulare ottimale per l&#39;ingegneria cartilagine. È interessante notare che, condrociti incapsulate in idrogel rimangono vitali e proliferano in base alle loro capacità intrinseche. I supporti composizione idrogel, infatti, la crescita di giovani e adulti condrociti sani come mostrato in Figura 2. La composizione e la struttura degli idrogel descritti promuove anche la formazione di tessuto cartilagineo come indicato dalla deposizione di matrice extracellulare funzionale valutata glicosaminoglicani (GAG ) quantificazione. Un ulteriore vantaggio è che i costrutti chondrocyte-idrogelpuò essere valutata per le proprietà meccaniche del tessuto cartilagineo neoformato. Si noti che il test di compressione non confinato dovrebbe essere eseguita sul idrogel acellulare per il confronto. Gli idrogeli, infatti, hanno una rigidità intrinseca dovuta alla rigidità delle porzioni CS. Ceppo compressione unconfined del 5-20% (a velocità di deformazione 1% / s) può essere applicato per la prove meccaniche della cartilagine tessuto 11,12 in quanto il ceppo fisiologico sperimentato da tessuto cartilagineo sotto condizioni di carico è stato segnalato per essere 10-20 13,14%. La risposta delle cellule sia carichi e acellulari idrogel a prove meccaniche è stata valutata al punto finale cultura. Nell&#39;esempio descritto sopra osservato una rigidità paragonabile dei costrutti contenenti adulti e giovanili condrociti in contrasto con la rigidità inferiore dei costrutti contenenti condrociti OA. Tali proprietà meccaniche del costrutto cellule idrogel permettono la valutazione delle proprietà funzionali deltessuto formata dando una analisi approfondita della capacità maturazione delle cellule. In conclusione, l&#39;utilizzo degli idrogel biomimetici 3D per studiare il potenziale della popolazione condrociti diverso per generare tessuto cartilagineo può essere ampiamente applicato. Oltre agli studi in vitro qui descritti, trapianto in vivo dei costrutti cellulari carichi può essere prevista per studiare la maturazione delle cellule e potenziale rigenerativo nel contesto fisiologico. Ulteriori modifiche della piattaforma idrogel con ulteriori fattori biomimetici possono anche essere immaginato per ottimizzare la proliferazione di condrociti e maturazione.

