Analisi di Yersinia enterocolitica Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la traslocazione della proteina effettrice nelle cellule ospiti attraverso il sistema di secrezione di vernia di tipo tre. Ciò si ottiene incubando le cellule heela con mutanti yersinia che esprimono fusioni di lattamasi effettrici TEM one per consentire la traslocazione delle fusioni effettrici nelle cellule HELOC. In una seconda fase, le cellule HELOC infette vengono caricate con un composto reporter di fret permeabile cellulare, che viene elaborato dall'estro cellulare alla carica in CCF 4 fluorescente e quindi intrappolato all'interno della cellula.

La successiva scissione di CCF 4 da parte della beta-lattamasi translocalizzata provoca l'interruzione di fre, che viene registrata mediante microscopia a scansione laser al fine di analizzare le intensità di fluorescenza del donatore e dell'accettore. I risultati mostrano diverse quantità di fusione dell'effettore translocalizzato TEM una beta lattamasi in base a diverse cinetiche di aumento della fluorescenza del donatore. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che l'elaborazione intercellulare del composto CCF four fornisce uno strumento altamente specifico e sensibile per misurare la traslocazione.

Il metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patogenesi batterica, come ad esempio il modo in cui la traslocazione viene regolata durante l'interazione di batteri e cellule ospiti un giorno prima dell'infezione. Inoculare tre fiale separate contenenti tre millilitri di terreno LB e gli antibiotici necessari con una colonia di ciascuno dei ceppi trasformati di Y enterocolitica preparati come descritto nel protocollo di testo allegato. Preparare anche piastre contenenti cellule heela il giorno prima dell'infezione seminando 15.000 cellule in 200 microlitri di terreno di coltura in nove pozzetti di una piastra da 96 pozzetti, incubare le cellule in un incubatore al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius il giorno dell'infezione.

Inoculare due millilitri di coltura notturna in 40 millilitri di terreno fresco per libbra senza antibiotici. Incubare i batteri per 90 minuti a 37 gradi Celsius in uno shaker a 180 giri/min. Ciò indurrà l'espressione del sistema di secrezione di tipo tre dopo 90 minuti, trasferirà le colture in una provetta fresca e manterrà le colture sul ghiaccio.

Da questo punto in poi. Centrifugare le colture per 10 minuti a 5.000 g e quattro gradi Celsius per pellettare i batteri. Successivamente, risospendere il pellet in due o tre millilitri di PBS ghiacciato, diluire la sospensione batterica a una concentrazione di 800 milioni di unità formanti colonie per millilitro, quindi posizionare le colture su ghiaccio.

Quindi determinare la densità ottica corrispondente di ciascuna coltura. Aggiungere 3,5 microlitri di sospensione batterica da ciascun ceppo a diversi pozzetti del 96 preparato. Preparare bene e mescolare pipettando delicatamente il terreno due volte, lasciare che i batteri sedimentino sulle cellule a una metà di infezione di circa 100 batteri per cellula.

Esegui un corso temporale iniziando le infezioni a intervalli di 30 minuti e mantenendo le cellule in una camera al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius. Dopo ogni infezione, 90 minuti dopo la prima infezione, aspirare accuratamente il terreno senza rimuovere nessuna delle cellule hela. Quindi aggiungere 50 microlitri di PBS contenenti 20 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e 2,5 millimolari di pronic.

Ciò fermerà l'espressione degli effettori e ridurrà l'esportazione di CCF four. Per preparare la microscopia, garantire l'immersione continua distribuendo il terreno di immersione sul fondo dei pozzetti, utilizzando una siringa da un millilitro. Evitare di intrappolare bolle d'aria nel mezzo di immersione.

Quindi trasferire la piastra a 96 pozzetti sul tavolino del microscopio e individuare i punti adatti per un'analisi successiva in ciascuno di essi. Bene, completa questo passaggio entro 10 minuti. Quindi aggiungere 70 microlitri di soluzione di carico CF 4:00 AM in ciascuno.

Incubare bene la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, aspirare la soluzione di carico e aggiungere 100 microlitri di PBS contenenti 20 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e 2,5 millimolari pronic. Quindi avviare rapidamente la microscopia.

Posizionare un obiettivo a immersione ad alta apertura numerica con ingrandimento 20 volte e aprire il foro stenopeico del rivelatore a 2,5 unità ariose e trasferire la piastra a 96 pozzetti nel tavolino di scansione laser confocale. Quindi, scegliere rivelatori di arseniuro fosfato di gallio ad alta sensibilità con canali donatore e accettore attivi contemporaneamente. Media di otto frame a triplo profondità di bit ed eccitazione con il 10% di un laser a diodi a 405 nanometri.

