Metodo criosezionamento per Microdissezione di Murine colon mucosa
12 luglio 2015
Qui descriviamo un metodo semplice per l'isolamento di cellule di superficie epiteliali murine del colon spazialmente distinte dalle cellule cripto-base sottostanti.
L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare microscopicamente due regioni distinte dello spazio del colon: la zona criptica proliferativa K e le cellule epiteliali superficiali differenziate. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo il colon del topo. Il secondo passaggio consiste nel congelare il tessuto tra due piastre di metallo.
Successivamente, il tessuto viene montato su un blocco di OCT precedentemente livellato. L'ultimo passaggio consiste nel sezionare il tessuto con un criostato a intervalli di 10 micron. Infine, la PCR in tempo reale o il Western blot vengono utilizzati per mostrare i cambiamenti nell'espressione genica e proteica.
Il vantaggio della nostra tecnica è che è rapida, economica e dimostra un'elevata resa. Il nostro procedimento è Christian Garner Schmidt, un tecnico del nostro gruppo. Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state esaminate e approvate dal Comitato per la Cura e l'Utilizzo degli Animali dell'Università di Emory e sono state eseguite secondo i criteri dei National Institutes of Health.
Dopo aver configurato il criostato, come di consueto, portare le lame e i portacampioni del criostato all'equilibrio a meno 20 gradi Celsius. Quindi riempire uno stampo criogenico vuoto con il composto ottimale per il taglio in temperatura (OCT) e portarlo all'equilibrio a meno 20 gradi Celsius. Questo richiederà circa 30 minuti.
Rimuovere l'OCT congelato dallo stampo e fissarlo al mandrino con OCT liquido. Posizionare il mandrino sul braccio del microtomo e lasciare solidificare l'OCT per 10 minuti. Impostare il criostato a 10 micron per sezione e affettare il blocco di OCT fino a quando non diventa piano, quindi spostare il braccio del microtomo lontano dalla lama di alcuni centimetri.
Successivamente, preparare due lamette per campione utilizzando una lima metallica, arrotondando il bordo tagliente delle lamette. Quindi rimuovere la flangia in alluminio con pinzette. Preparare una piastra per colture di 10 centimetri, riempita al 50% con silicone e dotata di 10-15 spilli da dissezione.
Aggiungere cinque millilitri di soluzione tampone di Hank a temperatura ambiente alla piastra dopo aver eutanasizzato il topo secondo metodi approvati ed escisso un segmento del colon distale compreso tra zero e sei centimetri dall'ano. Usare le forbici per tagliare. Aprire longitudinalmente il colon ed eliminare il contenuto fecale.
Fissare il tessuto alla piastra di dissezione in silicone contenente la soluzione tampone di Hank con la superficie mucosa rivolta verso l'alto. Stendere il tessuto utilizzando i perni da dissezione. Lasciarlo quindi riposare per 10 minuti a temperatura ambiente per eliminare le pieghe dal tessuto e permettere il rilassamento degli strati muscolari.
Dopo che il tessuto ha riposato, rimuovere tutti i perni tranne quelli alle estremità. Far scivolare una lama di rasoio sotto la sezione di tessuto desiderata, quindi versare via il buffer di Hanks. Aggiungere un'altra lama di rasoio sulla parte superiore, formando un sandwich.
Tagliare il segmento di tessuto e rimuovere i perni terminali. Trasferire il "sandwich" di tessuto e lametta su anidride carbonica solida. Lasciare congelare il tessuto per cinque-dieci minuti.
Prendere il sandwich di tessuto con il rasoio e lasciarlo scaldare leggermente appoggiando un dito sulla lama superiore. Separare il sandwich e tagliare lungo i bordi del segmento di tessuto. Tagliare un segmento di tessuto di circa 0,5 centimetri per un centimetro.
Lasciare che il tessuto si riscaldi fino a quando il ghiaccio sulla sua superficie inizia a sciogliersi. A questo punto, premere rapidamente e con attenzione il tessuto nel blocco di OCT. Nel criostato, posizionare un dito sopra il campione.
Il trasferimento di calore permetterà di rimuovere la lama senza alterare il tessuto. Rivestire il tessuto con OCT e lasciarlo equilibrare per cinque minuti. Successivamente, tagliare sezioni di 10 micron.
Posizionare le sezioni su un vetrino e ispezionarle visivamente finché non si vedono i cripti. Collocare le sezioni in provette da 1,5 millilitri o su vetrini. Questa immagine mostra un tessuto colico colorato con ematossilina ed eosina in una sezione trasversale tradizionale con il muscolare circolare indicato come cm.
La muscolaris mucosa, indicata con MM, evidenzia chiaramente le cellule della base delle cripte, le cellule transizionali e le cellule della superficie. Questa immagine mostra la muscolaris circolare dopo sezionamento seriale. Procedendo verso le cellule della superficie, si osserva la muscolaris mucosa.
Questa immagine mostra a maggior ingrandimento le cellule della base della cripta colorate con ematossilina ed eosina. Si noti l'assenza di un lume centrale. In questo caso sono visibili cellule transizionali e l'immagine mostra le cellule della superficie.
Le seguenti immagini mostrano la colorazione immunofluorescente di cripte coliche isolate, con rilievo della proteina delle giunzioni intercellulari. Soula occludina uno o ZO uno appare verde e i nuclei, che appaiono blu, sono osservati in sezione trasversale. Le cellule transizionali e superficiali sono mostrate qui dopo sezioni seriali.