Con il suo limitato potenziale di autoriparazione, la cartilagine articolare umana subisce frequenti danni irreversibili. Ampi sforzi sono attualmente concentrati sullo sviluppo di approcci cellulari efficienti per il trattamento delle lesioni della cartilagine articolare. Il successo di queste terapie cellulari dipende fortemente dalla selezione di una fonte cellulare ottimale e dal mantenimento del suo potenziale rigenerativo. I condrociti sono una fonte cellulare comune per la riparazione della cartilagine, ma sono limitati nell'offerta e possono de-differenziarsi durante l'espansione in vitro in coltura monostrato 2D, limitando così la loro generazione di cartilagine ialina 1. 
Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire una piattaforma di idrogel tridimensionale per uno studio comparativo in vitro di condrociti umani di diverse età e stati patologici. A differenza della coltura bidimensionale (2D) convenzionale, gli idrogel tridimensionali (3D) consentono ai condrociti di mantenere la loro morfologia e fenotipo e forniscono un ambiente fisiologicamente rilevante che consente ai condrociti di produrre tessuto cartilagineo 2,3. Oltre a fornire una struttura fisica 3D per la coltura dei condrociti, gli idrogel imitano la funzione della matrice extracellulare nativa della cartilagine (ECM). In particolare, l'inclusione di condroitina solfato metacrilato fornisce un potenziale serbatoio per i fattori paracrini secreti 4 e consente la degradazione cellulo-mediata e il turnover della matrice 5. Sebbene molti sistemi di coltura di idrogel 3D siano stati ampiamente utilizzati in vari studi, tra cui gel di agarosio e alginato, abbiamo utilizzato un sistema di coltura 3D biomimetico che presenta alcuni vantaggi distinti per la coltura di condrociti. Il condroitina solfato (CS) è un componente abbondante nella cartilagine articolare e gli idrogel PEG-CS hanno dimostrato di mantenere e persino migliorare il fenotipo condrogenico e di facilitare la degradazione e il turnover della matrice cellulo-mediata 2,5. Inoltre, le proprietà meccaniche dell'impalcatura in idrogel possono essere facilmente modulate modificando la concentrazione di PEG e quindi possono essere utilizzate per migliorare ulteriormente il potenziale di rigenerazione dei condrociti o di un tipo di cellula correlata 6,7. Il PEG/CSMA è anche biocompatibile e quindi ha il potenziale per un'applicazione clinica diretta nei difetti della cartilagine, ad esempio. Il limite di questo sistema è la sua complessità e l'uso della fotopolimerizzazione che può potenzialmente influenzare la vitalità cellulare rispetto a sistemi più semplici come l'agarosio, tuttavia i vantaggi per la coltura di condrociti superano i potenziali limiti.
La coltura di idrogel 3D è compatibile con il test convenzionale per la valutazione del fenotipo cellulare (espressione genica, immunocolorazione proteica) e dell'esito funzionale (quantificazione della produzione di matrice cartilaginea, test meccanici). Questo ambiente 3D favorevole è stato testato per confrontare il potenziale di rigenerazione tissutale dei condrociti umani di tre diverse popolazioni di età in colture 3D a lungo termine. 
I risultati sono stati valutati tramite saggi fenotipici e funzionali. I condrociti giovanili, adulti e OA hanno mostrato risposte differenziali nella coltura di idrogel biomimetico 3D. Dopo 3 e 6 settimane, l'espressione genica condrogenica era sovraregolata nei condrociti giovanili e adulti, ma era sottoregolata nei condrociti OA. La deposizione di componenti del tessuto cartilagineo, tra cui l'aggrecano, il collagene di tipo II e il glicosaminoglicano (GAG), era elevata per i condrociti giovani e adulti, ma non per i condrociti OA. Anche i moduli compressivi dei costrutti di cartilagine risultanti hanno mostrato tendenze simili. In conclusione, sia i condrociti giovani che quelli adulti hanno mostrato una disposizione della matrice condrogenica e cartilaginea fino a 6 settimane di coltura 3D in idrogel. Al contrario, i condrociti osteoartritici hanno rivelato una perdita del fenotipo della cartilagine e una capacità minima di generare una cartilagine robusta.

<table><tbody><tr><td>condrociti giovanili (Clonetici Sistema cellulare di condrociti umani normali)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>condrociti adulti (Clonetici Sistema cellulare di condrociti umani normali)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>poli(etilenglicole diacrilato)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>acido 2-morfolinoetansolfonico</td><td>Sigma</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>fotoiniziatore</td><td>Irgacure</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>condroitina solfato sale sodico</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-idrossisuccinimide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)-carbodiimmide cloridrato</td><td>Sigma</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-amminoetilmetacrilato</td><td>Sigma</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>tubi per dialisi</td><td>Spectrum Laboratories&nbsp;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi 2</td><td>Worthington Biochimico&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004177</tr><tr><td>Collagenasi 4</td><td>Worthington Biochimico&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004189</tr><tr><td>Terreni DMEM/F12</td><td>HyClone, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH3002301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>test vivo/morto</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td><td></td></tr><tr><td>Tri reagente</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Sale disodico dell'acido etilendiamminotetraacetico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-dimetilmetilene blu&nbsp;</td>Apparecchiature a luce UV <td>Sigma</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Lampada da banco XX-15LW, 365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di test Instron 5944&nbsp;</td><td>Instron Corporation</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

