Name: Allinizio virali ingresso saggi per lidentificazione e la valutazione di composti antivirali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri saggi di ingresso virale per identificare e valutare composti antivirali che inibiscono le fasi iniziali dell'infezione. Questo metodo utilizza saggi luciferasi per misurare l'infettività virale in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo studio è supportato da finanziamenti del Taipei Medical University Hospital (102TMU-TMUH-19) e del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Nota: verificare che tutte le procedure che coinvolgono coltura cellulare e l&#39;infezione da virus sono condotte in cappe di biosicurezza certificate che sono appropriati per il livello di biosicurezza dei campioni essere manipolati. Per lo scopo di descrivere i protocolli, Gaussia luciferasi giornalista HCV-tag è usato come modello di virus 32. Nel contesto dei risultati rappresentativi, l&#39;acido composti chebulagic (CHLA) e punicalagin (PUG) sono utilizzati come farmaci antivirali candidati che hanno come target le interazioni glicoproteina virale con glicosaminoglicani superficie cellulare durante la ingresso del virus presto passi 31. Eparina, che è noto per interferire con l&#39;ingresso di molti virus 30,31,33,34, viene usato come trattamento controllo positivo in questo contesto. Per informazioni generali di base sulle tecniche di virologia, la propagazione di virus, determinazione del titolo del virus, e l&#39;espressione della dose infettante in unità formanti placca (PFU), si concentrano unità formanti (FFU), o molteplicità di infezione (MOI), il lettore è reFERRED di riferimento 35. Per esempi precedenti e condizioni ottimizzate utilizzati per virus mostrati nei risultati rappresentativi, si rimanda ai riferimenti 30-32,36-39 e dettagli elencati nella Tabella 1, Figura 1A, 2A e Figura. Cultura 1. Cella, Preparazione Compound, e Compound citotossicità <ol><li> Grow rispettiva linea cellulare per il sistema virus da analizzare (Tabella 1). Per HCV, far crescere le cellule Huh-7.5 in modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 200 U / ml di penicillina G, 200 mg / ml di streptomicina, e 0,5 mg / ml di amfotericina B. </li><li> Preparare i composti in esame ei controlli utilizzando rispettivi solventi: per esempio, sciogliere CHLA e PUG in dimetilsolfossido (DMSO); preparare eparina in acqua bidistillata sterile. Per tutte le diluizioni successive, utilizzare terreni di coltura. Nota: Il concent finalerazione di DMSO nei trattamenti composto in esame è inferiore all&#39;1% negli esperimenti; 1% DMSO è inclusa come trattamento controllo negativo nei saggi di confronto. </li><li> Determinare la citotossicità dei composti in esame (per esempio, CHLA e PUG) sulle cellule per l&#39;infezione virale utilizzando una vitalità cellulare determinare reagente come XTT (2,3-bis [2-metossi-4-nitro-5-solfofenil] -5-fenilammino) carbonile] idrossido -2H-tetrazolio): <ol><li> Per HCV, sementi Huh-7,5 cellule in un piatto da 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato. </li><li> Applicare controllo DMSO (1%) e concentrazioni crescenti dei composti di prova e CHLA PUG (es. 0, 10, 50, 100, e 500 pM) ai pozzetti di coltura in triplice copia. </li><li> Incubare a 37 ° C per 72 ore, poi scarta il mezzo in piastra e lavare le cellule con 200 ml di tampone fosfato salino (PBS) due volte. </li><li> Aggiungere 100 ml di assaying soluzione dal kit in vitro tossicologia basata XTT ciascun pozzetto ed incubare le piastre a 37 ° C per altri 3 ore per permettere la produzione XTT formazan. </li><li> Determinare l&#39;assorbanza con un lettore per micropiastre alla lunghezza d&#39;onda di prova di 492 nm e una lunghezza d&#39;onda di riferimento di 690 nm. </li><li> Calcolare la percentuale di cellule sopravvissute utilizzando la seguente formula: vitalità cellulare (%) = A / As × 100%, dove &#39;A&#39; e &#39;Come&#39; consultare l&#39;assorbanza dei composti in esame e il controllo solvente (ex 1% DMSO. ) trattamenti, rispettivamente. Determinare la concentrazione di citotossicità cellulare 50% (CC 50) dei composti in esame da un software di analisi come GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore. </li></ol></li></ol> 2. Lettura di infezione virale Nota: La lettura di infezione virale dipende dal sistema virus impiegato e può comportare metodi come saggi placca o measuring segnali giornalista da virus giornalista-tag. Il metodo per determinare l&#39;infezione giornalista-HCV in base all&#39;attività della luciferasi è descritto di seguito. <ol><li> Raccogliere i surnatanti dai pozzetti infetti e chiarire a 17.000 xg in una microcentrifuga per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Mescolare 20 ml di surnatante di prova a 50 ml di luciferasi substrato dal kit assay luciferasi Gaussia e misurare direttamente con un luminometro secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Express HCV infettività come log 10 di unità di luce relativa (RLU) per determinare l&#39;inibizione virale (%) e calcolare la concentrazione del 50% efficace (CE 50) dei composti in esame contro l&#39;infezione da HCV utilizzando algoritmi da software GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 3. disattivazione virale Assay Nota: esempi di periodo di incubazione e la dose virale per vari virus unri elencati nella Figura 1A. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testati aumentando il MOI / PFU. <ol><li> Seme Huh-7.5 celle in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato. </li><li> Incubare i composti di prova o di controllo (concentrazioni finali sono: CHLA = 50 micron; PUG = 50 micron; eparina = 1,000 mg / ml; DMSO = 1%) con le particelle di HCV a 37 ° C (Figura 1A, &#39;a lungo termine&#39; ) in un rapporto 1: 1. Ad esempio, per un inoculo del virus 100 ml contenente 1 x 10 4 FFU, aggiungere 100 ml di una diluizione di lavoro 100 mM CHLA; questo produce trattamento CHLA ad una concentrazione finale di 50 mM. </li><li> Diluire la miscela virus-farmaco (inefficace) concentrazione &quot;sub-terapeutica&quot; dei composti in esame. Ad esempio, la concentrazione di CHLA inefficace e PUG contro l&#39;HCV è a 1 pM 31; dunquequesto richiede una diluizione di 50 volte della miscela virus farmaco che può essere realizzato con 9,8 ml di mezzo basale (medium di coltura delle cellule con 2% FBS). Nota: La diluizione a concentrazione sub-terapeutica impedisce significativa interazione tra i composti di prova e la superficie della cellula ospite e consente l&#39;esame degli effetti del trattamento sui virioni cell-free. Si noti che questa diluizione è dipendente dalla dose-risposta antivirale dei composti in esame contro la particolare infezione virale, ed è determinata prima di eseguire questo particolare test 31. </li><li> Per confronto, mescolare il virus con i composti di test e immediatamente diluito (senza periodo di incubazione) alla concentrazione sub-terapeutica prima di infezione (Figura 1A, &#39;a breve termine&#39;). </li><li> Aggiungere 100 pl di miscela HCV-farmaco diluito sulla Huh-7.5 monostrato di cellule (la quantità di virus è ora a 1 x 10 2 FFU; finale MOI = 0.01) e incubare per 3 ore a 37 ° C per consentire viraleadsorbimento. </li><li> Seguendo l&#39;infezione, rimuovere il inoculi diluito e lavare delicatamente i pozzetti con 200 ml di PBS due volte. Nota: Eseguire le lava delicatamente per evitare di sollevare le cellule. </li><li> Applicare 100 ml di terreno di base a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 72 ore. </li><li> Analizzare l&#39;infezione risultante analizzando il surnatante per l&#39;attività luciferasi come descritto in &#39;2. Lettura di infezione virale &#39;. </li></ol> 4. Viral Allegato Assay Nota: esempi di periodo di incubazione e la dose virale per vari virus sono elencati nella Figura 2A, &#39;allegato&#39;. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testati aumentando il MOI / PFU. <ol><li> Seme Huh-7.5 celle in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato. </li><li> Pre-raffreddare i monostrati cellulari in piastre a 4 ° C for 1 ora. </li><li> Co-trattare le cellule con HCV inoculo (MOI = 0.01) e composti di prova o controlli (concentrazioni finali sono: CHLA = 50 mM; PUG = 50 mM; eparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) a 4 ° C per 3 ore. Ad esempio, per un inoculo del virus 90 ml contenente 1 x 10 2 FFU, aggiungere 10 ml di una diluizione di lavoro 500 mM CHLA; questo produce trattamento CHLA ad una concentrazione finale di 50 mM e un&#39;infezione da HCV a MOI = 0.01 sul monostrato cellulare. Nota: È importante effettuare l&#39;esperimento a 4 ° C in quanto consente per il legame del virus, ma preclude ingresso che si verifica più efficiente a 37 ° C. Effettuare l&#39;aggiunta di composti di virus e di test su ghiaccio e la conseguente incubazione in un 4 ° C frigorifero per garantire che la temperatura è mantenuta a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare delicatamente il monostrato cellulare con 200 ml di ghiacciata PBS due volte. Nota: Eseguire le lava delicatamente per evitare di sollevare le cellule &lt;./ li&gt; <li> Applicare 100 ml di terreno di base a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 72 ore. </li><li> Analizzare l&#39;infezione risultante analizzando il surnatante per l&#39;attività luciferasi come descritto in &#39;2. Lettura di infezione virale &#39;. </li></ol> 5. Viral Entrata / Fusion Assay Nota: Esempio di periodi di incubazione e la dose virale per vari virus sono elencati nella Figura 2A &#39;Entry / fusione&#39;. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testati aumentando il MOI / PFU. <ol><li> Seme Huh-7.5 celle in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10 4 cellule per pozzetto) e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% O / N per ottenere un monostrato. </li><li> Pre-raffreddare i monostrati cellulari in piastre a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Infettare le cellule con HCV (MOI = 0,01) a 4 ° C per 3 ore. Ad esempio, utilizzare un inoculo del virus 100 ml contenente 1 x 10 2 FFU. Nota: Eseguire la addizione dell&#39;inoculo virale su ghiaccio e la conseguente incubazione in un 4 ° C frigorifero per mantenere la temperatura a 4 ° C, che permette virale entrata ma non vincolante. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare delicatamente i monostrati cellulari con 200 ml di ghiacciata PBS due volte. Nota: Eseguire le lava delicatamente per evitare di sollevare le cellule. </li><li> Trattare i pozzetti con i composti in esame o controlli (concentrazioni finali sono: CHLA = 50 mM; PUG = 50 mM; eparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) e incubare a 37 ° C per 3 ore. Ad esempio, aggiungere 10 ml di una diluizione di lavoro di 500 micron CHLA a 90 ml di media, mescolare, e trattare i pozzetti; questo produce trattamento CHLA ad una concentrazione finale di 50 mM. Nota: Il passaggio da 4 ° C a 37 ° C facilita ora l&#39;evento di ingresso / fusione virale e quindi permette la valutazione dell&#39;effetto composti di prova &#39;su questo particolare punto. </li><li> Aspirare il surnatante contenente droga e rimuovere non interiorizzatovirus extracellulari né dal lavaggio con 200 ml di tampone citrato (citrato di sodio 50 mM, cloruro di potassio 4 mM, pH 3,0) o PBS. Applicare 100 ml di terreno di base prima di incubazione a 37 ° C per 72 ore. </li><li> Analizzare l&#39;infezione risultante analizzando il surnatante per l&#39;attività luciferasi come descritto in &#39;2. Lettura di infezione virale &#39;. </li></ol>

<ol><li>Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccines%3A+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">HIV vaccines: progress to date.</a> Drugs. 71, 387-414 (2011).</li>
<li>Rothman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+dengue+virus%3A+a+tale+of+original+antigenic+sin+and+tropical+cytokine+storms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms.</a> Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).</li>
<li>Sung, H., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+current+status+of+cytomegalovirus+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Update on the current status of cytomegalovirus vaccines.</a> Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).</li>
<li>Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+development+of+preventive+and+therapeutic+vaccines+for+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).</li>
<li>Wright, M., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+prevention+and+therapy%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future.</a> Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).</li>
<li>Christou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+bacterial+and+viral+zoonotic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">The global burden of bacterial and viral zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).</li>
<li>Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+socio-ecology+of+zoonotic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">The socio-ecology of zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).</li>
<li>Grais, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+vaccination+in+humanitarian+emergencies%3A+a+review+of+recent+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Confl+Health%22%5BJournal%5D)">Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice.</a> Confl Health. 5, 21(2011).</li>
<li>Gautret, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+viral+respiratory+tract+infections-environmental+risk+factors+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission.</a> Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome%3A+what+clinicians+need+to+know%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know.</a> Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).</li>
<li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+Virus%3A+a+Clear+and+Present+Danger%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ebola Virus: a Clear and Present Danger.</a> J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).</li>
<li>Bishop, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+Emerging+Treatment+Options+for+Ebola+Virus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease.</a> Ann Pharmacother. , (2014).</li>
<li>Arduino, P. G., Porter, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+and+perioral+herpes+simplex+virus+type+1+%28HSV-1%29+infection%3A+review+of+its+management%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management.</a> Oral Dis. 12, 254-270 (2006).</li>
