Name: Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Scopri come inibire la produzione di piomelanina batterica con NTBC e determinare l'aumento della sensibilità allo stress ossidativo. Questo metodo aiuta a studiare la resistenza antimicrobica.

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Gli autori ringraziano Dara Frank e Carrie Harwood per il loro generoso contributo di varietà. La Milwaukee Research Foundation dell'Università del Wisconsin detiene il brevetto n. 8.354.451; con affermazioni ampiamente dirette al trattamento o all'inibizione della progressione dell'infezione di un microrganismo in un paziente mediante la somministrazione di un composto inibitore della 4-idrossifenilpiruvato diossigenasi come il 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC). Gli inventori sono Graham Moran e Pang He. Questa ricerca è stata supportata dal National Institutes of Health (R00-GM083147). La libreria di mutanti trasposoni P. aeruginosa dell'Università di Washington è supportata da NIH P30 DK089507.

1. Preparazione della Cultura Media, antibiotici, e 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoile] -1,3-cicloesandione (NTBC) <ol><li> Rendere brodo LB (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% di NaCl in H 2 O) e aliquota in volumi appropriati. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Rendere 100 ml LB agar (1% triptone, estratto di lievito 0,5%, 0,25% NaCl, 1,5% agar in H 2 O) in 250 ml beute. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. Assicurarsi che l&#39;agar viene fuso prima di versare in piastre. NOTA: Boccette contenenti 100 ml di LB agar produrrà 4 piatti. La quantità di LB agar può essere modificato per corrispondere al numero di lastre necessarie per il dosaggio. </li><li> Fai la PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Sterilizzare in autoclave o filtrazione e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare le soluzioni madre di antibiotici per gentamicina, kanamicina, und tobramicina. <ol><li> Preparare opportune concentrazioni azionari antibiotici per P. aeruginosa ceppi contenenti 100 mg / ml gentamicina, 30 mg / ml di kanamicina, e 10 mg / ml tobramicina. Sciogliere gli antibiotici in acqua, sterilizzare il filtro (0,2 micron), e conservare a 4 ° C. Modificare gli antibiotici e le concentrazioni seconda batterio studiata. </li></ol></li><li> Preparare le soluzioni madre NTBC. Disciogliere 10 mg di NTBC in 400 ml di DMSO. Questo produce una concentrazione di 75,9 NTBC mM. Store Solutions NTBC azionari a -20 ° C. Soluzioni scongelare a temperatura ambiente, se necessario. NOTA: diverse fonti di NTBC hanno differenze di solubilità. Determinare il veicolo appropriato per sciogliere il NTBC in base alle raccomandazioni del costruttore e regolare Passo 1.5 di conseguenza. </li></ol> 2. NTBC titolazioni di Ceppi batterici <ol><li> Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare. Aggiungere 2 ml di brodo LB a 16 x 150 mm provettas (uno per ceppo) e inoculare con 1 isolato colonia da ogni ceppo. Incubare per una notte a 37 ° C con aerazione su un rotatore coltura tissutale in un incubatore dell&#39;aria. </li><li> Il giorno seguente, preparare titolazioni di NTBC in LB brodo. Utilizzare una prima serie 0-900 micron NTBC da ceppi diversi hanno differenze nella sensibilità al NTBC. <ol><li> Aggiungere 1 ml di brodo LB per 4 a 5 provette (16 x 150 mm) per ceppo. </li><li> Aggiungere la soluzione di riserva NTBC (75,9 mm) per le provette (16 x 150 mm) in un intervallo di concentrazioni. Vedi Tabella 1 per le concentrazioni di NTBC e corrispondenti volumi delle scorte di aggiungere ad 1 ml di brodo LB. </li></ol></li><li> Misurare il diametro esterno 600 delle culture durante la notte. Lavare le culture prima di OD 600 letture per eliminare pyomelanin presente nei media. <ol><li> Lavare le culture centrifugazione 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante e tutte le cellule senza bloccare in pellet conun micropipettatore e risospendere il pellet cellulare solido in 1 ml LB. </li></ol></li><li> Inoculare tubi di titolazione a OD 600 0.05. Calcolare la quantità di coltura lavato necessari per inoculare le provette. NOTA: Utilizzare le culture lavati per vaccinazioni da pyomelanin non dovrebbe essere presente. </li><li> Incubare le provette titolazione per circa 24 ore a 37 ° C con aerazione usando un tessuto coltura rotatore in un incubatore dell&#39;aria. </li><li> Fotografa i tubi di titolazione e confrontare produzione di pigmenti all&#39;interno e tra i ceppi per determinare la quantità di NTBC da utilizzare per MIC e lo stress ossidativo saggi. Utilizzare OD 600 letture per determinare la quantità di pyomelanin in cella libera supernatante di coltura e per determinare la densità cellulare. NOTA: Il rapporto di OD 600 pyomelanin nella cultura surnatante in cellule può essere calcolato per quantificare le differenze nella produzione pyomelanin dopo il trattamento con NTBC. </li></ol> 3. antibiotico minima inibizioneConcentrazione tory (MIC) Assay in piastre con 96 pozzetti <ol><li> Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC. NOTA: Questo protocollo è descritta utilizzando il livello rappresentativo di 300 micron NTBC. Il livello adeguato di NTBC da utilizzare è determinato nel passo 2.6. <ol><li> Aggiungere 300 micron NTBC a 2 ml LB. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (DMSO) a 2 ml LB per la condizione non NTBC. </li><li> Utilizzando stuzzicadenti sterili, inoculare provette con uno isolato colonia di batteri. Ci sarà una cultura con NTBC e una cultura senza NTBC per ogni ceppo. Incubare per una notte a 37 ° C con aerazione usando un tessuto coltura rotatore in un incubatore dell&#39;aria. </li></ol></li><li> Il giorno seguente, fare LB + NTBC e soluzioni maestri LB + DMSO per l&#39;impostazione del test MIC. Aggiungere NTBC ad una concentrazione di 600 mM come questa saranno diluiti due volte quando si aggiunge inoculo, ottenendo una concentrazione finale di 300 mM. <ol><li> Per provare uno antibiotic per un ceppo, aggiungere 600 micron NTBC a 2 ml di LB e mescolare per rendere la soluzione principale NTBC. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (DMSO) a 2 ml LB e mescolare per rendere la soluzione maestro non NTBC. Utilizzare queste soluzioni per la creazione di soluzioni madre di antibiotici, nonché per la creazione di una serie di diluizioni in piastre da 96 pozzetti. NOTA: Le formulazioni in soluzione maestri produrrà soluzione in più per tenere conto di errori di pipettamento. Le soluzioni master può essere aumentato o giù come richiesto a seconda del numero di antibiotici e ceppi testati. </li></ol></li><li> Preparare le soluzioni antibiotiche nelle soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO. NOTA: La concentrazione di antibiotico in queste soluzioni dovrebbero essere il doppio della concentrazione finale desiderata. Soluzione abbastanza dovrebbe essere fatto per trasferire 100 ul di quattro pozzi in una piastra da 96 pozzetti. <ol><li> Preparare gentamicina +/- soluzione madre NTBC a 64 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 0,288 ml di gentamicina magazzino (100 mg / ml) per 450ul LB + NTBC o soluzione maestro LB + DMSO. NOTA: la concentrazione massima di gentamicina per P. aeruginosa PAO1 è 32 mg / ml. </li><li> Rendere la kanamicina +/- soluzione di riserva NTBC a 256 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 3,84 ml di kanamicina magazzino (30 mg / ml) per 450 microlitri soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO. NOTA: la concentrazione massima di kanamicina per P. aeruginosa PAO1 è di 128 mg / ml. </li><li> Preparare tobramicina +/- soluzione madre NTBC a 8 mg / ml. Per rendere questa soluzione, aggiungere 0,36 ml di tobramicina magazzino (10 mg / ml) per 450 microlitri soluzioni maestri LB + NTBC o LB + DMSO. NOTA: Per P. aeruginosa PAO1, la massima concentrazione di tobramicina è 4 mg / ml. NOTA: Gli antibiotici e le concentrazioni possono essere regolati per i batteri da testare. </li></ol></li><li> Aggiungere 100 ml di ogni soluzione antibiotica 2x a quattro pozzi in una piastra da 96 pozzetti. Mettere queste soluzioni in fila A. Per example, gentamicina deve essere posto in A1 a A4, kanamicina deve essere posto in A5 attraverso A8 e tobramicina deve essere posto in A9 attraverso A12. Vedere Figura 1A per un diagramma di una piastra a 96 pozzetti impostato. NOTA: più antibiotici possono essere testati in un piatto, ma solo ceppo devono essere testati per piastra di eliminare il rischio di contaminazione incrociata da altri ceppi. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di maestro LB + NTBC o LB + DMSO alle righe B attraverso H della piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che un piatto è LB + NTBC e un piatto è LB + DMSO. Vedere la Figura 1A. <ol><li> Utilizzare LB + NTBC per gli antibiotici in LB + NTBC. Utilizzare LB + DMSO per gli antibiotici in LB + DMSO. </li></ol></li><li> Utilizzando un micropipettatore eseguire due diluizioni seriali piega degli antibiotici trasferendo 50 ml di soluzione dalla fila A alla fila B. Mix la soluzione, modificare i puntali, e trasferire 50 ml di soluzione da riga B a remare C. Ripetere l&#39;operazione per il remainirighe ng. Dopo diluizione fila G, rimuovere 50 ml di soluzione da quella riga e scarti. Utilizzare fila H come nessun controllo antibiotico per la crescita batterica. Vedere la Figura 1B. NOTA: ogni bene nelle righe da A a G ora contiene 50 ml di antibiotici in LB + NTBC o LB + DMSO a 2X la concentrazione finale desiderata. Fila H contiene LB + NTBC o LB + DMSO con antibiotici. </li><li> Misurare il diametro esterno 600 delle culture durante la notte. Lavare tutte le culture prima di OD 600 letture per eliminare pyomelanin presente nei media. <ol><li> Lavare le culture centrifugazione 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante con un micropipettatore e risospendere il pellet cellulare in 1 ml LB. </li></ol></li><li> Diluire le culture durante la notte per 2.75x10 5 CFU / ml in LB. NOTA: Si supponga che una OD 600 unità è l&#39;equivalente di 1x10 9 CFU / ml per P. aeruginosa. OD di CFU / ml conversioni può essere different in altri batteri. </li><li> Aggiungere 50 ml di coltura batterica diluito nel pozzetto. NOTA: Le culture coltivati ​​in NTBC dovrebbero essere aggiunti ai pozzetti contenenti NTBC e culture cresciute in DMSO dovrebbero essere aggiunti ai pozzetti contenenti DMSO. Vedere la Figura 1B. <ol><li> Aggiungi ai batteri di tre pozzi per ogni ceppo e la concentrazione di antibiotico. Aggiungere 50 ml di LB alla quarta e di agire come un controllo per la contaminazione batterica. Vedere la Figura 1B. </li><li> Utilizzare un micropipettatore multicanale per inoculare i pozzi. Assicurarsi che pipetta suggerimenti sono vicino al fondo dei pozzetti quando si aggiunge inoculo per prevenire la contaminazione dei pozzi vicini. NOTA: L&#39;aggiunta di coltura batterica ai pozzetti diluire le concentrazioni di antibiotici e NTBC due volte. </li></ol></li><li> Coprire le piastre a 96 pozzetti con parafilm e incubare circa 24 ore a 37 ° C. Incubare le piastre a 96 pozzetti staticamente, in un incubatore dell&#39;aria. </li><li> Esaminarele piastre per la crescita batterica nei pozzetti. La MIC è la più bassa concentrazione di antibiotico in cui nessuna crescita batterica è visibile per tutte tre repliche di ciascun ceppo. <ol><li> Esaminare visivamente la piastra per la crescita o leggere utilizzando un lettore di set piatto di OD 600. </li></ol></li></ol> 4. Spot Assay Piastra per Stress ossidativo risposta <ol><li> Impostare le culture durante la notte dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC come descritto al punto 3.1. </li><li> Il giorno successivo, preparare piastre di agar LB contenenti H 2 O 2 come fattore di stress ossidativo. Una gamma di H 2 O 2 concentrazioni da 0 a 1 mm è un buon punto di partenza. <ol><li> Sciogliere i palloni LB agar. Supporti Raffreddare a circa 50 ° C a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere H 2 O 2 direttamente ai media raffreddati alle concentrazioni desiderate. Fiaschi Swirl per mescolare. Vedere la Tabella 2 per le concentrazioni di H 2 O 2e volumi di H 2 O 2 concentrato da aggiungere. Questi valori sono basati su 100 ml di LB agar. </li><li> Versare in piastre subito dopo l&#39;aggiunta H 2 O 2 e fiamme la superficie per rimuovere bolle. La resa è di 4 piastre per 100 ml di LB agar. Segnare i piatti con la concentrazione di H 2 O 2. </li><li> Posizionare le piastre scoperto in una cappa