Motore e ippocampale Dependent apprendimento spaziale e valutazione della memoria di riferimento in un transgenici ratto modello di malattia di Alzheimer con ictus

L'obiettivo generale di questi test comportamentali è valutare la funzione motoria, nonché le prestazioni nell'apprendimento spaziale e nella memoria in un nuovo modello ratto comorbido di malattia di Alzheimer e ictus. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della demenza, come ad esempio in che modo la patologia dell'ictus e della malattia di Alzheimer interagisca, producendo un fenotipo caratterizzato da un deficit motorio potenzialmente maggiore e da un declino cognitivo accelerato. Il principale vantaggio di queste tecniche consiste nel fatto che permettono di testare un'ampia gamma di funzioni cerebrali, risultando al contempo facili da eseguire, economiche ed adatte a test ripetuti in momenti successivi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla prevenzione della demenza dopo un ictus, poiché nuovi composti preventivi possono essere testati per la loro capacità di migliorare il fenotipo comportamentale comorbido. Per iniziare, posizionare uno specchio a un angolo di 45 gradi al di sotto di un apparato cilindrico precedentemente montato. Successivamente, fissare una videocamera su un treppiede e posizionarla a una distanza di circa 50 centimetri dall'apparato.

Verificare che l'intero diametro del cilindro presente nello specchio sia visibile sulla telecamera. Successivamente, scegliere un ratto acclimatato e su un foglio bianco annotare il numero dell'animale e ulteriori informazioni relative alla prova. Posizionare questo foglio davanti allo specchio e quindi premere il tasto di registrazione sulla videocamera.

Continuare afferrando il ratto alla base della coda e posizionandolo nel cilindro. Quindi fissare il coperchio dell'apparecchiatura e rimuovere la lavagna bianca in modo che non ostruisca più lo specchio. Una volta rimossa la lavagna bianca, procedere a filmare l'animale per cinque minuti, un periodo che costituisce una singola prova.

Al termine di questo periodo, interrompere la registrazione, riportare il ratto nella sua gabbia di mantenimento e pulire il cilindro con tovaglioli di carta e acqua. Quindi ripetere i passaggi precedentemente descritti altre due volte, per ottenere un totale di tre prove per ogni ratto. Una volta raccolti i dati per tutti i ratti, importare i file della videocamera in un programma di editing video e procedere a quantificare il numero di contatti con tutti e quattro gli arti come descritto nel protocollo testuale.

Posizionare innanzitutto due scaffalature a circa 100 centimetri di distanza l'una dall'altra davanti a una parete nera. Successivamente, utilizzare del nastro adesivo per fissare le estremità di una trave di legno precedentemente ottenuta agli scaffali, in modo che vi sia circa un metro di legno senza supporto tra di essi. Quindi, posizionare una videocamera su un treppiede e sistemarla in modo che la telecamera inquadri l'intera lunghezza della trave.

Procedere scegliendo un ratto che ha completato una sessione di addestramento sulla passerella e registrarne il numero e ulteriori informazioni relative alla prova su una lavagna bianca. Al termine, fissare con del nastro la lavagna bianca al muro dietro la passerella. Continuare posizionando la gabbia di casa dell'animale e un tubo per arricchimento ambientale, che funge da coda motivazionale in cui il ratto può entrare immediatamente dopo aver attraversato la tavola, a un'estremità della passerella.

Quindi premere il tasto di registrazione sulla videocamera. Immediatamente dopo, prendere il ratto alla base della coda e posizionarlo all'estremità opposta della trave, senza gabbia e tubo. Registrare l'animale fino a quando non avrà percorso con successo l'intera lunghezza della trave rialzata, momento che segna la fine della prova.

Se il ratto si ferma a metà del percorso sulla trave, toccare delicatamente la sua coda per incoraggiare il movimento. Una volta che l'animale ha completato il compito, spostare la sua gabbia di casa all'altra estremità della trave. Quindi modificare il numero della prova sulla lavagna bianca e ripetere la procedura come descritto in precedenza.

Dopo aver registrato tutte le prove sugli animali, importare i file della videocamera in un programma di editing video e analizzare il passo rilevante, le scivolate degli arti e i dati relativi alle cadute come descritto nel protocollo testuale. Iniziare posizionando una videocamera sopra il centro di una piscina circolare vuota. Quindi, delimitare i quattro quadranti della vasca posizionando del nastro lungo il bordo della piscina e allinearli correttamente con il contorno della vasca nel programma software di tracciamento.