<li>Mitrasinovic, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+structure-based+design+of+the+influenza+A+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors.</a> Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).</li>
<li>Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+acting+antivirals+against+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Directly acting antivirals against hepatitis C virus.</a> J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).</li>
<li>Haqqani, A. A., Tilton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+inhibitors+and+their+use+in+the+treatment+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection.</a> Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).</li>
<li>Melby, T., Westby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Exp+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of viral entry.</a> Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).</li>
<li>Vanderlinden, E., Naesens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+antiviral+strategies+to+interfere+with+influenza+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry.</a> Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).</li>
<li>Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+targeted+therapeutics%3A+a+new+era+of+anti-herpes+simplex+virus-1+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics.</a> Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).</li>
<li>Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatitis+C+virus+life+cycle+as+a+target+for+new+antiviral+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies.</a> Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).</li>
<li>Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New-generation+screening+assays+for+the+detection+of+anti-influenza+compounds+targeting+viral+and+host+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions.</a> Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).</li>
<li>Kilianski, A., Baker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+antiviral+screening+against+coronaviruses%3A+developing+virus-specific+and+broad-spectrum+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors.</a> Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).</li>
<li>Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerases+of+hepatitis+C+viruses+and+flaviviruses%3A+structural+and+mechanistic+insights+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development.</a> Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).</li>
<li>Frey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+cell-cell+fusion+induced+by+the+envelope+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 69, 1462-1472 (1995).</li>
<li>Tscherne, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-+and+temperature-dependent+activation+of+hepatitis+C+virus+for+low-pH-triggered+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry.</a> J Virol. 80, 1734-1741 (2006).</li>
<li>Madan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+umbrellas%3A+a+novel+class+of+candidate+topical+microbicides+to+prevent+human+immunodeficiency+virus+and+herpes+simplex+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections.</a> J Virol. 81, 7636-7646 (2007).</li>
<li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+temperature+dependence+of+influenza+virus+membrane+fusion+at+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH.</a> J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).</li>
<li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+membrane+fusion%3A+time+course+and+effect+of+temperature%2C+pH%2C+calcium%2C+and+receptor+concentration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration).</a> Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).</li>
<li>Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+cells+by+Sindbis+virus+at+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Infection of cells by Sindbis virus at low temperature.</a> Virology. 362, 461-467 (2007).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> J Virol. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiol. 13, 187(2013).</li>
<li>Marukian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-produced+hepatitis+C+virus+does+not+infect+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells.</a> Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).</li>
<li>Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+polysaccharides+are+potent+and+selective+inhibitors+of+various+enveloped+viruses%2C+including+herpes+simplex+virus%2C+cytomegalovirus%2C+vesicular+stomatitis+virus%2C+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+ChemotheR%22%5BJournal%5D)">Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus.</a> Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).</li>