3d hydrogel ponteggi per articolare condrociti, cultura e cartilagine generation

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

La cartilagine articolare umana è altamente suscettibile ai danni e ha un limitato potenziale di autoriparazione e rigenerazione. Le strategie basate sulle cellule per ingegnerizzare il tessuto cartilagineo offrono una soluzione promettente per riparare la cartilagine articolare. Per selezionare la fonte cellulare ottimale per la riparazione dei tessuti, è importante sviluppare una piattaforma di coltura appropriata per esaminare sistematicamente le differenze biologiche e biomeccaniche nella cartilagine ingegnerizzata dai tessuti da parte di diverse fonti cellulari. Qui abbiamo applicato una piattaforma di coltura di idrogel biomimetico tridimensionale (3D) per esaminare sistematicamente il potenziale di rigenerazione della cartilagine dei condrociti giovanili, adulti e osteoartritici (OA). L'idrogel biomimetico 3D è costituito da un componente sintetico di poli(glicole etilenico) e da un componente bioattivo condroitin solfato, che fornisce un microambiente fisiologicamente rilevante per la coltura in vitro di condrociti. Inoltre, lo scaffold può essere potenzialmente utilizzato per la consegna di cellule per la riparazione della cartilagine in vivo. Il tessuto cartilagineo ingegnerizzato nello scaffold può essere valutato utilizzando l'espressione genica quantitativa, la colorazione in immunofluorescenza, i saggi biochimici e i test meccanici. Utilizzando questi risultati, siamo stati in grado di caratterizzare il potenziale rigenerativo differenziale dei condrociti di età variabile, sia a livello di espressione genica che nelle proprietà biochimiche e biomeccaniche del tessuto cartilagineo ingegnerizzato. Il modello di coltura 3D potrebbe essere applicato per studiare le differenze molecolari e funzionali tra i condrociti e le cellule progenitrici da diversi stadi di sviluppo normale o aberrante.

Idrogel bioattivi contenenti PEG e frazioni CS (Figura 1) rappresentano una piattaforma ideale per la cultura e la maturazione dei condrociti articolari umani 2,3,5,7. I condrociti di diverse epoche e stati patologici possono essere coltivati ​​con il metodo descritto ed analizzati per la loro fenotipo, espressione genica e proprietà biochimiche e meccaniche del tessuto cartilagineo generato. Tre campioni chondrocyte, juvenile- 6 mesi, adulto-34 anni e osteoarthritic- 74 anni, sono state raccolte dopo 3 settimane di coltura in 3D idrogel biomimetici. Analisi dell&#39;espressione genica di condrociti normali, sia giovani che adulti, hanno mostrato un aumento dell&#39;espressione dei geni COL2A1 e COL6A1 condrociti. Al contrario, condrociti malate mostrato una diminuzione drammatica COL2A1 mantenendo l&#39;espressione di Col6a1 (Figura 2) mostra una perdita di fenotipo condrogenica pur essendo coltivate in un ambiente biomimetico favorevole. Gli idrogel CS-PEG servono anche come un ambiente dinamico per i condrociti a proliferare, digerire la matrice preesistente di PEG e CS e depositano la loro matrice pericellulare e extracellulare, i principali componenti del tessuto cartilagineo maturo. Alla luce di queste capacità, espansione di condrociti dopo 3 settimane di coltura in vitro può essere stimato per la quantificazione del DNA con il colorante PicoGreen. Analisi comparativa dei tre gruppi di cellule mostrano che la densità cellulare di giovani e adulti popolazioni è rimasto invariato mentre condrociti OA hanno mostrato una diminuzione drammatica rispetto al giorno 1 di cultura. Stata anche osservata una perdita del contenuto di DNA per OA ma non altre condrociti suggerendo possibile morte delle cellule durante la coltura a lungo termine (Figura 3). La matrice secreta è stato quantificato come contenuto solfato-GAG per DMMB test-dye vincolante nella fase punto finale dopo 3 settimane di culture. Contenuto GAG è normalizzata per il peso umido del idrogel come recorded prima della digestione enzimatica e il contributo acellulare viene sottratto. Come mostrato in figura 4, condrociti depositato un&#39;analoga quantità significativa di GAG per 3 settimane di coltura in idrogel 3D. La presenza di un ponteggio fisica consente la valutazione delle proprietà biomeccaniche dei campioni attraverso unconfined prove di compressione 2,3. Mentre idrogel acellulari subiscono una diminuzione della moduli compressione, costrutti cellulari carichi mantenuti i moduli di compressione dopo 3 settimane in coltura (Figura 4). Il fenotipica, analisi biochimiche e biomeccaniche qui descritte sono quindi utili per valutare e comprendere le potenzialità di diverse popolazioni di condrociti per l&#39;ingegneria cartilagine. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> Figura 1. PEG-CS idrogel biomimetici per 3D condrociti cultura. condrociti sono risospesi in una miscela contenente poli (glicole etilenico diacrilato) (PEGDA) e condroitin solfato-metacrilato (CS-MA) e colato nello stampo gel cilindrica su misura. Dopo l&#39;esposizione ai raggi UV, solidificati gel sono raccolti dagli stampi e vitalità cellulare è valutata mediante colorazione morto dal vivo 24 ore post-incapsulamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> Figura 2. Espressione dei geni condrogeniche in condrociti umani coltivati ​​in 3D idrogel biomimetici. Espressione genica quantitativa di marker cartilagine COL2A1 e Col6a1 da giovani, adulti e OA condrociti dopo 3 settimane di coltura in 3D idrogel biomimetici. I valori sono normalizzati a livello di espressione genica a giorno 1. Errore bars rappresentano media ± SD. * p &lt;0,05 come determinato da un test t Student a due code. Modificato da Smeriglio e coll. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> Figura 3. contenuto di DNA in condrociti umani coltivati ​​in idrogel biomimetici 3D. Quantificazione del DNA da PicoGreen test in giovani, adulti e OA condrociti dopo 3 settimane di coltura in 3D idrogel biomimetici. I valori sono normalizzati a livello del DNA a giorno 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; Figura 4. Misurazione del contenuto di GAG e test di compressione non confinato di condrociti umani in giorno 1 e dopo 3 settimane di cultura in 3D idrogel biomimetici. (A) GAG quantificazione mediante test DMMB in condrociti al giorno 1 e dopo 3 settimane di cultura idrogel biomimetici 3D. I valori sono normalizzati a bagnare peso (ww) ed espressi in mg / g. (B) modulo di compressione (kPa) di acellulari e cellulari carichi di idrogel a giorno 1 e dopo 3 settimane di cultura in 3D idrogel biomimetici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

