Indagare rigenerazione funzionale in organotipiche midollo spinale Co-culture Grown in array multi-elettrodo

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare la rigenerazione funzionale delle connessioni intraspinali in colture organotipiche del midollo spinale utilizzando array multi-elettrodi, i cosiddetti meas. Ciò si ottiene coltivando due fette trasversali del midollo spinale una accanto all'altra su misura per imitare le connessioni intraspinali tra diversi segmenti del midollo spinale. In vitro le fette crescono e nel giro di pochi giorni in vitro si fondono lungo i lati uno di fronte all'altro.

Come secondo passo. Le lesioni vengono eseguite dopo diversi periodi di tempo in coltura, il che porta a una completa separazione delle fette. Successivamente, le colture vengono lasciate nell'incubatrice per almeno due settimane.

Al fine di dare alle reti spinali il tempo di rigenerarsi, l'esplosione di attività tra le due fette mostra che le colture lesionate in età precoce mostrano un alto potenziale di rigenerazione funzionale, mentre questa capacità è chiaramente ridotta nelle colture lesionate in età più avanzata. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le fette, coltivate su membrane, colture dissociate o in BSA, è che la combinazione di colture tipiche di Ergon con array di elettrodi multipli ci consente di valutare gli aspetti funzionali della rigenerazione nel microambiente del midollo spinale con accesso sperimentale diretto Per iniziare a fabbricare o acquistare array di elettrodi multipli prefabbricati come quello mostrato qui, Sterilizzare gli array multielettrodo sciacquandoli per 30 secondi, due volte in etanolo al 100%, una volta in etanolo al 70% e poi due volte in acqua distillata. Una volta asciutti, metti da 10 a 12 array in una capsula di Petri di vetro e chiudi il coperchio dopo aver autoclavato gli array per 20 minuti a 120 gradi Celsius.

Posizionare ogni array di elettrodi multipli in una piastra di Petri sterile separata da 35 millimetri. Estrarre una pipetta raffreddata dal congelatore. Usalo per mettere 150 microlitri di soluzione di rivestimento della matrice extracellulare refrigerata sopra l'elettrodo.

Chiudere il coperchio della capsula di Petri e incubare l'array per un'ora a temperatura ambiente. Dopo circa 10 minuti, verificare la presenza di bolle d'aria sulla parte superiore degli elettrodi e rimuoverle delicatamente con una spatola ricoperta di gomma. Se necessario, verificare la scomparsa di tutte le bolle.

Quindi, aspirare la soluzione di rivestimento. Lavare la gomma con un terreno, ottimizzato per i neuroni prenatali ed embrionali, e poi sciacquarli due volte con acqua sterile distillata. Una volta sciacquati, lasciateli riposare a temperatura ambiente fino a quando non saranno asciutti.

Immediatamente dopo l'estrazione dalla madre, trasferire gli embrioni di ratto E 14 decapitati in una capsula di Petri riempita con soluzione di lavaggio refrigerata sterile. Eseguire un taglio trasversale completo con un bisturi sopra gli arti posteriori e un altro sopra i quattro arti, e rimuovere gli arti dal corpo. Quindi, fai un taglio sul piano frontale per separare i visceri dal pezzo posteriore contenente il midollo spinale.

Quindi, trasferisci i pezzi posteriori contenenti il midollo spinale, uno alla volta su un disco di montaggio. Taglia il cordone a uno spessore compreso tra 225 e 250 micron usando un tritatutto. Quindi mettere una goccia di soluzione di lavaggio sul fazzoletto tritato e trasferire le fette in piastre di Petri da 35 millimetri per 10 millimetri riempite con soluzione di lavaggio refrigerata sterile.

Sezionare il midollo spinale lontano da qualsiasi tessuto rimanente su ciascuna delle fette. Avendo cura di lasciare attaccati i gangli della radice dorsale. Trasferire le fette in una capsula di Petri da 35 mm per 10 millimetri riempita con soluzione di lavaggio refrigerata sterile.

Lasciate riposare le fette per un'ora a quattro gradi. Metti una piastra di Petri con un array di micro elettrodi rivestiti all'interno sotto uno stereomicroscopio. Metti a fuoco e centra la serie.

