Una tecnica senza etichetta per l'Imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la secrezione proteica da singole cellule con un'elevata risoluzione temporale e spaziale. Ciò si ottiene fabbricando litograficamente nanosensori plasmonici d'oro su vetrini di copertura per l'imaging senza etichetta di secrezioni di singole cellule. Come seconda fase, il chip del sensore viene pulito e rivestito con il monostrato autoassemblato e quindi funzionalizzato con ligandi che hanno un'elevata affinità per le proteine dell'analita secrete.

Successivamente, le cellule vengono integrate nei chip sensori funzionalizzati per misurare le loro secrezioni nello spazio e nel tempo. I risultati mostrano che le secrezioni proteiche delle singole cellule possono essere mappate sia spazialmente che temporalmente senza la necessità di marcatura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della comunicazione intercellulare, come ad esempio il modo in cui le vie di segnalazione paracrina e autocrina governano la motilità cellulare.

Per iniziare questa procedura, depositare un film sottile di cromo a 10 nanometri su vetrini coprioggetti precedentemente puliti mediante evaporazione a fascio di elettroni per evitare effetti di carica durante il patterning e l'imaging delle nanostrutture. Dopo questa rotazione, il primo strato di resist a doppio strato costituito da lattato di etile, copolimero di metilmetacrilato a 2000 giri/min per 45 secondi. Quindi cuocere il substrato a 150 gradi Celsius dopo aver lasciato raffreddare il substrato a temperatura ambiente.

Centrifugare il secondo strato di polimetilmetacrilato a 3000 giri/min per 45 secondi e cuocere il substrato a 150 gradi Celsius. Il doppio strato resiste utilizzando la litografia a fascio di elettroni o EBL. Sviluppare un alcol isopropilico o IPA metil isobutilchetone, o MIBK in un rapporto di due a uno e risciacquare con IPA.

Rimuovere il cromo dall'area sviluppata delle nanostrutture tramite incisione a umido utilizzando l'incisione CR seven per 10 secondi a temperatura ambiente e quindi risciacquare in acqua distillata deionizzata e distillare Depositare un film d'oro di titanio sul substrato utilizzando l'evaporatore a fascio di elettroni dopo la deposizione dell'oro. Sollevare il doppio strato di copolimero. Resistere immergendo il substrato in acetone per quattro ore.

Successivamente, ispezionare il substrato utilizzando un microscopio elettronico a scansione per confermare la forma e le dimensioni della nanostruttura. Le nanostrutture risultanti sono tipicamente separate da un passo di 300 nanometri. 20 per 20 array di nanostrutture sono distanziati di 30 micron da centro a centro.

Lasciando ampio spazio per l'imaging cellulare, un chip tipico conterrà 300 array. Rimuovere il cromo rimanente dal substrato tramite il bordo bagnato utilizzando l'incisione CR seven per 60 secondi a temperatura ambiente. Quindi sciacquare il substrato in acqua distillata deionizzata.

Quindi ispezionare un sottoinsieme di array utilizzando il microscopio a forza atomica per la verifica delle dimensioni e dell'uniformità. Questo vetrino coprioggetto in vetro modellato può essere utilizzato più volte, purché vengano seguite le corrette procedure di pulizia per la pulizia e la rigenerazione del plasma superficiale localizzato e dei chip di risonanza o LSPR. Ceneri al plasma ad una potenza di 40 watt in una miscela da 300 milli a 5% di idrogeno e 95% di argon per 45 secondi.

Funzionalizzare la superficie dell'oro e le nano strutture subito dopo l'incenerimento al plasma. Immergendo il chip in una soluzione di etanolo tiolo bicomponente costituita da un rapporto di tre a uno di SPO e SPC. Dopo aver lasciato il chip nella soluzione di tiolo per una notte per formare un monostrato autoassemblato, sciacquarlo con etanolo e asciugarlo con azoto gassoso, caricare il chip LSPR all'interno di un supporto microfluidico su misura posizionando il chip su un fondo di alluminio.