La riparazione della cartilagine rappresenta una sfida medica insoddisfatta e gli approcci basati sulle cellule per ingegnerizzare la cartilagine articolare umana sono una soluzione promettente. Qui, descriviamo gli idrogel biomimetici tridimensionali (3D) come uno strumento ideale per l'espansione e la maturazione dei condrociti articolari umani.

3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una coltura tridimensionale in idrogel biomimetico per espandere i condrociti articolari e generare cartilagine articolare umana. Questo risultato si ottiene innanzitutto dissezionando i condili femorali ottenuti da artroplastica totale del ginocchio, rimuovendo il tessuto cartilagineo dall'osso subcondrale e isolando i condrociti dalla matrice extracellulare mediante dissociazione enzimatica. Il secondo passaggio consiste nella sintesi del polimero di metacrilato di condroitina solfato per la fabbricazione di un idrogel biomimetico.Successivamente, i condrociti vengono incapsulati in idrogeli biomimetici 3D e le strutture vengono coltivate per tre-sei settimane in vitro. Infine, si possono ottenere risultati che dimostrano la crescita e la maturazione dei condrociti articolari mediante test biochimici e meccanici. Il principale vantaggio dell'utilizzo di una piattaforma 3D a idrogel biometrico per la coltura dei condrociti è che fornisce un microambiente fisiologicamente rilevante poiché incorpora i componenti nativi della cartilagine.Questo è il vantaggio che i condrociti possono mantenere la loro fisiologia e fenotipo per un periodo di tempo più lungo. L'inclusione di un polimero bioattivo, il chondroitin superficiale, nell'idrogel tridimensionale consente metriche e turnover di degradazione mediate dai condrociti. Inoltre, le proprietà meccaniche e biochimiche della matrice idrogel possono essere facilmente modificate.Questa tecnica è compatibile con saggi convenzionali per valutare il fenotipo cellulare e l'esito funzionale. Può essere utilizzata per studiare caratteristiche intrinseche dei condrociti associate a stadi avanzati della malattia e per valutare la maturazione cellulare e il potenziale rigenerativo in un contesto fisiologico. Per iniziare, preparare il mezzo di dissociazione mescolando una parte di collaghenasi due a 125 unità per millilitro con una parte di collaghenasi quattro a 160 unità per millilitro in mezzo di crescita per condrociti, utilizzando tessuto cartilagineo fresco che normalmente viene scartato durante una artroplastica totale del ginocchio.Prendere un bisturi sterile e prelevare una biopsia dalla superficie liscia di uno dei condili femorali. Quindi affettare la biopsia in fette sottili. Aggiungere le fette di cartilagine al mezzo di dissociazione combinato in un rapporto di uno a tre in volume e collocare la piastra a 37 gradi Celsius durante la notte per rilasciare i condrociti dalla matrice extracellulare il giorno seguente.Filtrare il tessuto digerito contenente le cellule dissociate attraverso una maglia in nylon da 70 micron. Quindi lavare le cellule due volte con 20 millilitri di D-M-E-M-F 12 pre-riscaldato, centrifugare le cellule a 600 G per cinque minuti. Successivamente, contare i condrociti isolati su una piastra emocitometrica.1 milione di cellule in una piastra da coltura da 60 millimetri e ricoprire con mezzo D-M-E-M-F 12 integrato. Mantenere le colture primarie di choy come un monostrato ad alta densità seguendo le tecniche di coltura standard. Sintetizzare il metacrilato di condroitina solfato aggiungendo 1,952 grammi di due morfo et etano sol acido e 5,84 grammi di cloruro di sodio in 200 millilitri di acqua deionizzata e agitare la soluzione fino a completo scioglimento.Successivamente, sciogliere cinque grammi di sale sodico di solfato di condroitina nella soluzione tampone. Quindi aggiungere 0,532 grammi di N-idrossi CIN ammide e 1,771 grammi di cloridrato di uno etil tre tre dimetil amino propil carboido alla soluzione e mescolare per cinque