Una gocciolina da sei microlitri di plasma di pollo sull'array di elettrodi. Usando una piccola spatola, far scorrere con cautela due sezioni del midollo spinale con le loro dimensioni ventrali rivolte l'una verso l'altra nella gocciolina di plasma. Poi a otto microlitri di trombina attorno alla gocciolina di plasma di pollo.

Quindi utilizzare la punta della pipetta per mescolare e distribuire accuratamente la miscela di pollo, plasma e trombina. Poco prima che la miscela di plasma di pollo e trombina diventi troppo filamentosa e inizi a coagulare, aspirare il liquido in eccesso, quindi tappare la capsula di Petri e metterla in una camera umidificata. Posizionare la camera all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius per circa un'ora Dopo l'incubazione, aggiungere con cura 10 microlitri di terreno nutritivo al campione.

Tappare la capsula di Petri e rimetterla nell'incubatrice per altri 45 minuti. Quindi, posizionare ciascuno dei gruppi di coltura multi-elettrodo in un tubo a rullo e aggiungere tre millilitri di terreno nutritivo. Chiudere bene il coperchio e posizionare il tubo del rullo nel tamburo del rullo.

Ruotare il tamburo a uno o due RRP M nell'incubatrice a 37 gradi Celsius utilizzando una pinza sterile con punta in gomma. Rimuovere i gruppi di coltura multi-electrode array dal tubo del rullo e posizionarli in una piastra di Petri sotto uno stereomicroscopio. Metti a fuoco il tessuto e verifica che le due fette siano fuse.

Quindi, tenere fermo il gruppo e posizionare una lama di bisturi nella scanalatura dell'array di elettrodi multipli. Vicino alle fette di tessuto. Tenere il bisturi piuttosto orizzontalmente e poi sollevare il manico del bisturi.

Ma lascia che la lama del bisturi rimanga nella scanalatura dell'array in modo tale che la lama rotoli dalla base alla punta tagliando il tessuto, coprendo la scanalatura. Se necessario, recidere eventuali connessioni tissutali residue con la punta di un ago calibro 25, lavorare solo nell'area all'interno del solco e non toccare i bordi teneri. Rimettere i gruppi di coltura multi-elettrodo nel tubo del rullo e aggiungere tre millilitri di terreno nutritivo fresco alle colture.

Quindi riposizionare il tubo del rullo sul tamburo del rullo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Montare un gruppo di coltura multi-elettrodo in una camera di registrazione e applicare circa 500 microlitri di soluzione extracellulare all'array. Quindi montare il gruppo sul microscopio.

Attendere 10 minuti affinché il sistema si stabilizzi, quindi registrare l'attività spontanea di base da ciascuno degli elettrodi di rilevamento dell'attività per 10 minuti. Ripetere le registrazioni per un totale di due volte per garantire condizioni extracellulari stabili. Se lo si desidera, sostituire la soluzione extracellulare dopo ogni sessione di registrazione.

Disinibire la rete applicando una soluzione extracellulare contenente un micromolare di nove e 10 micromolari di gazin e attendere almeno due minuti prima di registrare l'attività elettrica per studiare il potenziale di recupero funzionale delle cocolture derivate dal midollo spinale di embrioni di ratto E 14. Le lesioni sono state eseguite in una finestra temporale da otto a 28 giorni in vitro. Due o tre settimane dopo, è stata registrata l'attività neuronale spontanea.

Utilizzando l'array multi-elettrodo, i dati grezzi vengono quindi trasformati in grafici raster, seguiti da grafici di attività di rete per visualizzare l'attività totale separatamente per lato in ciascuna fetta. L'attività spontanea è solitamente organizzata in raffiche, mostrate qui sotto le fette di disinibizione che sono state separate in giovane età appaiono qui come funzionalmente connesse. Tuttavia, quelli separati in età avanzata appaiono asincroni.

Utilizzando queste informazioni, è possibile determinare e visualizzare la quantità di raffiche sincronizzate tra le fette a varie età come mostrato di seguito Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la colorazione immunoistochimica, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come quali tipi di cellule contribuiscono alla connessione funzionale tra le due fette di quarto spinale.