Diversi fattori di differenziamento sono espressi in modo spaziotemporale lungo l'asse della superficie criptica. Questo include il fattore di trascrizione cripple like factor four mostrato in verde, che è arricchito nelle popolazioni cellulari della superficie quando osservato in sezione trasversale; la sezione seriale consente la valutazione mediante PCR in tempo reale dei livelli di mRNA di KLF four tra i tre compartimenti. Infine, questo immunoblotting mostra i livelli della proteina KLA four in queste popolazioni cellulari.
Non dimenticare che lavorare con lame microtomiche può essere estremamente pericoloso, quindi presta la massima attenzione ogni volta che esegui questa procedura.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per isolare cellule epiteliali superficiali del colon murino spazialmente distinte dalle cellule della base delle cripte sottostanti. La tecnica consente di suddividere il colon in due regioni: la zona criptica proliferativa K e le cellule epiteliali superficiali differenziate.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Istologia
Sfondo
- L'isolamento delle cellule epiteliali del colon è fondamentale per lo studio dell'espressione genica e proteica.
- La procedura prevede la microdissezione di regioni specifiche del colon.
- Per analizzare i campioni vengono impiegati la PCR in tempo reale e il blotting di Western.
- Le procedure sugli animali sono state approvate dal comitato istituzionale competente.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido ed economico per isolare le cellule epiteliali del colon.
- Dimostrare un'elevata resa nel processo di isolamento.
- Facilitare lo studio dei fattori di differenziamento nelle cellule del colon.
Metodi Utilizzati
- Dissezione del colon di topo e congelamento tra piastre di metallo.
- Montaggio del tessuto su un blocco di OCT e taglio in sezioni da 10 micron.
- Utilizzo di lame di rasoio per isolare i segmenti di tessuto desiderati.
- Colorazione immunofluorescente per visualizzare le proteine delle giunzioni cellulari.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule epiteliali della base e della superficie della cripta.
- Visualizzazione dei fattori di differenziazione lungo l'asse cripta-superficie.
- L'analisi mediante PCR in tempo reale e Western blot ha confermato i livelli di espressione genica e proteica.
- Le immagini hanno mostrato distinzioni chiare tra i diversi tipi cellulari.
Conclusioni
- Il metodo descritto è efficiente e produce campioni di alta qualità.
- Permette un'analisi dettagliata della differenziazione delle cellule epiteliali coliche.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per ottenere ulteriori informazioni sulla biologia del colon.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La microdissezione spazialmente risolta della mucosa colonica murina consente l'isolamento preciso di popolazioni cellulari delle cripte proliferative e dell'epitelio superficiale differenziato per l'analisi molecolare. Questa capacità supporta la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi nei modelli di malattie gastrointestinali, migliorando la fiducia predittiva nella scoperta precoce e nella ricerca traslazionale. L'efficienza e il rendimento del metodo facilitano una selezione robusta del portafoglio e decisioni di avanzamento corrette in base al rischio nella ricerca e sviluppo biofarmaceutica&D.
Applicazioni Strategiche nella Biotecnologia Farmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dell'espressione genica e proteica in compartimenti epiteliali distinti.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio isolando popolazioni cellulari proliferative rispetto a quelle differenziate.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico mediante profilazione molecolare con risoluzione spaziale.
- Migliora la previsione nell'identificazione dei bersagli nella ricerca gastrointestinale.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce campioni di tessuto validati per saggi quantitativi successivi, come PCR in tempo reale e Western blot.
- Migliora la riproducibilità dei saggi consentendo l'isolamento standardizzato di popolazioni cellulari definite.
- Supporta lo sviluppo di piattaforme di screening robuste per marcatori di differenziazione epiteliale.
- Permette una valutazione affidabile degli effetti dei composti su compartimenti mucosali specifici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati molecolari a compartimenti epiteliali rilevanti per la malattia in modelli preclinici.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo analisi di biomarcatori specifici per compartimento.
- Semplifica decisioni di avanzamento basate sul rischio, fondate su dati molecolari con risoluzione spaziale.
- Fornisce informazioni meccanicistiche sulla funzione della barriera epiteliale e sulla differenziazione, rilevanti per i disturbi gastrointestinali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di criosezionamento e microdissezione si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo analisi molecolari specifiche per compartimento, dalla verifica iniziale delle ipotesi fino alla validazione traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'isolamento di popolazioni cellulari della cripta e della superficie per l'analisi molecolare.
- Screening: Fornisce campioni riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi e flussi di lavoro di screening di composti.
- Analisi: Fornisce RNA e proteine di alta qualità per letture quantitative, consentendo confronti statistici robusti tra compartimenti.
- Ricerca traslazionale: Allinea i risultati molecolari con strutture epiteliali rilevanti per la malattia in modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'analisi tissutale con risoluzione spaziale in diversi programmi di ricerca gastrointestinale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi di biologia epiteliale.
- Valore operativo: Consente un isolamento del tessuto standardizzato, ad alto rendimento e riproducibile per i flussi di lavoro molecolari.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di tipo go/no-go e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale nella ricerca gastrointestinale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento regolati sul rischio dei programmi terapeutici gastrointestinali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di criosezionamento e microdissezione.
- Necessita dell'accesso a strumentazione criostatica e infrastrutture per l'analisi molecolare.
- Richiede una standardizzazione tra team per l'isolamento riproducibile dei compartimenti.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per altri tipi di tessuto o modelli di malattia.
- È essenziale un'attenta manipolazione delle lame del microtomo per garantire sicurezza e integrità del campione.
