Name: Metodo criosezionamento per Microdissezione di Murine colon mucosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Impara la microdissezione criosezionata del colon murino per isolare le cellule epiteliali della superficie e della base delle cripte. Questa tecnica rapida e economica consente analisi di espressione genica e proteica.

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Supportato dal National Institutes of Health (DK55679, e DK59888 ad A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292 e il Crohn's and Colitis Foundation of America Career Development award a C.T.C. e Fellowship Award a A.E.F.

Esperimenti utilizzati topi C57BL / 6 tra 10 e 12 settimane di età. Tutte le procedure che utilizzano gli animali sono stati esaminati e approvati dall&#39;Università Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali Emory e sono state eseguite secondo National Institutes of Criteri sanitari. 1. Setup sperimentale <ol><li> Impostazione del criostato <ol><li> Equilibrare criostato a -20 ° C, tra cui la lama microtomo e mandrini (estrema cautela intorno alla lama!). </li><li> Riempire un vuoto con cryomold ottobre (Ottimale composta Taglio temperatura) ed equilibrare a -20 ° C (~ 30 min). Rimuovere l&#39;ottobre congelato dallo stampo e fissarlo sul mandrino con liquido ottobre Posizionare il blocco / mandrino nel braccio microtomo e consentire di Office per impostare per 10 minuti. </li><li> Impostare il criostato a 10 micron per sezione e radersi il blocco ottobre fino a quando non è piatta. Eseguire il braccio microtomo lontano dalla lama di alcuni centimetri. A questo punto non regolare la lama o mandrino per il resto della experiment. </li></ol></li><li> Preparare le lamette da barba: Preparare 2 lamette per campione. Utilizzo di un file di metallo, opaco bordo sharped di lame. Quindi, rimuovere la flangia in alluminio con una pinza. </li><li> Pre-raffreddare una pirofila o altra superficie piatta in ghiaccio secco. </li><li> Preparare un piatto dissezione con 10-15 perni dissezione. A 10 centimetri piatto di coltura tissutale 50% pieno di silicio sarà sufficiente. Aggiungere 5 ml di tampone Hanks a temperatura ambiente. </li></ol> 2. dissezione distale colon Tissue <ol><li> Topi posto in una camera sigillata e Euthanize topi per inalazione isoflurano e dislocazione cervicale, quindi spruzzare il 70% di etanolo sul ventre e del torace 12. </li><li> Fai una piccola incisione nella pelle dell&#39;addome con le forbici e poi fare un&#39;incisione per esporre la cavità peritoneale. Procedure simili si possono trovare qui 12 descritto. </li><li> Tagliare l&#39;intestino crasso al margine anale e prendere in giro a parte il mesentere fino a quando il colon è gratuito. </li><li> Accise un colon distalesegmento tra 0 e 6 cm dalla ano. Qui, la profondità cripta ~ 150 micron (vedere Figura 1B). Taglio aperto il colon longitudinalmente con le forbici e rimuovere il contenuto fecale. </li><li> Pin il tessuto al piatto dissezione con la superficie della mucosa rivolta verso l&#39;alto. Allungare il tessuto con perni dissezione su un piatto di silicio in tampone Hanks e lasciare riposare per 10 minuti a temperatura ambiente (Figura 1C). Questo elimina pieghe dal tessuto e permette strati muscolari di rilassarsi. </li></ol> 3. Montare tessuto sulla Criostato per il sezionamento <ol><li> Infilare una lametta sotto la sezione desiderata del tessuto e quindi versare il tampone Hanks. Aggiungere un&#39;altra lametta all&#39;inizio, facendo un sandwich. Tagliare il segmento tessuti e rimuovere i perni. Trasferire il panino lametta / tessuto a ghiaccio secco. Lasciare che il tessuto di congelare (5-10 min, Figura 1D). </li><li> Sollevare il rasoio / panino tessuto e lasciarlo riscaldare leggermente mettendo un dito sul bl superioreade (lato mucosale up. Questo orienta il tessuto in modo che gli strati muscolari basali sono sezionate prima.). Separare il sandwich e tagliare lungo i bordi del segmento tissue. Tagliare un segmento di tessuto di circa 0,5 x 1 cm. Aree di bordo hanno la tendenza ad arricciarsi, causando sezioni seriali contengono molti strati di tessuto. Si noti che l&#39;eccesso di taglio è migliore di sotto-taglio, in modo sbagliare sul lato della