Name: Una tecnica senza etichetta per lImaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Scopri una tecnica senza etichette per l'imaging spazio-temporale delle secrezioni proteiche da singole cellule utilizzando nanosensori plasmonici d'oro. Questo metodo consente di studiare la comunicazione intercellulare con alta risoluzione.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

1. nanostrutture <ol><li> Scegli 25 mm vetrini di diametro con spessore di 170 micron approssimativa (No. 1.5) come substrati per nanofabbricazione. </li><li> Immergere i coprioggetti in soluzione Piranha (rapporto 3: 1 di acido solforico e perossido di idrogeno) per almeno 6 ore. Lavare il piranha vetrino bagnato con abbondante ultrapura 18,2 MW deionizzata acqua distillata (DDW). ATTENZIONE: L&#39;acido Piranha reagisce violentemente con materiali organici e deve essere maneggiato con estrema cura. </li><li> Acconto 10 nm cromo film sottile sui vetrini via e-beam evaporazione per evitare effetti di carica durante il patterning e l&#39;imaging di nanostrutture. </li><li> Spin il primo strato di resist doppio strato costituito da metil metacrilato di etile lattato (MMA_EL6) copolimero a 2.000 rpm per 45 sec e poi cuocere in forno a 150 ° C. Spin il secondo strato di poli-metil metacrilato (950PMMA_A2) a 3.000 rpm per 45 sec poi cuocere in forno a 180 ° C. </li><li> Picchiettion bistrato resist mediante litografia a fascio elettronico (EBL) a 25 kV con una dose di 300 uC / cm 2 zona. Sviluppare in alcool isopropilico (IPA) / metilisobutilchetone (MIBK): 2/1 e sciacquare in IPA. </li><li> Deposito Ti (5 nm) / Au (80 nm) pellicola sul substrato mediante un evaporatore e-beam. </li><li> Dopo la deposizione dell&#39;oro, sollevare il doppio strato copolimero resistere immergendo il substrato in acetone per 4 ore. </li><li> Controllare il supporto con il microscopio elettronico a scansione (SEM) per confermare forma e dimensione nanostruttura, rimuovere il cromo residuo dal substrato mediante attacco umido utilizzando CR-7 mordenzante per 60 sec a temperatura ambiente e poi sciacquare a DDW. </li><li> Progettare un array di spaziatura da centro a centro di 33 micron per lasciare spazio per l&#39;imaging cellulare tra gli array. Motivo nanostrutture a 20 x 20 modello per ogni array con un passo di 300 nm utilizzando uno scrittore e-beam. Ogni chip contiene 300 array a dimensione nanostruttura tipico di altezza 80 ± 2.5 nm e 70 ± 2,5 nm Diameter. </li><li> Controllare un sottoinsieme di array utilizzando il microscopio a forza atomica (AFM) per la verifica delle dimensioni e uniformità. </li><li> Fissare un anello di supporto, tipicamente silicio, sul retro del vetrino utilizzando una resina epossidica polimerizzazione UV. </li></ol> 2. Chip Pulizia e applicazione di auto-assemblati monostrato <ol><li> Per la pulizia e rigenerazione dei chip, plasma incenerire a una potenza di 40 W in una miscela di 300 mTorr 5% di idrogeno, 95% argon 45 sec dopo la pulizia della camera per 5 minuti nelle stesse condizioni. </li><li> Funzionalizzare nanostrutture oro immediatamente dopo incenerimento plasma immergendo il chip in una soluzione etanolica tiolo bicomponente costituito da un rapporto 3: 1 di SH-(CH 2) 8 -EG 3 -OH (SPO) e un componente o con un&#39;ammina o carbossilico gruppo funzionale, cioè, SH-(CH 2) 11 -EG 3 -NH 2 (SPN) o SH-(CH 2) 11 -EG 3 -COOH (SPC). </li><li> Lasciare l&#39;i chip din la soluzione tiolo O / N per formare un monostrato auto-assemblato (SAM). </li><li> Risciacquare il chip con etanolo e asciugare con azoto gassoso. </li><li> Se necessario, memorizzare il chip funzionalizzato per 2 settimane a 4 ° C. </li><li> Quando pronto all&#39;uso reagire il SPN o componente SPC con il ligando utilizzando una chimica a seconda del ligando di scelta (vedi sotto). Nota: I chip possono essere rigenerati e decine di ri-funzionalizzate di volte. Un determinato chip può essere utilizzato per periodi che vanno da 6 mesi a più di un anno. Gli spettri misurati su un dato array vengono riprodotti in modo affidabile dopo ripetuti rigenerazioni di incenerimento plasma, seguito da biofunzionalizzazione. 29 </li></ol> 3. funzionalizzazione superficiale e Kinetic Caratterizzazione Nota: utilizzare il chip funzionalizzati nello strumento SPR commerciale per caratterizzare le costanti di velocità cinetiche tra il ligando e l&#39;analita, così come per studiare la resistenza di SAM non specifico binding. Esiste una vasta gamma di portate e disegni microfluidici che consentono un&#39;efficiente funzionalizzazione superficiale. Dal momento che abbiamo un SPR disponibile in commercio abbiamo standardizzato intorno alle sue portate consigliate. Prendiamo atto che questi flussi sono tipici di tutti gli strumenti SPR e così non è restrittiva. Lo strumento SPR non è una necessità poiché tutto funzionalizzazione può avvenire direttamente sul chip LSPR, ma ha ridotto il nostro carico di lavoro perché è uno strumento multiplato mentre il nostro LSPR configurazione non è microfluidica. <ol><li> Funzionalizzare un chip commerciale d&#39;oro nudo con il SAM come descritto nella Sezione 2. </li><li> Se si utilizza un SAM basato SPC, attivare il gruppo carbossilico con una miscela 1: 1 di 133 mM di 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) e 33 mM di N -hydroxysuccinimide (NHS) in DDW per 10 min. </li><li> Coniugare il gruppo carbossilico attivato con l&#39;anticorpo / ligando di interesse per 300 sec utilizzando una portata di 30 microlitri / min. Preparare i ligandi inpH 6 tampone fosfato, tipicamente, ma questo può variare a seconda della molecola. </li><li> Dopo la coniugazione ligando, flusso 0,1 M etanolamina in tampone fosfato salino (PBS) come