Esecuzione permanente distale Medio cerebrale con arteria carotide comune di occlusione in ratti anziani per studiare corticale Ischemia con disabilità sostenuta

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media, o MCA, in un modello di ratto anziano. Questo viene realizzato esponendo prima le arterie carotidee e posizionando intorno ad esse un laccio allentato per la successiva legatura. Nel secondo passaggio, si pratica un foro nel cranio per esporre l'MCA.

Il vaso viene quindi coagulato con pinze per iniziare l'occlusione. Nell'ultima fase, l'arteria carotide destra viene legata in modo permanente e la carotide sinistra viene occlusa in modo transitorio. Infine, viene utilizzata un'immagine ponderata in T2 mediante risonanza magnetica per osservare le dimensioni della lesione e confermare il successo della procedura.

Questo modello permette di ottenere infarti di dimensioni riproducibili nell'area dell'arteria cerebrale media e deficit comportamentali persistenti in ratti anziani. Prima di iniziare la procedura, verificare il corretto livello di sedazione attraverso l'assenza di risposta alla pinzatura delle dita dei piedi in un ratto femmina anziano Lister Hooded di età compresa tra 16 e 18 mesi, e somministrare l'analgesico appropriato. Successivamente, rasare il pelo nella regione ventrale del collo e nella regione temporale dell'emisfero destro dell'animale, e utilizzare tamponi imbevuti di etanolo per disinfettare la cute esposta.

Posizionare il ratto in posizione supina su un tavolo di sughero coperto con un telo sterile, posto sopra un tappetino riscaldante, e applicare una crema a base di lidocaina sulle aree rasate della testa e del collo. Inserire una sonda rettale per mantenere la temperatura corporea tra 36,5 e 37,5 gradi Celsius e applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Successivamente, iniettare nel ratto 0,05 millilitri di solfato di atropina per ridurre le secrezioni tracheali e posizionare l'animale sotto un microscopio stereoscopico.

Iniziare la procedura chirurgica con un'incisione mediana centrale di due centimetri nel collo esposto e spostare delicatamente le ghiandole salivari lateralmente rispetto alla trachea su entrambi i lati dell'animale. Successivamente, sul lato destro del collo, passare un punto di sutura in seta non riassorbibile 5-0 attraverso la cute sovrastante la regione esposta e utilizzare il punto per tirare delicatamente la cute lontano dall'incisione. Utilizzando nastro chirurgico, fissare i punti alla tavola di sughero per esporre l'arteria carotide comune.

Quindi, utilizzando una pinzetta, dissezionare con cautela l'arteria dalla fascia circostante in modo ottuso. Una volta esposta l'arteria carotide comune, utilizzare una pinzetta fine per dissezionare in senso inverso l'arteria dal nervo vago, avendo cura di non entrare in contatto con il nervo. Passare un laccio vascolare intorno al vaso con un filo di sutura non riassorbibile e fissare le estremità del filo insieme con nastro chirurgico.

Rimuovere quindi i punti che trattengono la cute sovrastante, assicurandosi che non vi sia alcun interferenza con il punto posizionato attorno all'arteria carotidea. Ripetere la procedura sul lato sinistro come appena dimostrato. Dopo aver posizionato il punto attorno a entrambe le arterie e rimosso i punti aggiuntivi, inserire una garza sterile imbevuta di soluzione salina nella ferita per mantenere i tessuti umidi e suturare la cute in modo lasso.

Posizionare un'altra garza inumidita con soluzione salina sulla zona per prevenire un'ulteriore disidratazione e posizionare il ratto in decubito laterale. Incidere la cute nel punto mediano tra l'orbita destra e il condotto uditivo esterno. Successivamente, effettuare una dissezione ottusa del muscolo temporale per esporre il cranio.

Quindi, utilizzando fino a cinque retrattori elastici a uncino da tre millimetri, retrarre e fissare la pelle al supporto di sughero. Successivamente, posizionare sopra l’area esposta, nel punto più alto del cranio vicino all’orecchio, una goccia di soluzione salina regolata con una rotella a pollice e azionata per gravità, e predisporre un sistema di aspirazione con il beccuccio nel punto più basso per rimuovere eventuali detriti ossei e per eliminare qualsiasi lieve sanguinamento dall’area esposta. Regolare la rotella per visualizzare la fonte del sanguinamento, se necessario.