minuti. Una volta sciolto, aggiungere 0,765 grammi di due amino etil metacrilato alla soluzione e mantenere la reazione a temperatura ambiente per 24 ore, coperto con carta d'alluminio.Purificare la miscela finale mediante dialisi contro acqua deionizzata per quattro giorni, utilizzando tubi da dialisi con cutoff di peso molecolare da 12 a 14 kilodalton. Successivamente filtrare la soluzione purificata attraverso un filtro da 0,22 micron e congelare a meno 20 gradi Celsius. Collocare i tubi aperti contenenti la soluzione in un desiccante.Proteggerli dalla luce coprendoli con della carta d'alluminio ed applicare il vuoto per tutta la notte. Conservare il polimero disciolto a meno 20 gradi Celsius in provette Falcon, avvolte con pellicola trasparente e carta d'alluminio per proteggerle da luce e umidità il giorno precedente all'incapsulamento cellulare. Rimuovere il mezzo di coltura dai citi coltivati e coprire le cellule con del mezzo di dissociazione.Incubare le cellule nella soluzione di collaghenasi tutta la notte a 37 gradi Celsius. Autoclavare la pellicola PCR e le bacchette cilindriche, quindi sterilizzare lo stampo cilindrico per gel su misura immergendolo in etanolo al 70% filtrato attraverso un filtro da 0,2 micron, posizionato all'interno di una cappa a flusso laminare sotto luce UV per tutta la notte. Il giorno seguente, rimuovere gli stampi dall'etanolo e lasciarli asciugare all'interno della cappa a flusso laminare. Successivamente, posizionare lo stampo in una piastra sterile da 150 millimetri. Una volta asciutti, sigillare la base degli stampi utilizzando la pellicola PCR autoclavata.Evitare bolle d'aria o spazi vuoti per prevenire perdite. Successivamente, prendere un tubo da 50 millilitri e aggiungere il 10% di condroitina solfato metacrilato preparato, il 10% di polietilene glicole diacrilato e il 5% peso/volume. Aggiungere l'iniziatore fotochimico in DPBS per ottenere una concentrazione finale rispettivamente del 3-5% e dello 0,05%.Proteggere il tubo dalla luce e vortexare brevemente la miscela. Raccogliere le cellule dissociate in un tubo falcon da 50 millilitri e quindi contarle utilizzando un emocitometro. Centrifugare le cellule a 460 ×g per cinque minuti e risospendere in seguito in materiale gel misto a una densità di 15 milioni di cellule per millilitro.Mescolare la soluzione 30 volte avendo cura di evitare la formazione di bolle. Successivamente, pipettare 72 microlitri della sospensione di idrogel cellulare o dell'idrogel da solo nel gel cilindrico su misura. Indurre la gelificazione esponendo i gel alla luce UV a 365 nanometri a tre milliwatt per metro quadrato per cinque minuti.Dopo che il gel è indurito, utilizzare un bisturi per tagliare la pellicola e rimuoverla con cura. Con l'aiuto delle bacchette cilindriche, spingere il gel in una piastra a sei pozzetti contenente cinque millilitri di DPBS sterile per eliminare qualsiasi gel non polimerizzato residuo e le cellule libere. Successivamente, trasferire gli idrogel lavati nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente 1,5 millilitri di mezzo di crescita Chondra site per ogni pozzetto.Incubare bene gli idrogeli a 37 gradi Celsius e cambiare il mezzo ogni due giorni. Valutare la vitalità cellulare mediante colorazione live/dead a 24 ore dall'incapsulamento, utilizzando tecniche standard di coltura, gli idrogeli caricati con cellule e gli idrogeli vuoti per un periodo compreso tra tre e sei settimane prima del prelievo e dell'analisi. Trascorso il numero desiderato di giorni di coltura in vitro, rimuovere i campioni dall'incubatore per eseguire il test di compressione sugli idrogel scaffold cellulari e sugli idrogeli di controllo acellulari.Posizionare i campioni uno alla volta a temperatura ambiente nel bagno di PBS collegato a un sistema di prova meccanica dotato di una cella di carico da 10 Newton, comprimendo a una velocità di 1% di deformazione al secondo fino a una deformazione massima del 15%. Per analizzare le