un passo disattivatore per 300 sec ad una velocità di 30 ml / min. Ethanolamine aiuta a minimizzare il binding non specifico. </li><li> Introdurre l&#39;analita di interesse con una portata di 100 l / min usando una gamma di concentrazioni e calcolare le costanti di velocità cinetiche utilizzando un software di analisi cinetica. </li><li> Se legame non specifico è problematica, aumentare il rapporto di SPO a SPC o SPN. </li></ol> Impostazioni 4. LSPR generali <ol><li> Impostazioni Microscopio: <ol><li> Utilizzare una lampada alogena 100 W per Koehler illuminare il campione. Utilizzare un filtro passa lungo (tipicamente 593 nm cutoff) nel percorso ottico per eliminare le lunghezze d&#39;onda che non contribuiscono allo spostamento di risonanza (Figura 2). </li><li> Per la raccolta dei dati LSPRi, utilizzare un microscopio rovesciato con un immersio olio 40Xobiettivo n (1.4 NA) e una camera CCD raffreddati termoelettricamente 16 bit. </li><li> Collocare un divisore di fascio alla porta di uscita del microscopio per ottenere immagini e spettri simultaneamente. </li><li> Impostare la fase di microscopio a temperatura controllata a 37 ° C ed equilibrare per 4 ore. </li><li> Incorporare un assieme incubazione addizionale sul microscopio per regolare la concentrazione di CO 2 e l&#39;umidità a 5% e 95%, rispettivamente. </li></ol></li><li> Preparazione Chip e montaggio: <ol><li> Funzionalizzare il chip LSPR come descritto nella Sezione 2 con le due componenti ottimali rapporti SAM determinate dagli esperimenti SPR. </li><li> Caricare il chip all&#39;interno di un titolare di microfluidica su misura come segue. Posizionare il chip su un pezzo inferiore in alluminio. Sandwich il chip tra questo pezzo inferiore e una guarnizione in silicone e una chiara pezzo superiore di plastica. Utilizzare 4 viti per bloccare il gruppo. </li><li> Per una tipica applicazione tiolo basata SPC, goccia cappotto 300 microlitri di una miscela 1: 1tura di 133 mm di EDC e 33 mm di NHS in DDW per attivare i gruppi carbossilici del componente SPC tiolo. </li><li> Attendere 10 minuti e risciacquare manualmente la superficie con PBS 10 mM. </li><li> Coniugare il gruppo carbossilico attivato con il ligando (tipicamente un frammento di anticorpo o anticorpi) di interesse rivestendo 300 ml di soluzione di ligando goccia. </li><li> Attendere per 30 minuti e risciacquare manualmente con PBS 10 mm. </li><li> Goccia cappotto 300 ml di 0,1 M in PBS etanolamina sul chip per minimizzare legami non specifici. Attendere 10 min. </li><li> Lavare il etanolamina con PBS contenente 0,005% di Tween 20 (PBS-T20). </li><li> Posizionare un pezzo di quarzo sopra il chip per ridurre le fluttuazioni nei dati relativi ad un menisco cambiamento. </li><li> Mantenere il chip bagnato con tampone PBS-T20 durante il montaggio sul microscopio. </li><li> Posizionare il gruppo di chip LSPR saldamente il porta campioni palco riscaldato e collegare il tubo microfluidica. </li><li> Collegare il tubo microfluidica alle bu di assemblaggio e di flussoffer (o media liberi siero per studi sulle cellule) fino uno stato stazionario viene raggiunto. </li><li> Permettere il montaggio e microscopio per stabilizzare almeno 2 ore. </li><li> Allineare il chip utilizzando joystick modo che l&#39;apparato centrale è allineata con la fibra ottica per la spettroscopia. Dati spettroscopici viene presa utilizzando uno spettrometro e software di analisi spettrale. </li><li> Mantenere gli array a fuoco tutto l&#39;esperimento utilizzando il software autofocus, Zeiss Fuoco definitiva o un dispositivo equivalente autofocus. </li></ol></li></ol> 5. LSPR Imaging di secrezioni anti-c-Myc da 9E10 cellule di ibridoma Nota: La linea cellulare di ibridoma utilizzato per questo studio esprimono anticorpo anti-c-myc costitutivamente e quindi non richiedono un trigger chimica <ol><li> Funzionalizzare le nanostrutture con c-myc peptide. Questo ha un valore K D di 1,77 nM per gli anticorpi anti-c-Myc secrete dalle cellule di ibridoma clone 9E10. </li><li> Cultura le cellule di ibridoma in complete terreno di coltura con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotici in un pallone T75 a 37 ° C sotto 5% CO 2. Mantenere una densità cellulare di 4 × 10 5 cellule / ml. </li><li> Per gli studi di secrezione delle cellule, le cellule pellet dal pallone T75 per centrifugazione, lavare due volte con RPMI-1640 siero media liberi (SFM) per rimuovere gli anticorpi secreti e regolare la densità cellulare di 4 × 10 6 cellule / ml. </li><li> Raccogliere le cellule e di prova di redditività prima di introdurli sulle ai chip LSPR. </li><li> Introdurre 50 ml di soluzione di cellule manualmente sui chip LSPR con una micropipetta. Dopo pochi minuti da 25 a 50 cellule aderiscono alla superficie dei chip LSPR. </li><li> Lavare via le cellule rimanenti in soluzione fresca SFM utilizzando il sistema di perfusione microfluidica. </li><li> Selezionare gli array LSPR per l&#39;imaging che sono vicino, a meno di 10 micron, ma non si sovrappongono con le cellule. </li><li> Per assicurare che il segnale è specifico per il secreto anti-c-myc ANTIBodies introducono i mezzi di coltura cellulare con e senza gli anticorpi presenti così come con gli anticorpi, ma con i loro siti di legame bloccati dalla presenza di una concentrazione saturante di c-myc peptide nella soluzione. </li><li> Calibrare i sensori al termine di ogni corsa con una soluzione satura di anticorpi anti-c-myc (250 nM). Questo aiuta a normalizzare la risposta dei sensori e determinare occupazione frazionato in base al profilo biofunzionalizzazione di ogni corsa. </li><li> Correggere la deriva nella direzione X e Y utilizzando software allineamento dell&#39;immagine. </li></ol>