<li>Barth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+binding+of+hepatitis+C+virus+envelope+glycoprotein+E2+requires+cell+surface+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+CheM%22%5BJournal%5D)">Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate.</a> J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Brown, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+caspase-dependent+apoptosis+in+antibody-enhanced+dengue+virus+infection+of+human+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells.</a> J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+host+responses+to+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+following+intranasal+administration+of+a+Protollin-adjuvanted%2C+epitope-enhanced+recombinant+G+protein+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine.</a> J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).</li>
<li>Isaacson, M. K., Compton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+glycoprotein+B+is+required+for+virus+entry+and+cell-to-cell+spread+but+not+for+virion+attachment%2C+assembly%2C+or+egress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress.</a> J Virol. 83, 3891-3903 (2009).</li>
<li>Leonard, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+virus+blind+to+its+epithelial+cell+receptor+remains+virulent+in+rhesus+monkeys+but+cannot+cross+the+airway+epithelium+and+is+not+shed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed.</a> J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).</li>
<li>Ciesek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+tea+polyphenol%2C+epigallocatechin-3-gallate%2C+inhibits+hepatitis+C+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry.</a> Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saikosaponin+b2+is+a+naturally+occurring+terpenoid+that+efficiently+inhibits+hepatitis+C+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry.</a> J Hepatol. 62, 541-548 (2015).</li>
<li>Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+methods+for+influenza+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Screening methods for influenza antiviral drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+virus+inhibitors+by+influenza+A+virus+specific+reporter+cell+based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening.</a> Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non esistono interessi concorrenti.

In questo rapporto sono stati descritti i metodi per identificare e valutare i composti antivirali basati su un approccio meccanicistico di sezionamento degli eventi di ingresso virale precoce. In particolare, i saggi ci hanno permesso di esaminare l'effetto dei composti in esame sulle particelle virali libere, sull'attaccamento virale e sull'ingresso/fusione virale. Sono state implementate misure critiche per valutare distintamente l'effetto del farmaco sullo stadio specifico dell'ingresso precoce del virus. Ad esempio, nel "saggio di inattivazione virale", la diluizione della miscela virus-farmaco a una concentrazione sub-terapeutica impedisce un'interazione significativa tra il composto in esame e la superficie della cellula ospite "titolando" il farmaco. Ciò garantisce che l'effetto inibitorio osservato sulla successiva infezione della cellula ospite sia dovuto a un'interazione diretta tra il composto in esame e i virioni liberi da cellule, piuttosto che a un effetto del composto in esame sulla membrana della cellula ospite o sulle molecole associate alla membrana, compresi i recettori virali30. Analogamente, lo spostamento della temperatura tra 4 °C (che consente il legame ma non l'ingresso del virus) e 37 °C (che facilita l'ingresso/fusione del virus) nel "saggio di attacco virale" e nel "saggio di ingresso/fusione virale" è fondamentale per determinare l'effetto del composto in esame su ciascuno di questi eventi specifici. Ciò è possibile a causa della sensibilità alla temperatura dei virus avvolti durante queste fasi dell'infezione24-29. È quindi importante che i saggi vengano eseguiti alla temperatura indicata per garantire l'accuratezza dei risultati; ad esempio, effettuando l'esperimento su ghiaccio per mantenerlo a 4 °C e posizionando il campione direttamente in un incubatore a 37 °C per lo spostamento della temperatura. Inoltre, l'uso di controlli negativi (es. solvente DMSO per la preparazione dei farmaci) e positivi (es. trattamento con eparina) aiutano a stabilire ulteriormente l'accuratezza dei test. L'utilità e l'applicabilità di tali metodi sono state dimostrate in molti studi antivirali26,30,31,40,41. Si noti che, sebbene l'eparina sia inclusa come controllo per tutti e tre i test nel contesto dei risultati rappresentativi, in genere blocca il legame iniziale del virus piuttosto che la successiva fase di fusione/ingresso (come riflesso dai dati nella Figura 2). Potrebbero essere utilizzati anche controlli aggiuntivi, come gli anticorpi neutralizzanti diretti contro il virus (per il test di inattivazione virale), gli anticorpi che mascherano i recettori della superficie cellulare per il virus (per il test di attaccamento virale) e gli inibitori della fusione di membrana (per il test di fusione/ingresso virale). 
