Bare Metal Stent ferromagnetico per Capture cellule endoteliali e conservazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare uno stent metallico nudo ferromagnetico in grado di catturare e trattenere cellule endoteliali marcate con nanoparticelle magnetiche. Questo risultato si ottiene progettando uno stent in acciaio inossidabile 2205 mediante l'uso di software di progettazione assistita da computer (CAD) e di analisi agli elementi finiti (FEA), al fine di comprendere adeguatamente il comportamento meccanico del materiale e della struttura dello stent durante le fasi di riduzione del diametro (crimping) e di espansione. Successivamente, lo stent prodotto viene sottoposto a crimping e espansione meccanici per dimostrarne l'integrità meccanica, e ne viene studiata la capacità di mantenere il campo magnetico, il che conferma il comportamento magnetico dello stent.

Successivamente, gli stent vengono impiantati in maiali e vengono somministrate cellule endoteliali marcate con nanoparticelle magnetiche al fine di verificare il catturaggio e il mantenimento delle cellule nella circolazione coronarica. I risultati mostrano che lo stent ferromagnetico sviluppato in questo studio è in grado di catturare e trattenere cellule endoteliali marcate magneticamente, come dimostrato dall'analisi istologica dei vasi sanguigni asportati da esperimenti in vivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di diversi dispositivi cardiovascolari, poiché una rapida endotelizzazione può favorire la guarigione e migliorare la compatibilità con il sangue.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà a causa della complessità delle procedure di CAD e di analisi agli elementi finiti (FEA) coinvolte nella progettazione degli stent; anche la coltura cellulare può rappresentare una sfida per i principianti. Data l'importanza di mantenere un ambiente rigorosamente asettico, abbiamo voluto migliorare la guarigione degli stent ed abbiamo elaborato l'idea di utilizzare forze magnetiche per fissare cellule vive sugli stent. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di sviluppo dello stent e di riscaldamento cellulare sono difficili da apprendere a causa della complessità del comportamento del materiale durante l'acconciatura e l'espansione e della novità del metodo di cattura cellulare magnetica dello stent.

Per iniziare, utilizzare un software CAD per creare un cilindro cavo estruso selezionando una funzione di base estrusa con uno spessore della parete pari allo spessore dell'elemento del dispositivo di sostegno. Progettare un modello di dispositivo di sostegno su un diverso piano di schizzo tangente al cilindro estruso. Impostare la larghezza del modello piano in modo che corrisponda alla circonferenza del cilindro cavo estruso.

Utilizzando la funzione di avvolgimento, trasferire il disegno del modello piatto sul cilindro cavo. Salvare il pezzo nel suo formato nativo e anche in formato ACEs per l'esportazione per l'analisi agli elementi finiti. Per eseguire l'analisi agli elementi finiti, importare la geometria solida salvata in formato ACEs nel modulo del pezzo del software di analisi agli elementi finiti per ulteriori analisi nel modellatore del pezzo del software. Posizionare due cilindri analitici coassialmente rispetto allo stent. Fare doppio clic sull'elemento dell'albero delle istanze nel modellatore di assieme per assemblare i componenti nelle relative posizioni mediante un modulo di mesh del software di analisi agli elementi finiti.

Specificare l'elemento, di tipo elemento esagonale a 20 nodi con integrazione ridotta. Specificare le dimensioni dell'elemento e generare la mesh dello stent all'interno delle proprietà di interazione dell'albero del modello. Definire coppie di contatto rigido senza attrito tra lo stent e i due cilindri rispettivamente.

Assegna al modello dello stent il comportamento stress-deformazione ELA dell'acciaio inossidabile 2205. Definisci le condizioni al contorno per ridurre dapprima il cilindro esterno di un millimetro, simulando così l'operazione di crimpatura. Rimuovi il cilindro esterno per simulare il rilassamento dello stent crimpato.

Espandere il cilindro interno fino a tre millimetri per simulare l'espansione, quindi rimuovere il cilindro interno per simulare il recupero dello stent. Al termine della simulazione, aprire il file dei risultati ed elaborare i risultati per studiare le deformazioni principali in modo iterativo. Migliorare il design dello stent per ottenere una deformazione principale del 20%, valore inferiore al limite di rottura del materiale.

Dopo aver ottenuto i tubi in acciaio inossidabile 2205 e aver tagliato gli stent secondo il protocollo descritto sotto cappa, utilizzando idonei dispositivi di protezione individuale, sottoporre lo stent a decapaggio acido per passivare la superficie degli stent elettrolucidati immergendoli in acido cloridrico al 50% per 10 minuti, seguiti da bicarbonato di sodio al 10% per altri 10 minuti per completare il decapaggio acido. Lavare gli stent con etanolo e successivamente con acqua deionizzata. Quindi, per verificare la capacità di compressione degli stent, tenere uno stent e un palloncino triplo.

In uno strumento manuale di crimpage, premere la leva per deformare lo stent da crimpato sul palloncino. Dopo aver ispezionato lo stent crimpato al microscopio per verificare l'uniformità del crimpage e la presenza di eventuali segni di cedimento, espandere lo stent fino al diametro progettato di tre millimetri utilizzando acqua per pressurizzare il palloncino triplo. Esaminare gli stent espansi alla ricerca di fratture microscopiche e di un'espansione uniforme, utilizzando un potente magnete al neodimio.