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<li>Bramswig, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Carcinoembryonic+Antigen+Activates+Endothelial+Cells+and+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis.</a> Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).</li>
</ol>

Ringraziamo George Anderson per gli utili commenti e discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto per le Nanoscienze del Naval Research Laboratory e dal National Research Council Research Associateship Award.

La tecnica di imaging LSPR descritta in questo lavoro presenta numerosi vantaggi rispetto alle metodologie più tradizionali per rilevare le secrezioni cellulari. In primo luogo, la risoluzione temporale della nostra tecnica è dell'ordine dei secondi, mentre l'alternativa commerciale, un test di immunosabbia noto come EliSpot, ha una risoluzione temporale tipica di 2 o 3 giorni. 7,32 Di conseguenza, siamo stati in grado di risolvere cambiamenti improvvisi nel tasso di secrezione proteica, come quello mostrato nella Figura 6. In secondo luogo, la distribuzione di array sul chip consente di tracciare il segnale secreto nello spazio e nel tempo, il che consente confronti più rigorosi con i modelli di secrezione cellulare basati sulla diffusione. Inoltre, array come l'array di controllo mostrato nella Figura 6 possono essere utilizzati per sottrarre i cambiamenti globali nell'immagine che tipicamente derivano da fattori strumentali come la deriva della messa a fuoco. In terzo luogo, la nostra tecnica non richiede alcuna modifica delle cellule. Se lo si desidera, l'esperimento può incorporare tag di uso comune come le proteine fluorescenti, ma se si teme che tali tag possano influenzare negativamente la vitalità cellulare o l'omeostasi, la natura senza etichetta del nostro approccio non li richiede. In quarto luogo, utilizzando i dati spettroscopici abbiamo dimostrato che è possibile calcolare informazioni quantitative riguardanti l'occupazione frazionaria dei ligandi legati alla superficie.
Esistono numerosi metodi alternativi all'EBL per la fabbricazione di nanoparticelle metalliche. Tuttavia, abbiamo scoperto che l'EBL offre una notevole flessibilità per ottimizzare la nanostruttura e le dimensioni dell'array per adattarsi al meglio all'ottica e alle celle in esame. Fondamentale è anche il fatto che i chip possono essere facilmente rigenerati mediante l'incenerimento al plasma. In questo modo, un tipico chip può essere utilizzato decine di volte. I dettagli della biofunzionalizzazione devono essere modificati per l'applicazione specifica. Il protocollo qui presentato ha coniugato la superficie con ligandi peptidici c-myc relativamente piccoli. I ligandi più grandi, come gli anticorpi interi, richiedono in genere una maggiore spaziatura e quindi un rapporto SPO/SPN/SPC più elevato. Indipendentemente da ciò, uno strato SAM ben formato è essenziale per prevenire il legame non specifico negli esperimenti su cellule vive. In generale, gli analiti di peso molecolare più grande sono più facilmente rilevabili mediante LSPR. Pertanto, nella sua manifestazione a singola cellula, questa tecnica potrebbe non essere appropriata per rilevare la secrezione di piccole proteine, come le citochine. 
L'attuale configurazione è stata utilizzata per lo studio di singole cellule non aderenti. Esiste un numero significativo di proteine e vescicole di segnalazione secrete a cui i risultati riportati in questo lavoro sono direttamente applicabili. Ad esempio l'antigene carcinoembrionale (CEA) che da decenni è un marcatore diagnostico per il cancro. È noto che le cellule tumorali del colon secernono CEA alla velocità di migliaia di molecole/cellula/ora e il peso molecolare è di 180 kDa, che supera quello degli anticorpi IgG. Si ritiene che il CEA sia coinvolto nelle vie di segnalazione autocrine e paracrine, ma la natura spazio-temporale di queste secrezioni non è mai stata misurata. La nostra tecnica può affrontare direttamente queste domande di segnalazione. Un'estensione di questo lavoro consisterà nel misurare la natura spazio-temporale della secrezione di CEA da singole cellule. 33 Il lavoro futuro si concentrerà anche sull'integrazione di LSPRi con colture cellulari bidimensionali e tridimensionali di cellule aderenti. Incorporando array multiplex in grado di rilevare un numero di proteine secrete in parallelo, questa tecnica ha il potenziale per aprire una nuova finestra sulle secrezioni cellulari e su come influenzano le cellule vicine.