Successivamente, riempire il serbatoio con acqua fino a una profondità di 36 centimetri, quindi aggiungere della vernice nera non tossica fino a quando il liquido diventa opaco, in modo da garantire che la piattaforma non sia visibile al di sotto della superficie dell'acqua e per visualizzare meglio i ratti bianchi. Una volta preparata la vasca, circondarla con superfici di parete bianche. Quindi preparare dei riferimenti spaziali ritagliando quattro forme di colori diversi da cartoncini rigidi.

Successivamente, fissare una forma a ciascuna delle pareti associate alle posizioni nord, sud, est e ovest della vasca. Per eseguire un esperimento di apprendimento spaziale, procedere posizionando una piattaforma circolare nel quadrante sud-ovest della vasca. Nel programma informatico associato, verificare che questa struttura sia allineata con un'area designata per la piattaforma all'interno del quadrante.

Procedere afferrando un ratto alla base della coda e posizionandolo delicatamente in un punto di partenza prestabilito nell'acqua, lungo la parete della vasca. Una volta che l'animale è nella vasca, spostarsi rapidamente fuori dal suo campo visivo e segnalare a un altro sperimentatore di avviare il software di tracciamento. Consentire al ratto di nuotare fino a quando non individua e sale sulla piattaforma.

A questo punto, l'altro ricercatore deve interrompere la prova sul computer. Lasciare l'animale sulla piattaforma per 30 secondi. Se il ratto non riesce a trovare la piattaforma entro il tempo assegnato alla prova, in questo caso 90 secondi, guidare l'animale verso la struttura e lasciarlo rimanere lì per 30 secondi.

Successivamente, sollevare il ratto alla base della coda e rimuoverlo dal labirinto, appoggiandolo su un asciugamano disposto su un braccio. Ripetere questa procedura altre tre volte per ogni animale con un intervallo inter-trial di 20 minuti, in modo che ciascun ratto completi un totale di quattro prove.

Una volta completato l'esperimento di apprendimento spaziale, rimuovere la piattaforma dalla vasca per iniziare le prove di sonda. Nel software, verificare che la posizione precedente della piattaforma, nel quadrante sud-ovest, rimanga definita. Quindi introdurre un ratto nella vasca.

Posizionarlo nell'acqua lungo la parete della vasca. Come in precedenza, allontanarsi immediatamente dalla vista dell'animale e istruire un altro sperimentatore ad avviare il software di tracciamento. Al termine della prova di 30 secondi, afferrare l'animale alla base della coda, rimuoverlo dalla vasca e quindi appoggiarlo su un braccio coperto con un asciugamano.

Ripetere questa procedura una settimana dopo. Una volta completati i test di apprendimento spaziale e le prove di sonda per tutti gli animali, analizzare i dati come descritto nel protocollo testuale. I dati sull'uso delle quattro zampe ottenuti dall'apparato del cilindro sono stati raccolti da ratti transgenici APP21 tre giorni prima e sette e venti giorni dopo l'induzione dell'ictus.

Quando standardizzati e confrontati con il valore che rappresenta un uso equilibrato dei quattro arti, la linea rossa in questo grafico, questi risultati indicano che i ratti con patologie concomitanti non mostrano statisticamente un deficit nell'uso dei quattro arti. Risultati simili sono stati ottenuti per animali di tipo selvatico con o senza ictus e per ratti transgenici APP21 singolarmente. Tuttavia, gli animali comorbidi hanno mostrato differenze nella funzione motoria associata alla locomozione.

I dati della prova sul trave raccolti per questi ratti sette giorni prima e 21 giorni dopo l'induzione dell'ictus mostrano un aumento significativo del numero di passi necessari per attraversare la trave, fenomeno non osservato negli altri gruppi. I risultati del labirinto acquatico di Morris rivelano inoltre deficit di memoria negli animali con comorbilità, come dimostrato da questo grafico che mostra la variazione percentuale della latenza, ovvero il tempo impiegato dagli animali per raggiungere il quadrante della vasca in cui precedentemente si trovava la piattaforma, confrontando la prima e la seconda prova di ricerca. In questo caso, i ratti APP21 con ictus impiegano significativamente più tempo nella seconda prova per entrare nel quadrante bersaglio.

Una differenza che non è stata evidenziata né dai ratti transgenici né dagli animali di tipo selvatico con ictus. Questo indica che gli animali con patologie concomitanti presentano un deficit della memoria a lungo termine. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere tutte le variabili il più possibile costanti durante e tra le sessioni di prova e creare un ambiente privo di stress per gli animali.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare le prestazioni motorie e cognitive nei modelli di ratto della demenza post-ictus.