Magnetizzare gli stent diametralmente tenendo lo stent su una delle facce piane con il diametro lungo le linee del campo magnetico. In alternativa, magnetizzare gli stent assialmente tenendo lo stent accanto alla superficie cilindrica con l'asse lungo le linee del campo magnetico. Tenere lo stent vicino al magnete potente per circa un minuto.

Per la magnetizzazione, montare singolarmente le protesi su mandrini di vetro e quindi inserire i mandrini di vetro nel mandrino di precisione della fixture di prova magnetica. Mediante i dispositivi di regolazione X, Y, Z, assemblare la fixture di prova magnetica in modo da posizionare con precisione la sonda microsensoriale magnetica vicino alla protesi senza toccarne la superficie. Misurare il valore iniziale del microsensore magnetico a grande distanza dalla protesi, quindi utilizzare i dispositivi di regolazione x, y, Z per posizionare la sonda e misurare il campo magnetico residuo sulla superficie della protesi.

Dopo aver ottenuto cellule endoteliali progenitrici, o EOC, dal sangue periferico suino come descritto nel protocollo colturale nel testo, coltivare le cellule in un fiasco T75 fino a quando raggiungono una confluenza di circa l'80%. Dopo la sintesi di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche, o pyon, aggiungere il pyon alle EOC nel mezzo di coltura cellulare a una concentrazione di 200 microgrammi per millilitro. Incubare a 37 gradi Celsius per 16 ore.

Aspirare delicatamente il mezzo di coltura cellulare e aggiungere 10 millilitri di PBS al matraccio. Quindi agitare delicatamente e aspirare. Aggiungere il PBS cinque microgrammi per millilitro di colorante fluorescente, come CM DAI, a 10 millilitri di mezzo di coltura per colorare le cellule seguendo le istruzioni del produttore e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Usare PBS per lavare delicatamente le cellule come in precedenza, quindi aggiungere la soluzione di tripsina 0,25% EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti per staccare le cellule dalla fiasca. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Completare il volume con PBS e centrifugare a 500 ×g per cinque minuti per raccogliere le cellule in pellet dopo aver decantato il soprannatante.

Utilizzare PBS per risospendere le cellule a una concentrazione da uno a 2 milioni di cellule per millilitro. Per studi cellulari in vitro, progettare e realizzare un semplice dispositivo per mantenere lo stent appena sopra la superficie di un coprioggetto di vetro. Utilizzare un campo elettromagnetico per smagnetizzare uno stent oppure, con un potente magnete al neodimio, magnetizzare lo stent diametralmente o assialmente; pipettare quindi la sospensione di oocisti marcate con spy in PBS nella piastra contenente gli stent magnetizzati assialmente, magnetizzati diametralmente o non magnetizzati (controllo).

Quindi, mediante un microscopio a fluorescenza invertito, si acquisiscono immagini degli stent con EOC sospese in PBS per eseguire l’impianto degli stent dopo aver somministrato un farmaco antiaggregante a quattro suini Yorkshire sani e averli anestetizzati secondo il protocollo descritto nel testo. Si utilizza una tecnica standard di cateterizzazione cardiaca per impiantare uno stent magnetizzato e uno non magnetizzato nell’arteria coronaria destra (RCA). Dopo aver utilizzato un filo guida per avanzare il palloncino e lo stent con un palloncino over-the-wire, si blocca il flusso sanguigno nella porzione prossimale della RCA rispetto agli stent impiantati. Successivamente, nell’arco di due minuti, si somministrano circa 2 milioni di EOC autologhe marcate con s-scions sospese in quattro millilitri di PBS attraverso il catetere centrale; dopo ulteriori due minuti di occlusione, si ripristina il flusso sanguigno nella RCA, si preleva lo stent e si esegue l’analisi istologica. Secondo il protocollo descritto nel testo, qui mostrato, il progetto iterativo dello stent basato sull’analisi agli elementi finiti (FEA) ha indicato uno stent in grado di essere ripiegato ed espanso con una deformazione principale del 20%, valore inferiore alla deformazione ultima del 30%.

Uno stent tagliato al laser, elettrolucidato, posizionato su un catetere a palloncino e dilatato fino a tre millimetri utilizzando un palloncino non medicato non ha mostrato segni di frattura. Le immagini dello stent deformato hanno mostrato un buon accordo con la deformazione calcolata tramite analisi agli elementi finiti (FEA) e anche le immagini ottenute mediante microscopia non hanno rivelato fratture, come previsto in base alle misurazioni del campo magnetico residuo. Le cellule marcate con SPY sono state preferenzialmente attratte verso i segmenti curvi negli stent magnetizzati assialmente e in modo più uniforme verso i segmenti rettilinei.

In stent magnetizzati diametralmente, le immagini di istologia hanno mostrato una colorazione per il ferro vicino ai travi dello stent, confermando l'attrazione e la ritenzione delle EOC nello stent durante il periodo di impianto di sette giorni. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante comprendere i concetti di FEA e CAD con parametri di input inadeguati. Si otterrebbe un disegno dello stent errato, che risulterebbe troppo rigido o con una propensione alla frattura dello stent.

Seguendo questa procedura. Altri metodi, come test di fatica accelerata e test di tossicità, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: Quali sono la durata a lungo termine e la biocompatibilità degli stent? Dopo diversi anni di sviluppo, disponiamo ora di una tecnologia funzionale che è stata validata in un modello suino.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare uno stent ferromagnetico e testare il catturamento e il mantenimento di cellule arteriose etichettate magneticamente.