La comunicazione tra cellulare è fondamentale per la regolazione di molte attività fisiologiche sia all&#39;interno che all&#39;esterno della cellula. Una varietà di proteine ​​e vescicole può essere secreto che successivamente innescare processi cellulari complessi come la differenziazione, la guarigione delle ferite, la risposta immunitaria, la migrazione e la proliferazione. 1-5 Anomalie di vie di segnalazione inter-cellulari sono stati implicati in numerosi disturbi tra cui il cancro, l&#39;aterosclerosi , e diabete, solo per citarne alcuni. La cella ottimale dosaggio secrezione dovrebbe essere capace di spazialmente e temporalmente mappatura della proteina secreta di interesse senza interrompere le vie di segnalazione rilevanti. In questo modo relazioni causali tra i profili di concentrazione e la risposta delle cellule riceventi possono essere dedotti. Purtroppo, molte delle tecniche di fluorescenza a base più comunemente utilizzati non soddisfano questi criteri. Proteine ​​di fusione fluorescenti possono essere usati per codificare l&#39;analita well&#39;ambito cella ma può disturbare la via di secrezione, o se secreto, determina un bagliore diffuso fuori della cellula che è difficile da quantificare. Saggi basati immunosandwich-fluorescenti sono le tecniche più comunemente utilizzati per la rilevazione secrezioni cellulari ma tipicamente richiedono l&#39;isolamento di singole cellule. 6-11 Inoltre, l&#39;introduzione di anticorpi di rilevamento arresta o termina l&#39;esperimento e le dimensioni delle etichette anticorpo tipicamente, 150 kDa per le IgG, è un impedimento alla segnalazione a valle. A causa di questi blocchi stradali è preferibile che una tecnica libera-label essere utilizzata per le secrezioni di proteine ​​immagine e tra tecnologie senza etichette esistenti, risonanza plasmonica di superficie (SPR) e localizzato risonanza plasmonica di superficie (LSPR) sensori sono ottimi candidati. 12-17 Questi I sensori sono stati ampiamente utilizzati per analita studi di legame di proteine, esosomi e altri biomarcatori. 18-24 Nel caso della LSPR, il nanostr plasmonicheuctures può essere modellata litograficamente su vetrini ed eccitato utilizzando la luce visibile attraverso configurazioni standard a grande campo di microscopia. Grazie alla loro impronta nanoscala, la maggior parte del substrato di vetro è disponibile per tecniche di imaging comuni come campo chiaro e microscopia a fluorescenza rendendo così queste sonde adatte per l&#39;integrazione con la microscopia live-cell. 25-28 Abbiamo dimostrato la misura in tempo reale di secrezioni anticorpi da cellule di ibridoma utilizzando nanostrutture plasmoniche oro funzionalizzato con risoluzioni spaziali e temporali di 225 msec e 10 micron, rispettivamente. La configurazione di base del circuito integrato è illustrato in Figura 1. 28 Il percorso ottico di uscita del microscopio è diviso tra una telecamera CCD utilizzato per immagini e uno spettrometro a fibre otticamente accoppiato per la determinazione quantitativa di occupazione frazionata di un dato array di nanostrutture (figura 2 ). Il ProtoColo presentato in questo documento descrive il disegno sperimentale per la misura in tempo reale delle secrezioni singola cellula, mentre possono monitorare la risposta delle cellule usando microscopia in campo chiaro standard. L&#39;approccio multidisciplinare comprende la fabbricazione di nanostrutture, funzionalizzazione delle nanostrutture per il legame di analiti alta affinità, ottimizzazione superficie sia per minimizzare legami non specifici e caratterizzare costanti di velocità cinetiche utilizzando una superficie commerciale Plasmon Resonance (SPR) strumento, l&#39;integrazione di linee cellulari sul substrato, e l&#39;analisi di immagini e dati spettrali. Prevediamo questa tecnica come una tecnologia abilitante per la mappatura spazio-temporale delle secrezioni cellulari e le loro relazioni causali con celle riceventi.