a flusso biologico con il ventilatore acceso per 30 minuti per rimuovere l&#39;umidità in eccesso dalle piastre. NOTA: Utilizzare le lastre lo stesso giorno in cui vengono preparati. In caso contrario si potrebbe causare dati incoerenti. NOTA: fattori di stress ossidativo, come il paraquat può essere sostituito per H 2 O 2 in questo saggio. Le concentrazioni utilizzate per altri fattori di stress ossidativi possono variare rispetto a quelli utilizzati per H 2 O 2. </li></ol></li><li> Lavare e misurare il diametro esterno 600 delle culture durante la notte come descritto al punto 3.7. </li><li> Normalizzare la OD 600 di tutta la cu durante la notteltures al valore più basso per il set di ceppi testati. P. aeruginosa ha generalmente un diametro esterno 600 di circa 2,5 quando cresciuto durante la notte in LB + NTBC o LB + DMSO. <ol><li> Determinare il volume della cultura necessaria per diluire la coltura al OD più basso 600 in un volume totale di 1 ml. Ad esempio, se una coltura ha un diametro esterno 600 del 3 e l&#39;OD più basso 600 per il set di ceppi è 2.5, eseguire il seguente calcolo: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml di coltura saranno collocati in una provetta per microcentrifuga. </li><li> Calcolare la quantità di LB + NTBC (300 micron) o LB + DMSO necessaria a portare il volume cultura di 1 ml. Per l&#39;esempio nel passaggio 4.4.1, la quantità di LB + NTBC o LB + DMSO aggiunto alla cultura sarebbe 0.167 ml (1 ml di volume totale - 0.833 ml cultura). Fai soluzioni stock di LB + NTBC e LB + DMSO da utilizzare per queste diluizioni in base al volume necessario per diluire tutti i ceppi. </li><li> Mescolare la cultura e LB + NTBC o LB + DMSO nel vortex. </li></ol></li><li> Per mantenere le culture in una concentrazione costante di NTBC o DMSO, eseguire dieci diluizioni seriali di piegatura delle culture durante la notte normalizzati in PBS + NTBC o PBS + DMSO. <ol><li> Fai soluzioni stock di PBS + NTBC e PBS + DMSO. Per una serie di diluizioni di un ceppo, mescolare 300 pM NTBC o un volume equivalente di DMSO con PBS per ottenere un volume totale di 720 microlitri. Scala questi stock alto o in basso a seconda di quante ceppi vengono testati. </li><li> Tubi Label microcentrifuga per 10 -1 attraverso diluizioni 10 -7 seriali. Aggiungere 90 ml di PBS + NTBC o PBS + DMSO ai tubi appropriati. Usa PBS + NTBC per i ceppi cresciuti in LB + NTBC e utilizzare PBS + DMSO per i ceppi cresciuti in LB + DMSO. </li><li> Aggiungere 10 ml di cultura alla competente 10 -1 provetta di diluizione. Mescolare nel vortex e trasferire 10 ml di diluizione 10 -1 al tubo di diluizione 10 -2. Ripetere l&#39;operazione fino a quando tutte le diluizioni sono stati perfoconfermate. Cambiare puntali tra diluizioni. </li></ol></li><li> Spot 5 ml di 10 -3 attraverso 10 -7 diluizioni su LB + H 2 O 2 piastre in duplicato per ogni ceppo. Utilizzare una punta della pipetta se i punti sono placcati da più diluito al meno diluito (10 -7 a 10 -3). Non ribaltare la piastra fino a quando il liquido si è asciugata nella piastra. </li><li> Incubare le piastre per 24-48 ore a 37 ° C (incubatore aria), a seconda del ceppo. NOTA: P. aeruginosa PAO1 avrà buone colonie dimensioni su LB dopo 24 ore di incubazione. Incubare ceppi fino colonie hanno approssimativamente la stessa dimensione PAO1. </li><li> Fotografare i piatti utilizzando una fotocamera CCD sopra un transluminator. Facoltativamente, modificare le foto per il contrasto e la coltivazione alla stessa dimensione. Contare il numero di colonie in ogni posto per determinare le variazioni di sensibilità allo stress ossidativo. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il metodo di titolazione NTBC descritto in questo protocollo consentirà all'utente di determinare se NTBC è in grado di ridurre o eliminare la produzione di piomelanina nei batteri e di determinare la concentrazione di NTBC richiesta. La fase più critica del test di titolazione NTBC consiste nel determinare l'intervallo di concentrazioni di NTBC da utilizzare nel test. Diversi ceppi di P. aeruginosa hanno sensibilità diverse alle NTBC e i ceppi di laboratorio possono essere più sensibili alle NTBC rispetto agli ...

Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram negativo che produce una varietà di pigmenti tra cui la piomelanina, un pigmento rosso-marrone che aiuta a fornire protezione dallo stress ossidativo1-4 e lega una varietà di composti, inclusi gli antibiotici aminoglicosidici5-7. La produzione di piomelanina è causata da un difetto nella via del catabolismo tirosina4,8, sia attraverso delezioni o mutazioni del gene che codifica per l'omogentisato 1,2-diossigenasi (HmgA)1,9 o attraverso squilibri nei vari enzimi della via10. L'omogentisato si accumula a causa dell'inattivazione di HmgA e viene secreto e ossidato per formare piomelanina11. La produzione di piomelanina può essere abolita o ridotta in modo dose-dipendente attraverso il trattamento con l'erbicida 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC)12, che inibisce la 4-idrossifenilpiruvato diossigenasi (Hpd) nella via del catabolismo tirosina13. L'Hpd è necessaria per la formazione dell'omogentisato, e quindi della piomelanina11. 
Descriviamo in dettaglio tre tecniche che sono state importanti nei nostri studi sul trattamento NTBC dei ceppi di P. aeruginosa che producono piomelanina. Queste tecniche includono la titolazione di NTBC per determinare le concentrazioni che aboliranno o ridurranno la produzione di piomelanina nei ceppi di laboratorio e clinici che producono piomelanina, la determinazione della concentrazione inibitoria minima (MIC) degli antibiotici quando i batteri vengono trattati con NTBC e la conseguente sensibilità allo stress ossidativo con il trattamento NTBC.
Il test di titolazione che abbiamo sviluppato serve a due scopi. In primo luogo, il test consentirà all'utente di determinare se NTBC può abolire o ridurre la produzione di piomelanina nel batterio in esame e a quali concentrazioni. Ciò consentirà all'utente di determinare la sensibilità all'NTBC, poiché diversi ceppi di batteri possono avere diverse sensibilità a questo composto, come osservato in P. aeruginosa12. In secondo luogo, il saggio di titolazione NTBC consentirà all'utente di determinare la concentrazione appropriata di NTBC da utilizzare nei test successivi, come i MIC antibiotici e i test di risposta allo stress ossidativo, se l'obiettivo è quello di abolire o ridurre la produzione di piomelanina e determinare gli effetti della riduzione del pigmento. 
Il test di titolazione funziona perché si può osservare una differenza visibile nella produzione di piomelanina nei ceppi trattati con NTBC e le differenze nella produzione di piomelanina dipendono dalla dose12. Inoltre, questa tecnica può essere applicata allo studio di altri composti che possono eliminare o migliorare la produzione di pigmenti nei batteri.
Le MIC antibiotiche vengono utilizzate per determinare la sensibilità dei batteri agli antibiotici. Esistono diversi metodi per determinare le MIC, tra cui le piastre di diluizione dell'agar e le diluizioni del brodo14. Le diluizioni del brodo possono essere eseguite in piccole provette o in una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Il metodo di determinazione della MIC su piastra per microtitolazione qui descritto consentirà all'utente di testare un'ampia gamma di antibiotici utilizzando un minimo di risorse. Il test offre riproducibilità e flessibilità nel numero di antibiotici e ceppi testati con questo metodo. Inoltre, con l'incorporazione di NTBC nel test, l'utente può determinare se l'eliminazione o la riduzione della produzione di piomelanina altera la sensibilità agli antibiotici nei batteri che producono piomelanina.
La risposta batterica allo stress ossidativo può essere testata in diversi modi. I metodi più comuni descritti sono la conta vitale dei batteri sottoposti a stress ossidativo per un periodo di tempo1 o i saggi di diffusione del disco da stress ossidativo15. Questi metodi tendono a utilizzare alte concentrazioni di fattori di stress ossidativo per esaminare gli effetti dello stress ossidativo nei batteri e i risultati possono essere piuttosto variabili tra le repliche biologiche. Il saggio di conta vitale tende anche a utilizzare più piastre di agar rispetto agli altri metodi. Il test su piastra spot che descriviamo utilizza basse concentrazioni di H2O2 e consente all'utente di testare la risposta allo stress ossidativo di più ceppi utilizzando un minimo di piastre. Il test è inoltre costantemente riproducibile tra repliche tecniche e biologiche. Poiché la piomelanina è coinvolta nella resistenza allo stress ossidativo, l'incorporazione di NTBC nel test consente all'utente di determinare gli effetti dell'eliminazione della produzione di piomelanina sulla resistenza allo stress ossidativo.