Per garantire una corretta quantificazione, impostare il guadagno del rivelatore di entrambi i canali sullo stesso valore ed evitare la saturazione dei pixel. Successivamente, attivare la luce trasmessa e ricontrollare i campi visivi rappresentativi in ogni, regolare bene e salvare nuovamente le posizioni secondo necessità utilizzando un tavolino automatico calibrato. Infine, imposta il time lapse su due minuti, la durata su due ore e inizia ad acquisire le immagini.

Dopo l'acquisizione dell'immagine, importare il set di dati in un software che consente calcoli aritmetici di matrici di pixel. Sottrai lo sfondo in entrambi i canali utilizzando lo stesso offset facendo prima clic sul menu, quindi vai all'elaborazione dell'immagine e seleziona la sottrazione della linea di base. Quindi selezionare ciascun canale e inserire il valore di base.

Correggere il sanguinamento del canale donatore, canale uno nel canale accettore due con il fattore di correzione predeterminato, creando un nuovo canale due primo a tal fine. Fare clic sul menu e quindi selezionare l'elaborazione dell'immagine seguita da Aritmetica del canale e inserire il valore assoluto del canale due sottratto dal punto 33 volte. Canale uno in seguito, eliminare il canale due e assicurarsi che lo spurgo attraverso il canale dell'accettore corretto rimanga come nuovo canale due.

Quindi crea un nuovo canale con l'operazione mostrata qui per determinare il coefficiente dei tasti relativo. Quindi, torna al menu aritmetico del canale e inserisci il canale due diviso per il canale uno più il canale due per una corretta visualizzazione del canale dei tasti. In un'immagine a otto bit, creare un quarto canale canale quattro, che equivale a 255 volte il canale tre.

Cambia il colore del canale andando al menu delle proprietà dell'immagine, seleziona il canale quattro, quindi il colore mappato, seguito dal file della tabella dei colori e seleziona jet. Quindi, applica un filtro mediano tre per tre ai canali tre e quattro. Ciò ridurrà il rumore nelle immagini accedendo al menu di elaborazione delle immagini e selezionando l'arrotondamento.

Seguito dal filtro mediano, selezionare entrambi i canali e applicare una dimensione del filtro tre per tre per uno per la quantificazione dei segnali cellulari. Rileva le celle nel canale quattro selezionando la vista di superamento e facendo clic sull'icona. Aggiungete nuove superfici.

Definite i parametri dell'algoritmo di rilevamento nella finestra della superficie e attivate le due caselle di controllo. Segmenta solo una regione di interesse ed elabora l'intera immagine. Infine, quindi, definisci la regione di interesse modificandone le dimensioni.

Seleziona il canale quattro come canale sorgente e imposta la soglia andando al menu di soglia e selezionando la sottrazione in background. Impostare il diametro su 10 micrometri, la soglia minima di intensità manualmente su zero e la soglia massima sull'intensità massima. Filtra le strutture per area e imposta il valore minimo a 187 micrometri quadrati.

Quindi termina il rilevamento della superficie. Infine, estrarre i valori medi per l'intensità della fluorescenza del donatore nel canale uno e il coefficiente di fret relativo nel canale tre, insieme alle loro deviazioni standard nell'entità cellulare. Per dimostrare la capacità di questo metodo di analizzare quantitativamente la traslocazione dell'effettore nelle cellule bersaglio, sono stati studiati due ceppi di yersinia con diverse cinetiche di traslocazione utilizzando sia la fluorescenza del donatore che i coefficienti di fret relativi.

Le cellule infette wild-type mostrano un aumento dell'intensità della fluorescenza nel tempo. Come previsto, la pendenza massima dell'intensità della fluorescenza è correlata positivamente con la durata dell'infezione, indicando che diverse concentrazioni di beta lattamasi tradotta possono essere distinte in base a studi precedenti. Le cellule infettate con il mutante di delezione YOPE della yersinia mostrano un aumento più rapido dell'intensità della fluorescenza rispetto al ceppo wild type.

È interessante notare che l'espansione dell'infezione a 90 minuti non ha ulteriormente accelerato l'aumento della fluorescenza del donatore rispetto ai 60 minuti dell'infezione Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente che l'elaborazione del composto CCR quattro inizia immediatamente dopo la sua aggiunta. Pertanto, è importante iniziare l'acquisizione delle immagini in tempo.