Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare popolazioni ultra piccole di nanoparticelle biocompatibili, caratterizzare le loro proprietà fisiche e studiare le interazioni tra particelle e cellule. Ciò si ottiene utilizzando prima il metodo della temperatura di inversione di fase per sintetizzare le nanoparticelle lipidiche. Durante questo processo, il lipide e il tensioattivo vengono inizialmente cofusi.

Dopo aver aggiunto una determinata quantità di acqua, la miscela viene riscaldata fino a quando non si verifica la separazione di fase. La miscela viene quindi mescolata continuamente fino a creare una nano emulsione e completare la sintesi delle nanoparticelle lipidiche solide o sln. Successivamente, la diffusione dinamica della luce o DLS viene utilizzata per misurare la dimensione delle particelle e la polidispersione.

La calorimetria differenziale a scansione o DSC è una tecnica aggiuntiva utilizzata per determinare il punto di fusione e il calore latente di fusione al fine di caratterizzare ulteriormente le particelle, in definitiva la microscopia a fluorescenza e la citometria a flusso possono essere utilizzate per studiare le interazioni cellulari delle particelle. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti ad alta energia, come il microfluido ultrasonicato e l'omogeneizzazione ad alta pressione, è che si tratta di una tecnica di sintesi relativamente delicata, semplice e scalabile. Per sintetizzare i LNS combinare 0,6 milligrammi di colorante fluorescente o altro composto lipofilo e 0,10 grammi di alcano lineare o lipide.

In una fiala da 15 millilitri, fondere i componenti a 90 gradi Celsius e mescolare, aggiungere 0,11 grammi di un tensioattivo lineare non ionico. Quindi frullare la miscela risultante a 90 gradi Celsius e mescolare. Successivamente, aggiungere 1,79 grammi di acqua sterile al calore della miscela a 90 gradi Celsius e monitorare visivamente la soluzione fino a quando non si osservano due fasi.

Ora mescolate il composto fino a formare una nano emulsione trasparente. Preparare una nano emulsione separata in parallelo senza aggiungere il colorante fluorescente per fungere da campione di controllo. Sterilizzare ulteriormente ogni nano emulsione utilizzando un filtro sterile da 0,2 micron.

Utilizzare DLS per misurare la dimensione delle particelle e la polidispersione dell'S lns utilizzando un vetro in un design dello strumento per misurare la dimensione delle particelle prima della misurazione dei campioni, la dimensione delle particelle di due standard noti deve essere misurata seguendo il protocollo del produttore per la preparazione e la misurazione degli standard. Quindi, misurare i campioni come preparati per ciascuno. Utilizzare un'autonomia di 100 secondi, l'indice di rifrazione dell'acqua e la viscosità dell'acqua a 20 gradi Celsius.

Riportare il diametro medio delle particelle e la polidispersione della distribuzione granulometrica per studiare il comportamento termico dell'S lns utilizzando DSC, prima pipettare l'S LNS in una vaschetta di alluminio da 40 microlitri con una massa di circa 25 milligrammi. Sigillare ermeticamente la padella utilizzando una pressa a crimpare universale per ridurre al minimo la perdita di umidità durante la scansione DSC. Prima di misurare ogni nano emulsione, da cinque a 80 gradi Celsius, riportare il punto di fusione e il calore latente di fusione dal grafico DSC, dove la valle rappresenta il punto di fusione e l'integrale dell'area sotto la curva.

Nel grafico DSC, diviso per la quantità di materiale rappresenta il calore latente della coltura di fusione. Fibroblasti umani primari secondo le istruzioni del produttore in mezzo liquido per la coltura di fibroblasti dermici umani. Integrato con il kit di integratori per la crescita sierica bassa, mantiene le cellule in un'atmosfera umidificata a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e subcoltura al raggiungimento dell'80% di confluenza sia per l'MTT che per le cellule seme dell'analisi di imaging.

In una piastra da 96 pozzetti a una densità di 20.000 celle per pozzetto. Lasciare che le cellule si equilibrino a 37 gradi Celsius durante la notte prima dell'esposizione all'SLN al tempo zero, diluire gli SLM in mezzo completo per raggiungere la concentrazione lipidica desiderata e aggiungere 10 microlitri per pozzetto a ciascun pozzetto replicato nella piastra a 96 pozzetti dopo 24 ore di incubazione con S lns, determinare la vitalità cellulare utilizzando il test MTT secondo il protocollo del produttore. Lavare le cellule una volta e aggiungere 100 microlitri di terreno fresco a ciascuna.

Uccidere bene i pozzetti di controllo incubandoli in una soluzione di metanolo al 70% per 10 minuti prima di sostituirli con un terreno fresco. Aggiungere il reagente MTT a 10 microlitri per pozzetto in ciascun pozzetto della micropiastra e incubare per una notte a 37 gradi Celsius dopo l'incubazione notturna, solubilizzare la forma intracellulare e i cristalli con 100 microlitri della soluzione detergente fornita. Secondo il protocollo del produttore, incubare le cellule nella soluzione detergente per tre ore a temperatura ambiente prima di ottenere valori di assorbanza.

Utilizzo di un lettore di micropiastre per la preparazione alla microscopia. Lavare i fibroblasti due volte con soluzione fisiologica soffiata di fosfato sterile. Fissare le cellule per 10 minuti con metanolo freddo al 70% in punti temporali specifici dopo il dosaggio dei fibroblasti con lns.

Dopo 10 minuti, sostituire il metanolo con soluzione salina tamponata con fosfato o PBS prima di acquisire immagini utilizzando un microscopio invertito. L'SLN S sintetizzato ha portato a LNS di controllo S con un diametro medio delle particelle di 18,59 e con una polidispersità di 5,83 e SLM caricati con rosso Nilo con un diametro medio delle particelle di 16,87 nanometri e con una polidispersità di 4,47 utilizzando un saggio MTT. L'effetto dose-risposta sul metabolismo cellulare è stato misurato quando l'aumento della concentrazione di particelle ha comportato una diminuzione della vitalità cellulare.

Non è stata osservata alcuna differenza di tossicità tra le cellule esposte al solo SLN rispetto al rosso del Nilo caricato. SLN. In parallelo, le cellule sono state esaminate visivamente per verificarne l'aderenza alla coltura tissutale. Il polistirene e le immagini sono state scattate per dimostrare sia la morfologia cellulare rappresentativa che l'assorbimento di particelle fluorescenti nel tempo, utilizzando una dose pari a cinque microgrammi per millilitro.

L'assorbimento delle particelle lipidiche è stato osservato entro due ore dall'esposizione. Il livello di incorporazione delle nanoparticelle è stato determinato misurando l'intensità della fluorescenza del rosso del Nilo nelle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo murino, o MDC B, tramite citometria a flusso. È stata osservata una correlazione diretta tra la concentrazione di SNS utilizzata e la quantità di fluorescenza valutata nelle MDC B.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare popolazioni ultra piccole di nanoparticelle biocompatibili, caratterizzare le loro proprietà fisiche e studiare le interazioni tra particelle e cellule.