<table><tbody><tr><td>2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>Chiamato anche nitisinone. Solubile in DMSO.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 % in peso in H2O.&nbsp; Stabilizzato.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>solubile in H2O.&nbsp; Filtro sterilizzare.</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>solubile in H2O.&nbsp; Filtro sterilizzare.</td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>solubile in H2O.&nbsp; Filtro sterilizzare.</td></tr></tbody></table>

metodi per inibire batterica pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

La piomelanina è un pigmento extracellulare rosso-marrone prodotto da diverse specie batteriche e fungine. Questo pigmento deriva dalla via del catabolismo della tirosina e contribuisce ad aumentare la resistenza allo stress ossidativo. La produzione di piomelanina in Pseudomonas aeruginosa è ridotta in modo dose-dipendente attraverso il trattamento con 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC). Descriviamo un metodo di titolazione che utilizza concentrazioni multiple di NTBC per determinare la concentrazione del farmaco che ridurrà o abolirà la produzione di piomelanina nei batteri. Il metodo di titolazione ha un risultato facilmente quantificabile, una riduzione visibile della produzione di pigmenti con l'aumento delle concentrazioni di farmaci. Descriviamo anche un metodo di piastra per microtitolazione per dosare la concentrazione minima inibitoria (MIC) di antibiotici nei batteri. Questo metodo utilizza un numero minimo di risorse e può essere facilmente scalato per testare più antibiotici in una piastra per microtitolazione per un ceppo di batteri. Il test MIC può essere adattato per testare gli effetti di composti non antibiotici sulla crescita batterica a concentrazioni specifiche. Infine, descriviamo un metodo per testare la sensibilità batterica allo stress ossidativo incorporando H2O2 nelle piastre di agar e individuando più diluizioni di batteri sulle piastre. La sensibilità allo stress ossidativo è indicata dalla riduzione del numero e delle dimensioni delle colonie per le diverse diluizioni su piastre contenenti H2O2 rispetto a un controllo senza H2O2. Il test su piastra spot per lo stress ossidativo utilizza un minimo di risorse e basse concentrazioni di H2O2. È importante sottolineare che ha anche una buona riproducibilità. Questo test su piastra spot potrebbe essere adattato per testare la sensibilità batterica a vari composti incorporando i composti in piastre di agar e caratterizzando la crescita batterica risultante.

Titolazioni NTBC Le titolazioni NTBC sono stati utilizzati per determinare se NTBC è stata in grado di ridurre la produzione pyomelanin in P. aeruginosa, e anche identificare la concentrazione di NTBC che elimina o riduce pyomelanin produzione per uso in test aggiuntivi. Ci possono essere variazioni nei livelli di pyomelanin prodotto in diverse repliche, ma tendenze generali rimanere costante. Il saggio di titolazione NTBC potrebbe anche essere modificato per testare altri ...

La produzione batterica di piomelanina determina un aumento della resistenza allo stress ossidativo e alla virulenza. Riportiamo le tecniche che possono essere utilizzate per determinare l'inibizione della produzione di piomelanina e per valutare il conseguente aumento della sensibilità allo stress ossidativo nei batteri, oltre a determinare la concentrazione minima inibitoria (MIC) degli antibiotici.

Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Gli obiettivi generali dei seguenti esperimenti sono determinare gli effetti dell'NTBC sulla produzione di p melanina e sulla sensibilità allo stress ossidativo, nonché sulle concentrazioni minime inibitorie (MIC) degli antibiotici. Questo viene ottenuto aggiungendo NTBC a colture batteriche per determinare la concentrazione che riduce la produzione di p melanina come secondo passaggio. Le colture batteriche vengono trattate con NTBC e antibiotici, consentendo all'utilizzatore di verificare se il trattamento con NTBC influisce sulle MIC degli antibiotici.Colture trattate con NTPC vengono esposte al perossido di idrogeno al fine di determinare la sensibilità allo stress ossidativo; i risultati ottenuti mostrano che il trattamento di batteri genici con NTPC porta a una riduzione della produzione di pigmento e a un aumento della sensibilità allo stress ossidativo, senza alcun effetto sugli antibiotici MIC basati rispettivamente sui saggi spot per la risposta allo stress ossidativo e sui saggi MIC in microtitolazione. Il principale vantaggio della tecnica del piatto spot per lo stress ossidativo rispetto ai metodi