cautela. </li><li> Lasciare il tessuto riscaldare fino ghiaccio sulla parte superiore del tessuto inizia a fondere. A questo punto rapidamente e con attenzione premere il tessuto nel blocco OCT criostato. </li><li> Rimuovere la lama inserendo un dito sul campione. Il trasferimento di calore permette di rimuovere la lama senza interrompere il tessuto. </li><li> Cappotto il tessuto con ottobre e equilibrare per 5 minuti. Tagliare le sezioni a 10 micron (Figura 1E, F). Visivamente sezioni fino a quando le cripte sono visti. Luogo sezioni in un provette da 1,5 ml o su diapositive. </li><li> Per l&#39;analisi di mRNA e di proteine, luogo tegli campioni in tubi con 5 cripta-base, 5 di transizione, e 5 sezioni di superficie per provetta. Per la raccolta RNA aggiungere 1 ml di reagente commerciale isolamento e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Eseguire la purificazione di RNA secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 5-10 mg di RNA totale per la generazione di cDNA. </li><li> Per purificazione della proteina, aggiungere 0,5 ml di freddo RIPA Lysis Buffer (più inibitori della proteasi) per 5 sezioni. Sonicare 3 volte in un ciclo di 70%, su ghiaccio. <ol><li> Aggiungere esempi di SDS tampone di caricamento delle pagine (buffer Laemmli) e incubare a 100 ° C per 10 min. Campioni soggetti a SDS PAGE e trasferimento, poi bloccano in 5% di latte / PBS per 2 ore. Eseguire l&#39;analisi Western Blot seguita da incubazione con anticorpi Klf4 (1: 500) O / N a 4 ° C. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

I meccanismi molecolari coinvolti nella proliferazione delle cellule epiteliali del colon e la differenziazione sono poco conosciute. Questo include lacune nella nostra comprensione dell&#39;ambiente segnalazione cellulare del compartimento di cellule staminali alla base delle cripte epiteliali del colon. Vi è anche un crescente interesse per i processi che stanno alla base di differenziazione enterociti. Ad esempio, ha aumentato la comprensione di differenziazione in vivo è necessaria come punto di riferimento per gli studi volti a produrre in vitro sistemi intestinali primarie 16. La procedura di cui sopra contiene diversi passaggi che richiedono una particolare attenzione. In primo luogo, eliminando i bordi intorno al segmento tessuto congelato (come discusso nella sezione 3.2) è richiesto come i bordi di tessuto riccio durante la dissezione e il congelamento. La mancata spostare questi spigoli risultati è una popolazione mista di cellule superficiali e base cripta. Montaggio il tessuto su una, ottobre blocco livellati pre-raffreddata è anche essenziale. Tsuo protocollo può essere adattato ad altre zone del colon distale modificando il numero di sezioni in ciascun pool. Ad esempio, come mostrato nella Figura 1B, lunghezza cripta mucosa varia tra 150-300 micron. Pertanto, quando si studia la regione tra 4 CM-6 centimetri dall&#39;ano, il numero di sezioni dovrebbe essere aumentato da 15 a 30. È importante sottolineare che questo protocollo non è suggerito per il colon prossimale (7 gli cm-9 cm) a causa di pieghe ( pliche obliquae) che si estendono nel lume rendendo impossibile superficie e la cripta-base celle separate di sezionamento seriale. Tecniche di sezionamento seriali sono state usate per studiare cripta-base e la superficie popolazioni di cellule epiteliali nell&#39;uomo. Tuttavia, il nostro protocollo aggiunge passaggi aggiuntivi richiesti a causa delle piccole dimensioni del tessuto murino. Proponiamo che il protocollo di cui sopra consentirà la ricerca di cripta-base e la popolazione di cellule epiteliali di superficie nei sistemi geneticamente trattabili mouse. In effetti, le sezioni pool Yield proteine ​​di alta qualità e RNA analisi valle adatto. Le applicazioni future potrebbero includere lo studio delle vie di segnalazione cellulare o immunoprecipitazione della cromatina. Tuttavia, va notato che, come molti dei metodi alternativi descritti sopra, le sezioni ottenute contengono una miscela di cellule lamina propria epiteliali e interstiziali. In conclusione, il protocollo qui descritto fornisce un rapido metodo del rendimento, alta per l&#39;analisi dei processi molecolari in regioni spazialmente distinte della mucosa del colon murino.