Quindi inserire il chip tra questo pezzo inferiore e una guarnizione in silicone e un pezzo superiore in plastica trasparente usando quattro viti per bloccare il gruppo. Per una tipica applicazione di tioli a base di SPC, applicare 300 microlitri di una miscela uno a uno di EDC da 133 millimolari e NHS da 33 millimolari in acqua distillata deionizzata per attivare i gruppi carbossilici del componente tiolico SPC. Dopo aver atteso 10 minuti, sciacquare manualmente la superficie con PBS da 10 millimolari, dopodiché coniugare il gruppo carbossilico attivato con il legante di interesse rivestendo a goccia 300 microlitri della soluzione di ligando.

Dopo aver atteso un'ora e risciacquato la superficie con codice goccia PBS da 10 millimolari, 300 microlitri di etanolammina molare 0,1 molare in PBS sul chip per ridurre al minimo il legame aspecifico. Dopo aver atteso 10 minuti, lavare l'etanolammina con PBS contenente lo 0,005% tra 20 e PBST 20. Quindi, posiziona un pezzo di quarzo sopra il chip per ridurre le fluttuazioni nei dati relativi a un menisco variabile.

Mantenere il chip bagnato con il tampone PBST 20 durante il montaggio sul microscopio. Collegare il tubo microfluidico al gruppo e al tampone di flusso fino a raggiungere uno stato stazionario. Quindi posizionare saldamente il gruppo chip LSPR nel supporto del campione del tavolino riscaldato.

La configurazione ottica per questo metodo è mostrata qui. La luce della lampada alogena viene fatta passare attraverso un filtro passa-lungo da 593 nanometri per eliminare le lunghezze d'onda, che non contribuiscono alla risposta nanoplasmonica. La luce viene quindi polarizzata linearmente e il campione viene illuminato tramite un obiettivo ad apertura numerica 40 x 1,4 per l'eccitazione delle nanostrutture plasmoniche dell'oro.

La luce diffusa viene raccolta dall'obiettivo e fatta passare attraverso un polarizzatore incrociato per ridurre il segnale di fondo dal substrato di vetro. Un divisore di fascio 50 50 viene inserito nel percorso della luce raccolta per l'analisi spettroscopica e delle immagini simultanee. Dopo aver lasciato equilibrare l'assemblaggio e il microscopio per almeno due ore, allineare il chip utilizzando il joystick in modo che l'array centrale sia allineato con la fibra ottica per la spettroscopia.

Dopo aver coltivato e pellettato le cellule ibride DOMA mediante centrifugazione, raccoglierle, quindi testarne la vitalità prima di introdurle nei chip LSPR. Successivamente, introdurre manualmente 50 microlitri della soluzione cellulare sui chip LSPR con una micropipetta. Infine, lavare via le cellule rimanenti in soluzione con terreni freschi privi di siero utilizzando un sistema di profusione microfluidica per preparare i chip LSPR per l'imaging.

Qui viene mostrata una sovrapposizione di un'immagine di imaging LSPR, che evidenzia le schiere quadrate e un'immagine illuminata a luce trasmessa, che evidenzia la cella in basso a sinistra. Una cellula colorata con l'asta di tintura a membrana fluorescente Domine, DHPE mostra estensioni simili a filopodi. Se tali estensioni dovessero sovrapporsi agli array, darebbero un falso positivo per i dati di spettrometria di secrezione proteica prima e dopo l'introduzione di una soluzione saturante di anticorpi antis cmic agli array funzionalizzati cmic sono visualizzati qui.

Questo metodo viene utilizzato per calibrare gli array. La calibrazione degli array aiuta a normalizzare la risposta dei sensori e a determinare l'occupazione frazionaria in base al profilo di biofunzionalizzazione di ogni corsa. Uno strumento SPR commerciale viene utilizzato per determinare la costante di dissociazione e per studiare la resistenza al legame non specifico utilizzando lo stesso protocollo descritto per il chip LSPR.

Di seguito sono riportati i valori normalizzati di due matrici. Un array era a meno di 10 micrometri dalla cellula, mentre il controllo era a 130 micrometri dalla cella. L'improvviso aumento della risposta normalizzata dell'array più vicino alla cellula rispetto alla risposta piatta dell'array di controllo è indicativo di un burst localizzato di anticorpi secrenti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le secrezioni proteiche dalle singole cellule con un'elevata risoluzione spaziale e temporale.