esistenti, come i conteggi vitali e i saggi di diffusione su disco, è che possono essere utilizzate concentrazioni più basse di perossido di idrogeno, anziché le alte concentrazioni impiegate in altri saggi. Generalmente, chi si approccia per la prima volta al nostro metodo di determinazione degli antibiotici MIC incontra difficoltà a causa della mancanza di precisione nella tecnica di pipettaggio, che introduce variabilità tra le repliche.Questa variabilità può rendere difficile determinare con precisione l'antibiotico. MIC Un giorno prima del saggio MIC. Preparare colture dei ceppi da testare in LB con e senza.Due due nitro, quattro trior etil benzoil uno tre Cicloesano Dione, o NTBC. Questa dimostrazione utilizza un livello rappresentativo di 300 micromolare di NTBC. Il metodo di titolazione per determinare la concentrazione appropriata di NTBC è descritto nel testo del protocollo: incubare le colture tutta la notte a 37 gradi Celsius con aerazione al giorno successivo.Preparare soluzioni madri di LB con NTBC e di LB con DMSO per il saggio MIC al fine di testare un antibiotico su un ceppo utilizzando 600 micromoli di NTBC per due millilitri di LB e mescolare. Per preparare la soluzione madre di NTBC, si aggiunge NTBC a una concentrazione di 600 micromoli perché verrà diluito di due volte quando si aggiungerà l'inoculo.Aggiungere un volume equivalente del veicolo DMSO a due millilitri di LB per ottenere una concentrazione finale di 300 micromolare e mescolare per preparare la soluzione madre NO NTBC. Queste due soluzioni madri verranno utilizzate per preparare le soluzioni di antibiotico e per impostare la serie di diluizioni in piastre a 96 pozzetti. Successivamente, preparare le soluzioni di antibiotico nelle soluzioni madri di LB più NTBC o LB più DMSO.Preparare la soluzione madre di gentamicina più o meno NTBC a 64 microgrammi per millilitro. Preparare la soluzione madre di kanamicina più o meno NTBC a 256 microgrammi per millilitro. Preparare la soluzione madre di tobramicina più o meno NTB a otto microgrammi per millilitro.Dopo aver preparato le due soluzioni antibiotiche, aggiungere 100 microlitri di ciascuna soluzione antibiotica a quattro pozzetti in una piastra a 96 pozzetti, nella riga A. Ad esempio, la gentamicina deve essere aggiunta dai pozzetti A1 ad A4, la kanamicina dai pozzetti A5 ad A8 e la tobramicina dai pozzetti A9 ad A12. Aggiungere 50 microlitri della soluzione madre di LB più NTBC o LB più DMSO alle righe B-H della piastra a 96 pozzetti, assicurandosi che una piastra contenga LB più NTBC e l'altra LB più DMSO. Utilizzando una micropipetta, eseguire diluizioni seriali a due fold degli antibiotici trasferendo 50 microlitri della soluzione dalla riga A alla riga B. Mescolare la soluzione, cambiare le punte della pipetta e trasferire 50 microlitri della soluzione dalla riga B alla riga C. Ripetere per le righe rimanenti fino alla riga G. Dopo aver diluito la riga G, rimuovere 50 microlitri della soluzione da tale riga e scartarli.Utilizzare la riga H come controllo senza antibiotico per la crescita batterica. Recuperare le colture ottenute durante la notte dopo aver lavato tutte le colture per eliminare la lanina presente nel mezzo, misurare l'OD 600 delle colture e diluire le colture notturne in lb. utilizzando un multicanale micropipettatore.Aggiungere 50 microlitri della coltura batterica diluita nei pozzetti appropriati. Aggiungere batteri in tre pozzetti per ogni ceppo e concentrazione di antibiotico. Aggiungere 50 microlitri di LB nel quarto pozzetto come controllo per la contaminazione batterica.Coprire le piastre a 96 pozzetti con perfil e incubare per circa 24 ore a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Esaminare visivamente le piastre per verificare la crescita batterica nei pozzetti. L'MIC è la concentrazione più bassa di antibiotico in cui non si osserva crescita batterica in tutte e tre le replicazioni di ciascun ceppo.Per iniziare questa procedura, preparare colture notturne dei ceppi da testare in LB con e senza NTBC come mostrato in precedenza, da utilizzare il giorno seguente. Preparare piastre di LB APL contenenti perossido di idrogeno come agente stressante ossidativo. Innanzitutto, sciogliere i flaconi di agar LB e raffreddare il terreno a circa 50 gradi Celsius a temperatura ambiente.Successivamente, aggiungere il perossido di idrogeno direttamente al mezzo raffreddato alle concentrazioni desiderate. Agitare delicatamente il matraccio per mescolare una serie di concentrazioni di perossido di idrogeno comprese tra zero e uno. Un valore di un millimolare è un buon punto di partenza.Versare immediatamente le piastre e passare la fiamma sulla superficie