Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare popolazioni ultra piccole di nanoparticelle biocompatibili, caratterizzarne le proprietà fisiche e studiare le interazioni tra le particelle e le cellule. Questo viene ottenuto innanzitutto utilizzando il metodo della temperatura di inversione di fase per sintetizzare le nanoparticelle lipidiche. Durante questo processo, il lipide e il tensioattivo vengono inizialmente fusi insieme.

Dopo aver aggiunto una quantità specifica di acqua, la miscela viene riscaldata fino a quando si verifica la separazione di fase. La miscela viene quindi mescolata continuamente fino a quando si forma un'emulsione nano e la sintesi dei nanoparticelle lipidiche solide o SLN è completa. Successivamente, la diffusione dinamica della luce o DLS viene utilizzata per misurare la dimensione delle particelle e la polidispersione.

La calorimetria differenziale a scansione o DSC è una tecnica aggiuntiva utilizzata per determinare il punto di fusione e il calore latente di fusione al fine di caratterizzare ulteriormente le particelle; inoltre, la microscopia a fluorescenza e la citometria a flusso possono essere impiegate per studiare le interazioni tra particelle e cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi ad alta energia esistenti, come l'ultrasuonificazione, la microfluidica e l'omogeneizzazione ad alta pressione, è che si tratta di una tecnica di sintesi relativamente delicata, semplice e facilmente scalabile. Per sintetizzare le LNS, combinare 0,6 milligrammi di colorante fluorescente o di un altro composto lipofilico e 0,10 grammi di alcan lineare o di lipide.

In un vial da 15 millilitri, fondere insieme i componenti a 90 gradi Celsius e mescolare aggiungendo 0,11 grammi di un tensioattivo lineare non ionico. Successivamente, mantenere la miscela risultante a 90 gradi Celsius sotto costante agitazione. Quindi, aggiungere 1,79 grammi di acqua sterile alla miscela, riscaldare a 90 gradi Celsius e monitorare visivamente la soluzione fino a quando si osservano due fasi.

Ora agitare la miscela fino a quando si forma un'emulsione nano trasparente. Preparare in parallelo un'emulsione nano separata senza aggiungere il colorante fluorescente, da utilizzare come campione di controllo. Sterilizzare ulteriormente ciascuna emulsione nano mediante un filtro sterile da 0,2 micron.

Utilizzare la DLS per misurare la dimensione delle particelle e la polidispersione degli S lns usando un vetrino in uno strumento predisposto per la misurazione della dimensione delle particelle prima dell'analisi dei campioni; la dimensione delle particelle di due standard noti deve essere misurata seguendo il protocollo del produttore per la preparazione e la misurazione degli standard. Successivamente, misurare i campioni così come preparati per ciascuno. Utilizzare un tempo di acquisizione di 100 secondi, l'indice di rifrazione dell'acqua e la viscosità dell'acqua a 20 gradi Celsius.

Segnalare il diametro medio delle particelle e l'indice di polidispersione della distribuzione dimensionale delle particelle per studiare il comportamento termico degli SLN mediante DSC. Prima di tutto, pipettare gli SLN in un contenitore di alluminio da 40 microlitri con una massa di circa 25 milligrammi. Sigillare ermeticamente il contenitore utilizzando una pressa a crimpare universale per minimizzare la perdita di umidità durante la scansione DSC. Prima di misurare ogni nanoemulsione da 5 a 80 gradi Celsius, riportare il punto di fusione e il calore latente di fusione dal grafico DSC, in cui la valle rappresenta il punto di fusione e l'integrale dell'area sottesa alla curva.

Nel grafico DSC, diviso per la quantità di materiale, rappresenta il calore latente di fusione della coltura. Coltivare i fibroblasti umani primari secondo le istruzioni del produttore in un mezzo liquido per la coltura di fibroblasti dermici umani, integrato con il kit di supplemento per crescita a basso siero. Mantenere le cellule in un'atmosfera umidificata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, ed effettuare il sottocoltivo al raggiungimento di una confluenza dell'80% per la semina delle cellule destinate sia all'analisi MTT che all'analisi mediante imaging.

In una piastra a 96 pozzetti a una densità di 20.000 cellule per pozzetto. Lasciare equilibrare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte prima dell'esposizione agli SLN; al tempo zero, diluire gli SLM nel mezzo completo per ottenere la concentrazione lipidica desiderata e aggiungere 10 microlitri per pozzetto in ogni pozzetto replicato della piastra a 96 pozzetti. Dopo 24 ore di incubazione con gli SLN, determinare la vitalità cellulare mediante saggio MTT seguendo il protocollo del produttore. Lavare le cellule una volta e aggiungere 100 microlitri di mezzo fresco a ciascun pozzetto.

Uccidere le pozzette di controllo incubandole in una soluzione di metanolo al 70% per 10 minuti, quindi sostituire con mezzo fresco. Aggiungere il reagente MTT a 10 microlitri per pozzetta in ciascuna pozzetta della micropiastra e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius; dopo l'incubazione notturna, solubilizzare la forma intracellulare e i cristalli con 100 microlitri della soluzione detergente fornita. Secondo il protocollo del produttore, incubare le cellule nella soluzione detergente per tre ore a temperatura ambiente prima di rilevare i valori di assorbanza.

Utilizzo di un lettore di micropiastre per la preparazione alla microscopia. Lavare i fibroblasti due volte con soluzione salina fosfato sterile tamponata. Fissare le cellule per 10 minuti con metanolo freddo al 70% in punti temporali specifici successivi alla somministrazione di lns ai fibroblasti.

Dopo 10 minuti, sostituire il metanolo con soluzione salina tamponata al fosfato o PBS prima di acquisire le immagini utilizzando un microscopio invertito. Le SLN S sintetizzate hanno prodotto SLN S di controllo con un diametro medio delle particelle di 18,59 e una polidispersione di 5,83, e SLM caricate con Nile rosso con un diametro medio delle particelle di 16,87 nanometri e una polidispersione di 4,47, utilizzando un saggio MTT. L'effetto dose-risposta sul metabolismo cellulare è stato misurato, mostrando che un aumento della concentrazione delle particelle ha determinato una riduzione della vitalità cellulare.

Non è stata osservata alcuna differenza di tossicità tra le cellule esposte alle SLN da sole rispetto a quelle esposte alle SLN caricate con Nile red. Parallelamente, le cellule sono state esaminate visivamente per verificarne l'adesione al coltura tissutale. Polistirene e immagini sono state acquisite per dimostrare sia la morfologia cellulare rappresentativa sia l'assorbimento delle particelle fluorescenti nel tempo, utilizzando una dose pari a cinque microgrammi per millilitro.

L'assorbimento delle particelle lipidiche è stato osservato entro due ore dal trattamento. Il livello di incorporazione delle nanoparticelle è stato determinato misurando l'intensità della fluorescenza del Nile rosso in cellule dendritiche derivate dal midollo osseo murino, o B MDCs, mediante citometria a flusso. È stata osservata una correlazione diretta tra la concentrazione di SNS utilizzata e la quantità di fluorescenza rilevata nelle B MDCs.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare popolazioni ultra piccole di nanoparticelle biocompatibili, caratterizzarne le proprietà fisiche e studiare le interazioni tra particelle e cellule.