<table><tbody><tr><td>25&#160; vetrini coprioggetti in vetro di diametro mm Strumenti per</td> le <td>bioscienze&nbsp;</td><td>CSHP-No1.5-25</td><td>&nbsp; 170&plusmn; 5 &micro; m è ottimale</td></tr><tr><td>Polimetilmetacrilato</td><td>Microchem</td><td>PMMA 950 A4</td><td></td></tr><tr><td>Lattato di etile metacrilato di metile</td><td>Microchem</td><td>MMA EL6</td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore a fascio di elettroni</td><td>Temescal</td><td>FC-2000</td><td></td></tr><tr><td>Litografia a fascio di elettroni</td><td>Raith</td><td>Serie 150</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>CR-7 mordenzante al cromo</td><td>Cyantek</td><td>CR-7</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a forza atomica</td><td>Veeco</td><td>Nanoscope III</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di incenerimento al plasma</td><td>Technics</td><td>Series 85 RIE</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)</td><td>Prochimia</td><td>TH 001-m8.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)</td><td>Prochimia</td><td>TH 003m11n3-0.1</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)</td><td>Prochimia</td><td>TH 002-m11.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di risonanza plasmonica di superficie</td><td>Biorad</td><td>XPR36</td><td></td></tr><tr><td>Chip d'oro nudo</td> Chip <td>Biorad</td><td>GLC</td><td>Plasma incenerito per rimuovere il monostrato</td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimmide</td><td>Thermo</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-idrossisuccinimide (NHS)</td><td>Thermo</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Pentilammina-Biotina&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21345</td><td></td></tr><tr><td>Etanolammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Neutraavidin</td><td>Thermo</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Thermo</td><td>28374</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td>Il microscopio è dotato di obiettivo ad immersione in olio 40X; CO2 e incubazione dell'umidità dalla</td></tr><tr><td>telecamera CCD</td><td>di Pecon GmbH Hamamatsu</td><td>Orca R2</td><td>Raffreddato termoelettricamente (16 bit)Spettrometro</td></tr> <tr><td></td><td>Ocean Optics</td><td>QE65Pro</td><td></td></tr><tr><td>Spectrasuite</td><td>Ocean Optics</td><td>versione1.4</td><td></td></tr><tr><td>peptide c-myc HyNic Tag</td><td>Solulink</td><td>SP-E003</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale anti-c-myc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4439</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare di ibridoma</td><td>ATCC</td><td>CRL-1729</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica antimicotica (100&times;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Terreni sierici liberi RPMI 1640&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11835-030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine DHPE</td><td>Life Technologies</td><td>L-1392</td><td></td></tr></tbody></table>

una tecnica senza etichetta per l&#39;imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

La comunicazione intercellulare è parte integrante di un sistema complesso che aiuta a mantenere le attività cellulari di base. Di conseguenza, il malfunzionamento di tale segnalazione può portare a molti disturbi. Per comprendere la segnalazione da cellula a cellula, è essenziale studiare la natura spaziale e temporale delle molecole secrete dalla cellula senza disturbare l'ambiente locale. Sono stati sviluppati vari saggi per studiare la secrezione proteica, tuttavia, questi metodi sono tipicamente basati su sonde fluorescenti che interrompono le vie di segnalazione rilevanti. Per superare questo limite, è necessaria una tecnica label-free.
In questo articolo, descriviamo la fabbricazione e l'applicazione di una tecnologia di risonanza plasmonica di superficie localizzata (LSPRi) senza marcatura in grado di rilevare le secrezioni proteiche da una singola cellula. Le nanostrutture plasmoniche sono modellate litograficamente su un vetrino coprioggetti standard e possono essere eccitate utilizzando la luce visibile su microscopi ottici disponibili in commercio. Solo una piccola frazione del vetrino coprioggetto è coperta dalle nanostrutture e quindi questa tecnica è adatta per combinare tecniche comuni come la fluorescenza e l'imaging in campo chiaro.
In questo protocollo viene utilizzato un approccio multidisciplinare che incorpora la nanofabbricazione del sensore e la successiva biofunzionalizzazione, la caratterizzazione della cinetica di legame di ligando e analita, l'integrazione del chip e delle cellule vive e l'analisi del segnale misurato. Nel complesso, questa tecnologia consente un approccio generale senza marcatura verso la mappatura delle secrezioni cellulari e la loro correlazione con le risposte delle cellule vicine.