per rimuovere le bolle. Il rendimento è di quattro piastre ogni 100 millilitri di agar LB. Contrassegnare le piastre con la concentrazione di perossido di idrogeno.Posizionare le piastre scoperte in una cappa biologica con il ventilatore acceso per 30 minuti per rimuovere l'eccesso di umidità dalle piastre. Le piastre devono essere utilizzate lo stesso giorno. Vengono preparate mentre le piastre si asciugano, lavare e misurare.L'OD 600 delle colture notturne normalizza l'OD 600 di tutte le colture notturne al valore più basso per il set di ceppi in esame. Per fare ciò, determinare il volume di coltura necessario per diluire la coltura fino al valore più basso di OD 600 in un volume totale di un millilitro. Ad esempio, se una coltura ha un OD 600 di tre e il valore più basso di OD 600 per il set di ceppi è 2,5, eseguire il seguente calcolo, che darà come risultato 0,833 millilitri come volume di coltura necessario; posizionare 0,833 millilitri di coltura in una provetta microcentrifuga.Successivamente, calcolare la quantità di LB più NTBC o LB più DMSO necessaria per portare il volume della coltura a un millilitro. In questo esempio, la quantità sarebbe di 0,167 millilitri; miscelare per vortex per mantenere le colture in una concentrazione costante di NTBC o DMSO. Eseguire una diluizione seriale decimale delle colture normalizzate in PBS più NTBC o PBS più DMSO. Preparare soluzioni stock di PBS più NTBC e PBS più DMSO, aumentando o riducendo le quantità a seconda del numero di ceppi da testare. Per un set di diluizioni per un ceppo, aggiungere 300 micromolari di NTBC o un volume equivalente di DMSO a PBS teal, per un volume totale di 720 microlitri. Aggiungere 90 microlitri di PBS più NTBC o PBS più DMSO nei rispettivi tubi microcentrifuga etichettati per le diluizioni seriali da 10 alla meno uno a 10 alla meno sette.Aggiungere 10 microlitri di coltura al rispettivo tubo di diluizione 10 alla meno uno, mescolare mediante vortex e trasferire 10 microlitri della diluizione 10 alla meno uno al tubo di diluizione 10 alla meno due. Cambiare le punte della pipetta tra ogni diluizione e ripetere fino a quando tutte le diluizioni sono state effettuate. Depositare 5 microlitri delle diluizioni da 10 alla meno tre a 10 alla meno sette su piastre di LV contenenti perossido di idrogeno, in duplicato.Per ogni ceppo, utilizzare un solo puntale di pipetta. Se si piastrano spot partendo dalla diluizione più alta fino a quella minore, non inclinare né rovesciare la piastra finché il liquido non si è completamente asciugato sulla superficie. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24-48 ore, in base al ceppo.Una volta comparse colonie di dimensioni adeguate, fotografare le piastre utilizzando una telecamera CCD posizionata sopra un transluminatore. Le titolazioni di NTBC sono state utilizzate per determinare se NTBC fosse in grado di ridurre la produzione di melanina p in p aerogen e per identificare la concentrazione di NTBC che elimina o riduce la produzione di melanina p, da utilizzare in saggi aggiuntivi come mostrato qui. NTBC ha ridotto la produzione di melanina PY in modo dose-dipendente nei ceppi produttori di melanina p, ma non ha avuto alcun effetto sulla produzione di pigmento nei ceppi che non producono melanina p.Questo tavolo mostra i risultati del saggio MIC per diversi ceppi di p aerogen trattati con e senza NTBC e vari antibiotici; i valori MIC sono stati registrati come la concentrazione più bassa di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica. Il trattamento con NDBC non ha avuto alcun effetto sui valori MIC degli antibiotici per i ceppi testati. È stato eseguito un saggio su piastra a spot per valutare la risposta allo stress ossidativo su ceppi produttori e non produttori di melanina PIO trattati con e senza NDBC.La piastra con zero millimoli di perossido di idrogeno ha mostrato che tutte le ceppature sono state diluite correttamente ed è stata osservata un'aumentata sensibilità allo stress ossidativo quando i batteri produttori di melanina PIO sono stati trattati con NTBC; le ceppature che non producono melanina PIO si sono rivelate più sensibili allo stress ossidativo rispetto a quelle che producono melanina p. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare gli effetti del trattamento con NTBC sulla produzione di melanina PIO testando la sensibilità allo stress ossidativo e ai livelli minimi inibitori di antibiotici (MIC).

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Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo (Video) | JoVE Journal

Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

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