Ora utilizzare un trapano dentale con una fresa diamantata grossolana da 1,6 millimetri a circa 8.000 giri al minuto per eseguire una craniotomia di cinque millimetri per cinque millimetri sulla regione esposta, avendo cura di applicare una pressione circolare e laterale, ma non verso il basso durante la perforazione. Quando il tessuto osseo diventa completamente trasparente, utilizzare una pinza per rimuovere l'osso. Successivamente, usando un uncino durale fatto in casa, aprire con attenzione la dura madre, avendo cura di evitare la rottura dei vasi sanguigni superficiali di grandi dimensioni.

Successivamente, utilizzare una pinza diatermica per gioiellieri angolata con punte appuntite da 0,25 millimetri per coagulare l'arteria cerebrale media (MCA) dal punto in cui la vena cerebrale inferiore la attraversa fino al punto di biforcazione dell'arteria, e quindi lungo il ramo caudale della MCA fino a quando i vasi non sono completamente occlusi. Quindi, per confermare che l'occlusione sia completa, utilizzare forbici microvascolari per recidere il tratto della MCA occlusa che si trova al di sotto del punto in cui la vena cerebrale inferiore attraversa la MCA. Ora coprire l'area esposta con una garza imbevuta di soluzione salina e riportare il ratto in posizione supina.

Riaprire il punto di sutura legato in modo lento sul collo per riesporre le arterie carotidee e fare un nodo nella sutura intorno all'arteria dallo stesso lato della MCA occlusa per legare in modo permanente il vaso. Successivamente, utilizzare un clip arterioso in acciaio inossidabile da 13 millimetri con una pressione di circa 125 grammi per legare in modo transitorio l'arteria carotidea sinistra per un'ora. Durante l'occlusione temporanea, suturare in modo lento l'incisione sul collo e posizionare una seconda garza sterile imbevuta di soluzione salina sull'incisione.

Successivamente, suturare l'incisione nella regione temporale, seguita da quattro iniezioni sottocutanee di cinque millilitri di soluzione salina. Al termine del periodo di occlusione temporanea, rimuovere la clip e applicare soluzione salina in modo topico sul muscolo circostante. Quindi, utilizzando una sutura continua sottocutanea con punti assorbibili 4-0, chiudere l'incisione nel collo e lasciare l'animale riprendersi dall'anestesia per quattro ore in un incubatore a 31 gradi Celsius.

Se un ratto mostra una perdita di peso dopo l'intervento chirurgico, ispezionare i denti superiori e inferiori. Successivamente, con l'animale in posizione supina, posizionare il cilindro di una siringa da un millimetro dietro ai denti per proteggere i tessuti molli ed utilizzare un seghetto circolare manuale ad alta velocità di rotazione ed a movimenti lenti e fermi per limare i denti dell'animale. Per misurare il volume dell'infarto, 24 ore dopo l'induzione dell'occlusione dell'arteria cerebrale media, utilizzare la risonanza magnetica strutturale per ottenere scansioni pesate in T2.

Quindi misurare l'area trasversale dell'infarto in 20 volumi per ottenere i volumi delle lesioni mediante un pacchetto software per la visualizzazione di immagini mediche e moltiplicare la somma di queste aree per lo spessore al fine di ottenere il volume totale dell'infarto. Per il calcolo della percentuale di volume della lesione, acquisire anche i volumi degli emisferi ipsilesionale e controlesionale. Per calcolare la dimensione del campione per studi futuri, utilizzare un software di analisi statistica per determinare i calcoli della dimensione del campione necessari per stimare le dimensioni dei gruppi richieste per identificare gli effetti del trattamento di diverse entità.

In questo esperimento, l'esito dell'ictus è stato valutato 24 ore e otto settimane dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media, come appena dimostrato, identificando il volume dell'infarto come le aree del cervello del ratto che mostravano un segnale iperintenso. In questo esperimento rappresentativo, a 24 ore il volume della lesione grezzo, non corretto, era di 62,8 millimetri cubi, con la lesione che occupava il 9,8 percento dell'emisfero colpito. Quando corretto per il gonfiore cerebrale utilizzando la formula di Gerriets, questo valore si riduceva al 4,5 percento.

La gravità dell'ictus è stata inoltre misurata mediante il test della scala di Montoya, con una riduzione di circa il 40 percento nel recupero del pellet di zucchero osservata negli animali con ictus da occlusione dell'arteria cerebrale media. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di dissezionare con attenzione i nervi vago durante la manipolazione delle arterie carotidi per la legatura, poiché il danno a questi nervi può influire negativamente sul recupero dell'animale. Dopo questa procedura, è possibile somministrare trattamenti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio in che modo la neuroprotezione possa influenzare le dimensioni dell'infarto e quali trattamenti potrebbero migliorare l'esito dopo l'ictus.