Il rivestimento epiteliale del colon è un tessuto altamente rigenerativa, con le cellule staminali residenti rifornire il tessuto ogni pochi giorni 1. Questo processo di rigenerazione richiede il mantenimento di un compartimento staminale proliferativa. Nel corso del tempo, le cellule figlie nuova produzione perdono il loro potenziale proliferativo e migrano verso la superficie luminale dell&#39;intestino. In coincidenza con la migrazione, le cellule progenitrici differenziarsi in enterociti-barriera che formano mature o cellule caliciformi che producono muco. Fallimento di questo programma differenziazione è pensato per contribuire alla compromissione barriera epiteliale, come si osserva nella malattia infiammatoria intestinale e del colon 2,3. Studio dettagliato dei processi di cui sopra richiede metodologie per isolare le popolazioni cripta-base e delle cellule di superficie. Esistono metodi multipli, ciascuno con vantaggi e svantaggi. Gli attuali metodi per l&#39;isolamento delle cellule epiteliali intestinali includono chagenti elating e dissociazione meccanica, con conseguente isolamento di intere cripte, fogli epiteliali, o cellule singole, dipendenti condizioni sperimentali 4,5. Questi sono metodi ad alto rendimento, ma i cambiamenti nella segnalazione intercellulare sono stati riportati in queste condizioni, che non possono rappresentare l&#39;ambiente nativo 6,7. Microdissezione laser consente la raccolta di materiale spaziale distinte, ma realizza bassa resa 8,9 molecolare. Nel tessuto del colon umano, metodi criosezionamento orizzontali di serie sono stati sviluppati 10. Tuttavia, mucose murini sono proibitivamente piccole per appropriazione diretta di questa tecnica. Negli esseri umani, le lunghezze cripta intestinale (la distanza tra la cripta-base e cellule di superficie), nel colon varia tra ~ 100-1.000 micron 11. Nei topi, le lunghezze cripta sono tra ~ 50-300 micron (vedi Figura 1A). Le piccole dimensioni delle cripte murine rappresenta una sfida per l&#39;isolazione di queste due popolazioni cellulari che utilizzano protocolli esistenti. Descriviamo ora un basso costo, il metodo ad alto rendimento per l&#39;isolamento di cripta-base e la superficie popolazione di cellule epiteliali nel tessuto del colon murino. Tissue raccolti in questo modo può poi essere analizzato da un certo numero di applicazioni a valle standard, tra immunofluorescenza, RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) o western blotting.

<table><tbody><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Germania</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>Rivelatore di PCR in tempo reale MyiQ</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&nbsp;</td><td>Microscopio confocale</td> <td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cryo-mold</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>Lama per microtomo ad alto profilo</td><td>Leica Biosystems, Nussloch germany</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>Lame industriali GEM</td><td>Lame di rasoio di sicurezza americane</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silicone elastomero base</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 g ago</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td>perni per dissezione</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo ZO-1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo KLF4</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Alexa secondario coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 anti-coniglio</td></tr><tr><td>Anticorpo HRP secondario coniugato</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>coniglio/topo&nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs tampone salino bilanciato</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr>tampone <td></td><td></td><td>di lisi RIPA</td><td>50mM Tris-HCl pH 7,4 150mM NaCl 1% NP40 0,25% Na-desossicolato</td></tr><tr><td>primer TBP</td> 3'GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>primer TBP 5'GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>primer KLF4</td> <td>3'TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>primer KLF4</td> 5'ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT <td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodo criosezionamento per microdissezione di murine colon mucosa

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Il tessuto mucoso del colon fornisce una barriera vitale agli antigeni luminali. Questa barriera è composta da un monostrato di semplici cellule epiteliali colonnari. L'epitelio del colon viene girato dinamicamente e le cellule epiteliali vengono generate nella cellula staminale contenente le cripte di Lieberkühn. Le cellule progenitrici prodotte nelle cripte-basi migrano verso la superficie luminale, subendo un processo di differenziazione cellulare prima di essere rilasciate nel lume intestinale. Al fine di studiare questi processi a livello molecolare, abbiamo sviluppato un metodo semplice per la microdissezione di due regioni spazialmente distinte della mucosa del colon; la zona della cripta proliferativa e le cellule epiteliali superficiali differenziate. Il nostro obiettivo è isolare specifiche popolazioni di cellule epiteliali di cripta e di superficie dalla mucosa del colon di topo per l'isolamento di RNA e proteine.

