Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

Gli obiettivi generali dei seguenti esperimenti sono determinare gli effetti dell'NTBC sulla produzione di p melanina e sulla sensibilità allo stress ossidativo, nonché sulle concentrazioni minime inibitorie (MIC) degli antibiotici. Questo viene ottenuto aggiungendo NTBC a colture batteriche per determinare la concentrazione che riduce la produzione di p melanina come secondo passaggio. Le colture batteriche vengono trattate con NTBC e antibiotici, consentendo all'utilizzatore di verificare se il trattamento con NTBC influisce sulle MIC degli antibiotici.

Colture trattate con NTPC vengono esposte al perossido di idrogeno al fine di determinare la sensibilità allo stress ossidativo; i risultati ottenuti mostrano che il trattamento di batteri genici con NTPC porta a una riduzione della produzione di pigmento e a un aumento della sensibilità allo stress ossidativo, senza alcun effetto sugli antibiotici MIC basati rispettivamente sui saggi spot per la risposta allo stress ossidativo e sui saggi MIC in microtitolazione. Il principale vantaggio della tecnica del piatto spot per lo stress ossidativo rispetto ai metodi esistenti, come i conteggi vitali e i saggi di diffusione su disco, è che possono essere utilizzate concentrazioni più basse di perossido di idrogeno, anziché le alte concentrazioni impiegate in altri saggi. Generalmente, chi si approccia per la prima volta al nostro metodo di determinazione degli antibiotici MIC incontra difficoltà a causa della mancanza di precisione nella tecnica di pipettaggio, che introduce variabilità tra le repliche.

Questa variabilità può rendere difficile determinare con precisione l'antibiotico. MIC Un giorno prima del saggio MIC. Preparare colture dei ceppi da testare in LB con e senza.

Due due nitro, quattro trior etil benzoil uno tre Cicloesano Dione, o NTBC. Questa dimostrazione utilizza un livello rappresentativo di 300 micromolare di NTBC. Il metodo di titolazione per determinare la concentrazione appropriata di NTBC è descritto nel testo del protocollo: incubare le colture tutta la notte a 37 gradi Celsius con aerazione al giorno successivo.

Preparare soluzioni madri di LB con NTBC e di LB con DMSO per il saggio MIC al fine di testare un antibiotico su un ceppo utilizzando 600 micromoli di NTBC per due millilitri di LB e mescolare. Per preparare la soluzione madre di NTBC, si aggiunge NTBC a una concentrazione di 600 micromoli perché verrà diluito di due volte quando si aggiungerà l'inoculo.

Aggiungere un volume equivalente del veicolo DMSO a due millilitri di LB per ottenere una concentrazione finale di 300 micromolare e mescolare per preparare la soluzione madre NO NTBC. Queste due soluzioni madri verranno utilizzate per preparare le soluzioni di antibiotico e per impostare la serie di diluizioni in piastre a 96 pozzetti. Successivamente, preparare le soluzioni di antibiotico nelle soluzioni madri di LB più NTBC o LB più DMSO.

Preparare la soluzione madre di gentamicina più o meno NTBC a 64 microgrammi per millilitro. Preparare la soluzione madre di kanamicina più o meno NTBC a 256 microgrammi per millilitro. Preparare la soluzione madre di tobramicina più o meno NTB a otto microgrammi per millilitro.

Dopo aver preparato le due soluzioni antibiotiche, aggiungere 100 microlitri di ciascuna soluzione antibiotica a quattro pozzetti in una piastra a 96 pozzetti, nella riga A. Ad esempio, la gentamicina deve essere aggiunta dai pozzetti A1 ad A4, la kanamicina dai pozzetti A5 ad A8 e la tobramicina dai pozzetti A9 ad A12. Aggiungere 50 microlitri della soluzione madre di LB più NTBC o LB più DMSO alle righe B-H della piastra a 96 pozzetti, assicurandosi che una piastra contenga LB più NTBC e l'altra LB più DMSO. Utilizzando una micropipetta, eseguire diluizioni seriali a due fold degli antibiotici trasferendo 50 microlitri della soluzione dalla riga A alla riga B. Mescolare la soluzione, cambiare le punte della pipetta e trasferire 50 microlitri della soluzione dalla riga B alla riga C. Ripetere per le righe rimanenti fino alla riga G. Dopo aver diluito la riga G, rimuovere 50 microlitri della soluzione da tale riga e scartarli.

Utilizzare la riga H come controllo senza antibiotico per la crescita batterica. Recuperare le colture ottenute durante la notte dopo aver lavato tutte le colture per eliminare la lanina presente nel mezzo, misurare l'OD 600 delle colture e diluire le colture notturne in lb. utilizzando un multicanale micropipettatore.

Aggiungere 50 microlitri della coltura batterica diluita nei pozzetti appropriati. Aggiungere batteri in tre pozzetti per ogni ceppo e concentrazione di antibiotico. Aggiungere 50 microlitri di LB nel quarto pozzetto come controllo per la contaminazione batterica.

Coprire le piastre a 96 pozzetti con perfil e incubare per circa 24 ore a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Esaminare visivamente le piastre per verificare la crescita batterica nei pozzetti. L'MIC è la concentrazione più bassa di antibiotico in cui non si osserva crescita batterica in tutte e tre le replicazioni di ciascun ceppo.