prove meccaniche, creare curve di tensione rispetto alla deformazione per ciascun campione ed eseguire un adattamento della curva. Utilizzando un'equazione polinomiale del terzo ordine, determinare il modulo tangenziale a compressione dall'equazione di adattamento della curva a valori di deformazione del 15% dopo tre settimane di coltura. Nei gel idrici biomimetici 3D, l'analisi dell'espressione genica di condrociti normali, sia giovanili che adulti, ha mostrato un aumento dell'espressione dei geni dei condrociti collagene due A uno e collagene sei A uno. Al contrario, i condrociti malati hanno mostrato una drastica diminuzione del collagene due A uno pur mantenendo l'espressione del collagene sei A uno, indicando una perdita del fenotipo congenico nonostante la coltura in un ambiente biomimetico favorevole.L'espansione dei condrociti dopo tre settimane di coltura può essere stimata mediante la quantificazione del DNA con il colorante pico green. L'analisi comparativa dei tre gruppi cellulari mostra che la densità cellulare delle popolazioni juvenile e adulta è rimasta invariata, mentre i condrociti osteoartrosici hanno mostrato una diminuzione drammatica rispetto al primo giorno di coltura. La matrice condrocitaria secreta è stata quantificata come contenuto di GAG solfati dopo tre settimane di coltura.Come mostrato qui, i condrociti hanno depositato una quantità significativa di GAG durante tre settimane di coltura, il che potrebbe aver contribuito al miglioramento delle proprietà meccaniche degli idrogel caricati con cellule rispetto ai controlli. Oltre ad applicare questa procedura per studi individuali, il modello di coltura in idrogel biomimetico 3D può essere facilmente tradotto in un modello di difetto cartilagineo a tutto spessore e utilizzato per caratterizzare l'esito funzionale e biochimico nella rigenerazione a lungo termine della cartilagine articolare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare condrociti umani da campioni articolari del ginocchio e produrre impalcature in idrogel tridimensionali per la coltura a lungo termine e la generazione di colture. L'utilizzo degli idrogel 3D OME ci permetterà, e permetterà ad altri ricercatori, di confrontare il potenziale condrogenico di diverse popolazioni di condrociti maturi, nonché di nuove popolazioni di cellule staminali e progenitrici.In futuro, queste tecniche potranno essere estese per incorporare ulteriori fattori mimetici al fine di formulare uno scaffold ottimale che possa essere utilizzato per la rigenerazione e la riparazione della cartilagine.

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Bioingegneria

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Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

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La stimolazione meccanica di condrociti-agarosio idrogel

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Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

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Layered alginato costrutti: Una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee

Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

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Preparazione di idrogeli iniettabili a base di chitosano e la sua applicazione nella coltura cellulare 3D

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Questo studio descrive un metodo per la produzione di sferoidi condrocitici aggregando le cellule in sferoidi in condizioni di bassa adesione utilizzando la gravità, seguita dalla coltura degli sferoidi risultanti in mini-bioreattori.

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Scopri la coltura di condrociti articolari umani in idrogel 3D biomimetici per ingegneria tissutale. Questo metodo supporta espansione cellulare e maturazione per rigenerazione cartilaginea.

3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation

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