In un tipico studio di secrezione delle cellule vive ci sono diverse modalità di raccolta dei dati in atto. La figura 3 mostra una sovrapposizione di un&#39;immagine LSPRi, che mette in evidenza le matrici quadrate, e un illuminato immagine luce trasmessa, che evidenzia la cella in basso a sinistra. I dati sono tipicamente raccolti su un periodo di 3 ore seguita dall&#39;introduzione di una soluzione saturante dell&#39;analita per il calcolo di normalizzazione descritta di seguito. Imagery fluorescenza può anche essere integrato nella routine di raccolta dati dalla commutazione automatica di un cubo filtro. Nella figura 4 una cella macchiato con la fluorescenza di membrana colorante rodamina DHPE esibisce estensioni lamellipodia-like (frecce). Se tali estensioni dovessero coincidere con le matrici avrebbero dato un falso positivo per la secrezione della proteina. Avere diverse modalità di immagini può aiutare a identificare tali eventi. Figura 5 mostra i dati di spettrometria di prima e di poppaer l&#39;introduzione di una soluzione saturante (400 nM) di acquistabile anticorpi anti-c-Myc alle matrici funzionalizzate c-myc. Non erano presenti cellule in questo esperimento. Lo spettro mostra sia uno spostamento rosso e un aumento di intensità. La differenza tra le aree sotto le due curve si traduce in un aumento dell&#39;intensità dell&#39;immagine array in modalità LSPRi sulla fotocamera CCD. Un approccio meno analisi dei dati quadrati non lineare è stato sviluppato per inferire occupazione frazionaria di superficie vincolata ligandi dagli spettri. 30,31 Alla fine dell&#39;esperimento, i valori di intensità saturi (cioè, frazionale occupazione ≈ 1) sono utilizzati per calcolare una risposta normalizzata per ogni matrice utilizzando la seguente formula: Dove sono l&#39;intensità normalizzata al punto di tempo t, intensità iniziale all&#39;inizio dell&#39;esperimento, finale intensità saturato, e l&#39;intensità misurata della matrice al punto di tempo t </em&gt;, rispettivamente. Valori normalizzati da due array sono mostrati in figura 6. Una matrice era a 10 micron della cella in esame, mentre l&#39;altro, utilizzato come controllo, era una distanza di 130 micron dalla cella. L&#39;improvviso aumento nella risposta normalizzata della matrice più vicina alla cella relativa alla risposta piatta della matrice di controllo è indicativa di una raffica localizzata di anticorpi secreti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig1.jpg" /> Figura 1. Sensore design. Un disegno raffigurante la geometria di un tipico esperimento secrezione di cellule vive. La cella (sferoide blu) viene depositato sulla al chip LSPR che contiene array di nanostrutture oro biofunctionalized. Nella vista ingrandita-in, la secrezione delle cellule di interesse, in questo caso gli anticorpi indicati come molecole a forma di Y, viene misurata in quanto si legano alla superficiedelle nanostrutture funzionalizzate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig2.jpg" /> Figura 2. configurazione dell&#39;ottica. La luce illuminato da una lampada alogena viene prima filtrato da un filtro passaggio lungo (LP). La luce viene polarizzata linearmente (P1) e illumina il campione con un obiettivo 40X / 1.4 NA. La luce diffusa viene raccolta dall&#39;obiettivo e passato attraverso un polarizzatore incrociato (P2). Un divisore di fascio 50/50 (BS) è inserito nel percorso ottico raccolti per spettroscopica simultanea e analisi delle immagini. In alto a destra:. Un&#39;immagine microscopia a forza atomica di 9 nanostrutture individuali separati da un passo di 300 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui</a>per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig3.jpg" /> Figura 3. Live Cell LSPRi Studio. Una luce trasmessa e immagine LSPRi mostra una cella ibridomi singolo (in basso a sinistra), circondato da 12 matrici fusa. Questa è un&#39;immagine contrasto migliori. Barra della scala è di 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig4.jpg" /> Figura 4. Live Cell Fluorescence Studio. Un fluorescente immagine a falsi colori di una singola cella ibridoma colorati con rodamina DHPE, che è un colorante membrana. In modalità di imaging fluorescente gli array non sono generalmente visibili, tuttavia, una matrice vicina è osservabile qui come abmanca quadrato nell&#39;angolo in basso a destra. La cella può essere visto per essere separato dalla matrice sebbene estensioni tentacolari (possibilmente filopodi o lamellipodi) vengono estende verso l&#39;esterno dalle cellule (frecce). Barra della scala è di 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig5.jpg" /> Figura 5. spettrale Modalità. Gli spettri ottenuti da un array funzionalizzato c-myc, prima e dopo l&#39;introduzione della soluzione di 400 nM di anticorpi anti-c-Myc. Nessuna cellula erano presenti in questo studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src= &quot;/ files / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. secrezione Single Cell. La risposta di un array si trova a meno di 15 micron di una singola cellula e quello che si trova 130 micron di distanza (di controllo). Barra della scala è di 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Comunicazione intercellulare è fondamentale per controllare varie attività fisiologiche all&#39;interno e all&#39;esterno della cellula. Questo documento descrive un protocollo per misurare la natura spazio-temporale delle secrezioni unicellulari. Per raggiungere questo obiettivo, è usato un approccio multidisciplinare che integra nanoplasmonic label-free sensing con imaging cellulare dal vivo.