Per iniziare questa procedura, preparare colture notturne dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC come mostrato in precedenza, da utilizzare il giorno seguente. Preparare piastre di LB APL contenenti perossido di idrogeno come agente stressante ossidativo. Innanzitutto, sciogliere i flaconi di agar LB e raffreddare il terreno a circa 50 gradi Celsius a temperatura ambiente.

Successivamente, aggiungere il perossido di idrogeno direttamente al mezzo raffreddato alle concentrazioni desiderate. Agitare delicatamente il matraccio per mescolare una serie di concentrazioni di perossido di idrogeno comprese tra zero e uno. Un valore di un millimolare è un buon punto di partenza.

Versare immediatamente le piastre e passare la fiamma sulla superficie per rimuovere le bolle. Il rendimento è di quattro piastre ogni 100 millilitri di agar LB. Contrassegnare le piastre con la concentrazione di perossido di idrogeno.

Posizionare le piastre scoperte in una cappa biologica con il ventilatore acceso per 30 minuti per rimuovere l'eccesso di umidità dalle piastre. Le piastre devono essere utilizzate lo stesso giorno. Vengono preparate mentre le piastre si asciugano, lavare e misurare.

L'OD 600 delle colture notturne normalizza l'OD 600 di tutte le colture notturne al valore più basso per il set di ceppi in esame. Per fare ciò, determinare il volume di coltura necessario per diluire la coltura fino al valore più basso di OD 600 in un volume totale di un millilitro. Ad esempio, se una coltura ha un OD 600 di tre e il valore più basso di OD 600 per il set di ceppi è 2,5, eseguire il seguente calcolo, che darà come risultato 0,833 millilitri come volume di coltura necessario; posizionare 0,833 millilitri di coltura in una provetta microcentrifuga.

Successivamente, calcolare la quantità di LB più NTBC o LB più DMSO necessaria per portare il volume della coltura a un millilitro. In questo esempio, la quantità sarebbe di 0,167 millilitri; miscelare per vortex per mantenere le colture in una concentrazione costante di NTBC o DMSO. Eseguire una diluizione seriale decimale delle colture normalizzate in PBS più NTBC o PBS più DMSO. Preparare soluzioni stock di PBS più NTBC e PBS più DMSO, aumentando o riducendo le quantità a seconda del numero di ceppi da testare. Per un set di diluizioni per un ceppo, aggiungere 300 micromolari di NTBC o un volume equivalente di DMSO a PBS teal, per un volume totale di 720 microlitri. Aggiungere 90 microlitri di PBS più NTBC o PBS più DMSO nei rispettivi tubi microcentrifuga etichettati per le diluizioni seriali da 10 alla meno uno a 10 alla meno sette.

Aggiungere 10 microlitri di coltura al rispettivo tubo di diluizione 10 alla meno uno, mescolare mediante vortex e trasferire 10 microlitri della diluizione 10 alla meno uno al tubo di diluizione 10 alla meno due. Cambiare le punte della pipetta tra ogni diluizione e ripetere fino a quando tutte le diluizioni sono state effettuate. Depositare 5 microlitri delle diluizioni da 10 alla meno tre a 10 alla meno sette su piastre di LV contenenti perossido di idrogeno, in duplicato.

Per ogni ceppo, utilizzare un solo puntale di pipetta. Se si piastrano spot partendo dalla diluizione più alta fino a quella minore, non inclinare né rovesciare la piastra finché il liquido non si è completamente asciugato sulla superficie. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24-48 ore, in base al ceppo.

Una volta comparse colonie di dimensioni adeguate, fotografare le piastre utilizzando una telecamera CCD posizionata sopra un transluminatore. Le titolazioni di NTBC sono state utilizzate per determinare se NTBC fosse in grado di ridurre la produzione di melanina p in p aerogen e per identificare la concentrazione di NTBC che elimina o riduce la produzione di melanina p, da utilizzare in saggi aggiuntivi come mostrato qui. NTBC ha ridotto la produzione di melanina PY in modo dose-dipendente nei ceppi produttori di melanina p, ma non ha avuto alcun effetto sulla produzione di pigmento nei ceppi che non producono melanina p.

Questo tavolo mostra i risultati del saggio MIC per diversi ceppi di p aerogen trattati con e senza NTBC e vari antibiotici; i valori MIC sono stati registrati come la concentrazione più bassa di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica. Il trattamento con NDBC non ha avuto alcun effetto sui valori MIC degli antibiotici per i ceppi testati. È stato eseguito un saggio su piastra a spot per valutare la risposta allo stress ossidativo su ceppi produttori e non produttori di melanina PIO trattati con e senza NDBC.

La piastra con zero millimoli di perossido di idrogeno ha mostrato che tutte le ceppature sono state diluite correttamente ed è stata osservata un'aumentata sensibilità allo stress ossidativo quando i batteri produttori di melanina PIO sono stati trattati con NTBC; le ceppature che non producono melanina PIO si sono rivelate più sensibili allo stress ossidativo rispetto a quelle che producono melanina p. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare gli effetti del trattamento con NTBC sulla produzione di melanina PIO testando la sensibilità allo stress ossidativo e ai livelli minimi inibitori di antibiotici (MIC).