Sezioni di tessuto del colon sono stati elaborati per la valutazione istologica e H &amp; E colorazione 13. Una visione tradizionale sezione trasversale della mucosa è visto in Figura 2A. Aree basali contengono il externa muscolare, composta principalmente delle muscolare circolari. Procedendo verso il lume, la mucosa muscolare è evidente adiacente alle cellule epiteliali cripta-base, cellule transizionali sono al centro del tessuto, e, infine, popolazioni cellulari superficie faccia lume intestinale. Il metodo descritto qui sezionamento seriale mantiene un orientamento tale che le muscolare longitudinali e circolari sono incontrate, prima (Figura 2B), seguita dalla mucosa muscolare (Figura 2C). Si noti la comparsa di cellule interstiziali non muscolari in alto a sinistra dell&#39;immagine. Per l&#39;analisi valle descritto di seguito, le sezioni muscolari vengono scartati. Le sezioni successive contengono cellule epiteliali e tessuto interstiziale (lamina propria), A partire dalle cellule cripta-base (Figura 2D). Si noti l&#39;assenza di un lume centrale nella maggior parte delle cripte, che appaiono più scuro a causa dei nuclei fitte. Questi strati contengono il vano proliferativa. Le cellule di transizione appaiono come accuratamente imballati ghiandole con lumen centrali importanti (Figura 2E). Infine, le popolazioni di cellule superficie hanno una struttura irregolare, con aree del monostrato epiteliale visto en face (Figura 2F). Sezioni seriali descritti sopra possono anche essere trattati per l&#39;etichettatura immunofluorescenza e microscopia confocale (come descritto qui 14). La figura 2G mostra cripte isolate fissi e permeabilizzate in 100% di metanolo e successivamente colorate per nuclei (blu) e la proteina giunzione cellula-cellula zonula occludere 1 (ZO-1, verde). Nel orientamento sezionamento tradizionale, cellule cripta e la superficie può essere visto contemporaneamente (Figura 2G </strong&gt;). Si noti che le linee ZO-1 macchia giunzionale lume della cripta del colon. Questo rivestimento Z0-1 del lume può essere visto anche in campioni seriali sezionate di popolazioni cellulari transitorie, nel centro delle ghiandole circolari (figura 2G). Avanzato ZO-1 macchia è visto in popolazioni cellulari di superficie (figura 2I e J). Diversi fattori di differenziazione sono noti per essere espressi in modo spaziotemporale lungo l&#39;asse cripta-superficie. Questo include il fattore di fattore di trascrizione Kruppel-like 4 (Klf4), che è noto per essere arricchito in popolazioni cellulari di superficie. Con i metodi tradizionali di sezionamento, Klf4 si trova nei nuclei di lume di fronte popolazioni cellulari di superficie (Figura 2K). Abbiamo quindi ipotizzato che Klf4 mRNA sarebbe espressa prevalentemente in popolazioni di cellule superficiali. Per verificare ciò, sezioni seriali sono stati raccolti e raggruppati in campioni di superficie, di transizione, e cripta-base. Subsequente, RNA è stato raccolto con l&#39;estrazione di serie Trizol, con una purificazione supplementare RNeasy colonna e trattamento DNAsi. L&#39;RNA è stato raccolto da 5 sezioni consecutive messe in comune, che diedero tra 5-10 mg di RNA totale per campione. Questi campioni sono stati poi sottoposti a semi-quantitativa real time PCR sia Klf4 e un gene di riferimento, TATA binding protein 1 scatola (TBP-1) (Figura 2L) 14. Come mostrato in Figura 2L, dopo la normalizzazione di TBP-1, cellule superficiali sono stati trovati per esprimere fino a 8 volte il Klf4 mRNA che è espresso nelle cellule cripta. Allo stesso modo, sono stati trovati livelli di proteina Klf4 esporre regolazione spaziale lungo l&#39;asse cripta superficie. Sezioni seriali sono stati riuniti come descritto sopra e poi incubate in tampone di lisi per 20 min a 4 ° C. Questo ha prodotto tra 200-250 mg di proteine ​​per campione. I campioni sono stati poi sottoposti analisi mediante SDS-PAGE (Figura 2M) 15. Come mostrato nella Figura 2M, Klf4 plivelli rotein sono drammaticamente più alta in popolazioni di cellule di superficie. I risultati di cui sopra dimostrano la capacità di questo protocollo per isolare grandi quantità di superficie e le cellule epiteliali cripta della mucosa del colon murino. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> Figura 1: (A) mostra schematica murine mucosa del colon e strati muscolari esterni. Il nostro metodo si propone di raccogliere cellulari di superficie e la cripta-base popolazioni cellulari discreti criosezionamento seriale (10 micron ciascuna). Gli strati muscolari esterni vengono scartati. Altezza (B) cripta varia lungo la lunghezza del colon (distanza interstrato cripta-base e la superficie). I punti dati indicano singole misurazioni cripta e simboli indicano repliche biologiche (n = 4). (C) segmenti Colon raccolti, Diviso in due parti, e appuntato su un piatto di silicio dissezione. (D) Un tessuto segment circa 3 cm dal ano si preme tra di lamette da barba e congelati in ghiaccio secco. (E) tessuto viene poi montato su un blocco Ottobre pre-livellato. (F) criosezioni vengono rimosse ed esame visivo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> Figura 2:. Dati rappresentativi (A) tessuto del colon colorate con ematossilina-eosina in sezione trasversale che mostra la muscolaris circolari (cm), la mucosa muscolare (mm), cellule cripta-base, cellule di transizione, e cellule superficiali. (B - C) strati muscolari del colon. (D) le cellule Cripta-base. Si noti l&#39;assenza di un lume centrale. (E) le cellule di transizione. (F), le cellule di superficie. (G) Immunofluorescenza di isolati cripte del colon. ZO-1 (verde) e nuclei (blu) si osservano in sezione trasversale. (CIAO) ZO-1 e colorazione nucleare in cellule di transizione e di superficie. (J) vista ingrandita ZO-1 colorazione. (K) Klf4 (verde) si arricchisce in popolazioni di cellule di superficie. (L) Real-time PCR valutazione dei livelli di mRNA Klf4 tra i tre compartimenti. (M) Western blot dei livelli di proteine ​​Klf4 in queste popolazioni di cellule.

Qui descriviamo un metodo semplice per l'isolamento di cellule di superficie epiteliali murine del colon spazialmente distinte dalle cellule cripto-base sottostanti.

Metodo criosezionamento per Microdissezione di Murine colon mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare microscopicamente due regioni distinte dello spazio del colon: la zona criptica proliferativa K e le cellule epiteliali superficiali differenziate. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il colon del topo. Il secondo passaggio consiste nel congelare il tessuto tra due piastre di metallo.Successivamente, il tessuto viene montato su un blocco di OCT precedentemente livellato. L'ultimo passaggio consiste nel sezionare il tessuto con un criostato a intervalli di 10 micron. Infine, la PCR in tempo reale o il Western blot vengono utilizzati per mostrare i cambiamenti nell'espressione genica e proteica.Il vantaggio della nostra tecnica è che è rapida, economica e dimostra un'elevata resa. Il nostro procedimento è Christian Garner Schmidt, un tecnico del nostro gruppo. Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state esaminate e approvate dal Comitato per la Cura e l'Utilizzo degli Animali dell'Università di Emory e sono state eseguite secondo i criteri dei National Institutes of Health.Dopo aver configurato il criostato, come di consueto, portare le lame e i portacampioni del criostato all'equilibrio a meno 20 gradi Celsius. Quindi riempire uno stampo criogenico vuoto con il composto ottimale per il taglio in temperatura (OCT) e portarlo all'equilibrio a meno 20 gradi Celsius. Questo richiederà circa 30 minuti.Rimuovere l'OCT congelato dallo stampo e fissarlo al mandrino con OCT liquido. Posizionare il mandrino sul braccio del microtomo e lasciare solidificare l'OCT per 10 minuti. Impostare il criostato a 10 micron per sezione e affettare il blocco di OCT fino a quando non diventa piano, quindi spostare il braccio del microtomo lontano dalla lama di alcuni centimetri.Successivamente, preparare due lamette per campione utilizzando una lima metallica, arrotondando