Una tecnica senza etichetta per l&#39;Imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la secrezione proteica da singole cellule con elevata risoluzione temporale e spaziale. Questo risultato si ottiene fabbricando litograficamente nanosensori plasmonici in oro su coprioggetti di vetro per l'immagine senza etichette delle secrezioni cellulari singole. Come secondo passaggio, il chip sensore viene pulito e rivestito con uno strato autoassemblato, quindi funzionalizzato con ligandi che presentano un'elevata affinità per le proteine analita secrete.Successivamente, le cellule vengono integrate su chip sensori funzionalizzati al fine di misurare le loro secrezioni nello spazio e nel tempo. I risultati mostrano che le secrezioni proteiche di singole cellule possono essere mappate sia spazialmente che temporalmente, senza la necessità di etichettatura. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della comunicazione intercellulare, come ad esempio in che modo le vie di segnalazione paracrina e autocrina regolino la motilità cellulare.Per iniziare questa procedura, depositare un sottile film di cromo di 10 nanometri su coprioggetti precedentemente puliti mediante evaporazione a fascio di elettroni, per evitare effetti di carica durante la definizione e l'acquisizione delle nanostrutture. Successivamente, applicare il primo strato di resist bistrato costituito da etil lattato e copolimero di metilmetacrilato a 2000 giri al minuto per 45 secondi. Quindi, cuocere il substrato a 150 gradi Celsius dopo averlo lasciato raffreddare a temperatura ambiente.Centrifugare il secondo strato di polimetilmetacrilato a 3000 giri al minuto per 45 secondi e cuocere il substrato a 150 gradi Celsius. Realizzare il disegno sul resist a doppio strato mediante litografia con fascio di elettroni o EBL. Sviluppare con alcol isopropilico o IPA e metil isobutil chetone, o MIBK, in rapporto due a uno e risciacquare con IPA.Rimuovere il cromo dall'area sviluppata di nanostrutture mediante incisione umida utilizzando CR Seven per 10 secondi a temperatura ambiente, quindi risciacquare in acqua deionizzata, distillata e distillata. Depositare un film di titanio-oro sul substrato utilizzando l'evaporatore a fascio di elettroni dopo il deposito dell'oro. Rimuovere il bilayer di copolimero resist mediante immersione del substrato in acetone per quattro ore.Successivamente, ispezionare il substrato utilizzando un microscopio elettronico a scansione per confermare la forma e le dimensioni della nanostruttura. Le nanostrutture risultanti sono tipicamente separate da un passo di 300 nanometri. Array di nanostrutture di dimensioni 20 per 20 sono distanziati di 30 micron da centro a centro.Lasciando ampio spazio per l'immagine cellulare, un chip tipico conterrà 300 matrici. Rimuovere il cromo residuo dal substrato mediante incisione umida utilizzando CR Seven per 60 secondi a temperatura ambiente. Successivamente, risciacquare il substrato con acqua distillata deionizzata.Quindi ispezionare un sottoinsieme di array utilizzando il microscopio a forza atomica per verificare le dimensioni e l'uniformità. Questo vetrino di vetro stampato può essere utilizzato più volte, purché si seguano le corrette procedure di pulizia per la pulizia e la rigenerazione dei chip a risonanza plasmonica superficiale localizzata o LSPR. Eseguire l'ashing al plasma con una potenza di 40 watt in una miscela di 300 milli di 5% di idrogeno e 95% di argon per 45 secondi.Funzionalizzare la superficie d'oro e le nanostrutture immediatamente dopo la pulizia al plasma. Immergendo il chip in una soluzione etanolica bicomponente di tioli costituita da un rapporto tre a uno di SPO e SPC. Dopo aver lasciato il chip nella soluzione di tioli durante la notte per formare un monolivello autoassemblato, risciacquarlo con etanolo ed essiccare con gas azoto. Caricare il chip LSPR all'interno di un supporto microfluidico su misura posizionando il chip su un elemento inferiore in alluminio.Quindi, assemblare il chip tra questo pezzo inferiore e una guarnizione in silicone e un pezzo superiore in plastica trasparente, utilizzando quattro viti per fissare l'insieme. Per una tipica applicazione di tiolo basata su SPC, depositare per gocciolamento 300 microlitri di una miscela uno a uno di EDC 133 millimolare e NHS 33 millimolare in acqua distillata deionizzata per attivare i gruppi carbossilici del componente tiolo SPC. Dopo aver atteso 10 minuti, risciacquare manualmente la superficie con PBS 10 millimolare; successivamente, coniugare il gruppo carbossilico attivato con il ligando di interesse depositando per gocciolamento 300 microlitri della soluzione del ligando.Dopo aver atteso un'ora e aver risciacquato la superficie con PBS 10 millimolare goccia codice, aggiungere 300 microlitri di etanolammina 0,1 molare in PBS sul chip per minimizzare il legame non specifico. Dopo aver atteso 10 minuti, lavare l'etanolammina con PBS contenente 0,005% tra 20 o PBST 20. Successivamente, posizionare un pezzo di quarzo sopra il chip per ridurre le fluttuazioni nei dati legate a un menisco variabile.Mantenere il chip umido con tampone PBST 20 durante il montaggio sul microscopio. Collegare il tubo microfluidico all'assemblaggio e far scorrere il tampone fino al raggiungimento di uno stato stazionario. Successivamente, posizionare saldamente l'assemblaggio del chip LSPR nel portacampioni del piano riscaldato.La configurazione ottica per questo metodo è mostrata qui. La luce della lampada alogena viene fatta passare attraverso un filtro passa-alto a 593 nanometri per eliminare le lunghezze d'onda che non contribuiscono alla risposta nano plasmonica. La luce viene quindi polarizzata linearmente e il campione viene illuminato tramite un obiettivo con apertura numerica 1,4 da 40x per l'eccitazione delle nanostrutture plasmoniche d'oro.La luce diffusa viene raccolta dall'obiettivo e fatta passare attraverso un polarizzatore incrociato per ridurre il segnale di fondo proveniente dal substrato di vetro. Un divisore di fascio 50 50 viene inserito nel percorso della luce raccolta per consentire un'analisi contemporanea spettroscopica e di immagine. Dopo aver lasciato stabilizzare l'assemblaggio e il microscopio per almeno due ore, allineare il chip utilizzando il joystick in modo che l'array centrale risulti allineato con la fibra ottica per la spettroscopia.Dopo la coltura e la formazione del pellet di cellule ibride DOMA mediante centrifugazione, raccoglierle e quindi verificare la vitalità prima di introdurle sui chip LSPR. Successivamente, introdurre manualmente 50 microlitri della soluzione cellulare sui chip LSPR utilizzando una micropipetta. Infine, rimuovere le cellule rimanenti in soluzione con mezzo privo di siero fresco, utilizzando un sistema microfluidico di perfusione per preparare i chip LSPR all'analisi mediante imaging.Un sovrapposizione di un'immagine di microscopia LSPR, che evidenzia gli array quadrati, e un'immagine illuminata in luce trasmessa, che evidenzia la cellula in basso a sinistra, è mostrata qui. Una cellula colorata con il colorante fluorescente per la membrana rodamina DHPE mostra estensioni simili a filopodi. Se tali estensioni si sovrapponessero agli array, darebbero un falso positivo nei dati di spettrometria di secrezione proteica prima e dopo l'introduzione di una soluzione satura di anticorpi anti-cmic negli array funzionalizzati con cmic, come mostrato qui.Questo metodo viene utilizzato per calibrare gli array. La calibrazione degli array aiuta a normalizzare la risposta dei sensori e a determinare l'occupazione frazionaria in base al profilo di biofunzionalizzazione di ciascun esperimento. Uno strumento SPR commerciale viene utilizzato per determinare la costante di dissociazione e per studiare la resistenza al legame non specifico, seguendo lo stesso protocollo descritto per il chip LSPR.I valori normalizzati di due array sono mostrati qui. Un array si trovava a meno di 10 micrometri dalla cellula, mentre il controllo era a 130 micrometri dalla cellula. L'aumento improvviso della risposta normalizzata dell'array più vicino alla cellula, rispetto alla risposta piatta dell'array di controllo, indica un rilascio localizzato di anticorpi secreti.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le secrezioni proteiche da singole cellule con elevata risoluzione spaziale e temporale.

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Questo video mostra la risonanza plasmonica di superficie localizzata per rilevare le secrezioni proteiche da una singola cellula. Utilizzando una configurazione microfluidica e un chip di nanostruttura plasmonica legata a peptidi, i cambiamenti nell'intensità della luce riflessa all'angolo di risonanza rivelano interazioni con le proteine secrete da una singola cellula.

Risonanza plasmonica di superficie localizzata per rilevare le secrezioni proteiche da una singola cellula

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

La distribuzione spaziale e la dinamica temporale delle proteine e dei lipidi della membrana plasmatica è un argomento caldo in biologia. Qui questo problema è affrontato da un'analisi di fluttuazione dell'immagine spazio-temporale che fornisce concettualmente le stesse quantità fisiche di tracciamento di singole particelle, ma utilizza piccole etichette molecolari e configurazioni di microscopia standard.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

Qui presentiamo tecniche per l'imaging di eventi locali di Ca2+ mediati da IP3 utilizzando la microscopia a fluorescenza in cellule di mammifero intatte caricate con indicatori di Ca2+ insieme a un algoritmo che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi eventi.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Per studiare le velocità di flusso e la direzionalità dell'actina filamentosa nella sinapsi immunologica delle cellule T, l'imaging a super-risoluzione su cellule vive è combinato con la fluorescenza a riflessione interna totale e quantificato con la spettroscopia di correlazione delle immagini spazio-temporali.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Un chip microfluidico è stato fabbricato per produrre coppie di punti d'oro per la generazione di bolle tandem e isole rivestite di fibronectina per il patterning di singole cellule nelle vicinanze. Il campo di flusso risultante è stato caratterizzato dalla velocimetria dell'immagine delle particelle ed è stato impiegato per studiare vari bioeffetti, tra cui la porzione della membrana cellulare, la deformazione della membrana e la risposta intracellulare del calcio.

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

Vi presentiamo un protocollo per il rilevamento ottico in tempo reale di singole proteine senza etichetta come essi sono secernuti dalle cellule viventi. Questo si basa su microscopia interferometrica scattering (iSCAT), che può essere applicata ad una varietà di diversi sistemi biologici e configurazioni.

Label-Free Imaging di singole proteine secernuto dalle cellule viventi tramite iSCAT microscopia

La microscopia di localizzazione 3D a molecola singola viene utilizzata per sondare le posizioni spaziali e le traiettorie di movimento delle proteine fluorescenti etichettate nelle cellule batteriche viventi. Il protocollo sperimentale e di analisi dei dati descritto nel presente documento determina i comportamenti diffusivi prevalenti delle proteine citosoliche basate su traiettorie a singola molecola raggruppate.

Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

L'imaging vivo dell'esocitosi lisosomica sulle cellule micromodelle consente una quantificazione spaziale di questo processo. La normalizzazione della morfologia tramite micromodelli è uno strumento eccezionale per scoprire le regole generali sulla distribuzione spaziale dei processi cellulari.

Quantificazione dei parametri Spatiotemporal dell'esocitosi cellulare nelle cellule micromodellate

Presentiamo un metodo per l'acquisizione di corsi di tempo reporter a fluorescenza da singole cellule utilizzando array micropatterned. Il protocollo descrive la preparazione di array a cella singola, la configurazione e il funzionamento della microscopia time-lapse di scansione a celle vive e uno strumento di analisi delle immagini open source per la preselezione automatizzata, il controllo visivo e il tracciamento dei corsi di tempo di fluorescenza integrati nelle celle per sito di adesione.

Imaging a cellule vive di array a cella singola (LISCA) - una tecnica versatile per quantificare la cinetica cellulare

Il metodo di imaging intravitale qui descritto utilizza la seconda generazione armonica di collagene e la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H per segmentare in modo non invasivo un microambiente tumorale non etichettato in compartimenti tumorali, stromali e vascolari per l'analisi approfondita delle immagini intravitali 4D.

Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

Scopri una tecnica senza etichette per l'imaging spazio-temporale delle secrezioni proteiche da singole cellule utilizzando nanosensori plasmonici d'oro. Questo metodo consente di studiare la comunicazione intercellulare con alta risoluzione.

Una tecnica senza etichetta per l'Imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari

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