il bordo tagliente delle lamette. Quindi rimuovere la flangia in alluminio con pinzette. Preparare una piastra per colture di 10 centimetri, riempita al 50% con silicone e dotata di 10-15 spilli da dissezione.Aggiungere cinque millilitri di soluzione tampone di Hank a temperatura ambiente alla piastra dopo aver eutanasizzato il topo secondo metodi approvati ed escisso un segmento del colon distale compreso tra zero e sei centimetri dall'ano. Usare le forbici per tagliare. Aprire longitudinalmente il colon ed eliminare il contenuto fecale.Fissare il tessuto alla piastra di dissezione in silicone contenente la soluzione tampone di Hank con la superficie mucosa rivolta verso l'alto. Stendere il tessuto utilizzando i perni da dissezione. Lasciarlo quindi riposare per 10 minuti a temperatura ambiente per eliminare le pieghe dal tessuto e permettere il rilassamento degli strati muscolari.Dopo che il tessuto ha riposato, rimuovere tutti i perni tranne quelli alle estremità. Far scivolare una lama di rasoio sotto la sezione di tessuto desiderata, quindi versare via il buffer di Hanks. Aggiungere un'altra lama di rasoio sulla parte superiore, formando un sandwich.Tagliare il segmento di tessuto e rimuovere i perni terminali. Trasferire il "sandwich" di tessuto e lametta su anidride carbonica solida. Lasciare congelare il tessuto per cinque-dieci minuti.Prendere il sandwich di tessuto con il rasoio e lasciarlo scaldare leggermente appoggiando un dito sulla lama superiore. Separare il sandwich e tagliare lungo i bordi del segmento di tessuto. Tagliare un segmento di tessuto di circa 0,5 centimetri per un centimetro.Lasciare che il tessuto si riscaldi fino a quando il ghiaccio sulla sua superficie inizia a sciogliersi. A questo punto, premere rapidamente e con attenzione il tessuto nel blocco di OCT. Nel criostato, posizionare un dito sopra il campione.Il trasferimento di calore permetterà di rimuovere la lama senza alterare il tessuto. Rivestire il tessuto con OCT e lasciarlo equilibrare per cinque minuti. Successivamente, tagliare sezioni di 10 micron.Posizionare le sezioni su un vetrino e ispezionarle visivamente finché non si vedono i cripti. Collocare le sezioni in provette da 1,5 millilitri o su vetrini. Questa immagine mostra un tessuto colico colorato con ematossilina ed eosina in una sezione trasversale tradizionale con il muscolare circolare indicato come cm.La muscolaris mucosa, indicata con MM, evidenzia chiaramente le cellule della base delle cripte, le cellule transizionali e le cellule della superficie. Questa immagine mostra la muscolaris circolare dopo sezionamento seriale. Procedendo verso le cellule della superficie, si osserva la muscolaris mucosa.Questa immagine mostra a maggior ingrandimento le cellule della base della cripta colorate con ematossilina ed eosina. Si noti l'assenza di un lume centrale. In questo caso sono visibili cellule transizionali e l'immagine mostra le cellule della superficie.Le seguenti immagini mostrano la colorazione immunofluorescente di cripte coliche isolate, con rilievo della proteina delle giunzioni intercellulari. Soula occludina uno o ZO uno appare verde e i nuclei, che appaiono blu, sono osservati in sezione trasversale. Le cellule transizionali e superficiali sono mostrate qui dopo sezioni seriali.Diversi fattori di differenziamento sono espressi in modo spaziotemporale lungo l'asse della superficie criptica. Questo include il fattore di trascrizione cripple like factor four mostrato in verde, che è arricchito nelle popolazioni cellulari della superficie quando osservato in sezione trasversale; la sezione seriale consente la valutazione mediante PCR in tempo reale dei livelli di mRNA di KLF four tra i tre compartimenti. Infine, questo immunoblotting mostra i livelli della proteina KLA four in queste popolazioni cellulari.Non dimenticare che lavorare con lame microtomiche può essere estremamente pericoloso, quindi presta la massima attenzione ogni volta che esegui questa procedura.

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