I saggi descritti in questo rapporto, che sono specifici per le prime fasi dell'infezione virale, sono utili in termini di applicazione come test secondari per caratterizzare il meccanismo d'azione dei farmaci candidati dagli screening primari che tipicamente mirano all'infezione virale in modo più ampio. In alternativa, potrebbero anche essere incorporati negli screening primari se si è specificamente alla ricerca di inibitori dell'ingresso precoce del virus, inclusi agenti inattivanti del virus, antagonisti dell'attaccamento virale e inibitori dell'ingresso/fusione virale. In questo caso, il loro utilizzo consente un'analisi dello schermo più mirata e precisa per l'identificazione di candidati antivirali meccanismo-specifici, che, a sua volta, accelererebbe lo sviluppo di farmaci a valle. 
L'uso di saggi basati su cellule per identificare gli agenti antivirali offre diversi vantaggi importanti rispetto ai saggi biochimici, tra cui la rivelazione di potenziali effetti off-target (come la citotossicità) e l'aggiunta di rilevanza fisiologica alla bioattività degli agenti in esame42. Questi aspetti sono considerazioni importanti per decidere se un agente candidato è di valore per la continuazione nelle fasi successive dello sviluppo del farmaco. Analogamente, i saggi specifici per l'ingresso virale precoce descritti in questo rapporto consentono di esaminare l'effetto del farmaco sullo stadio di ingresso virale distinto a livello cellulare, e più specificamente nel contesto di un'autentica infezione virale in vitro. I risultati ottenuti da tali saggi aiuterebbero quindi a prevedere meglio l'efficacia antivirale dei composti in esame e a identificare anche gli effetti potenzialmente indesiderati fuori bersaglio contro la cellula ospite. Un potenziale limite, tuttavia, è che un test in vitro basato su cellule potrebbe non riflettere completamente l'effettiva fase di ingresso in vivo nel contesto di un'infezione virale naturale. Ciononostante, i saggi presentati in questo protocollo fungono da piattaforma analitica per l'identificazione e la valutazione basata su meccanismi di nuovi agenti antivirali.
Lo sviluppo di virus reporter o sistemi cellulari reporter per quantificare la quantità di infezione virale ha notevolmente facilitato lo screening e la valutazione dei composti antivirali su base cellulare. Gli esempi includono l'uso di virus ricombinanti portatori di un gene reporter o per mezzo di linee cellulari umane ricombinanti contenenti un gene reporter guidato dal promotore specifico del virus31,43. In questo rapporto, l'infezione da HCV marcato con luciferasi può essere facilmente monitorata quantificando il segnale reporter, facilitando così l'analisi dei dati. Incorporando questi utili strumenti basati su reporter, i saggi di ingresso virale precoce qui descritti possono essere essenzialmente adattati in un formato ad alto rendimento per lo screening basato su meccanismi di librerie di piccole molecole.
In conclusione, è stato descritto un protocollo per i saggi che sezionano l'ingresso virale precoce come mezzo per identificare e valutare i composti antivirali meccanismo-specifici. Tali saggi sarebbero utili per scoprire nuovi antagonisti/inibitori dell'ingresso virale e contribuirebbero ad ampliare la portata degli agenti antivirali per lo sviluppo come trattamenti profilattici e/o terapeutici.

Le infezioni virali sono una minaccia costante per la salute pubblica e una causa significativa di malattie epidemiche, morbilità e decessi in tutto il mondo. Le modalità specifiche di controllo contro le infezioni virali includono lo sviluppo di vaccini e terapie antivirali. Mentre gli sforzi vaccinali si sono dimostrati efficaci nell'immunizzazione contro diversi virus, molti agenti patogeni virali rimangono senza un vaccino protettivo, tra cui il virus della dengue (DENV), il citomegalovirus umano (HCMV), il virus dell'epatite C (HCV), il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) e il virus respiratorio sinciziale (RSV)1-5. Gli antivirali, d'altra parte, svolgono un ruolo importante per la gestione di queste infezioni virali quando i vaccini profilattici non sono disponibili. Tuttavia, ad oggi, sono disponibili solo pochi farmaci antivirali autorizzati ed economici rispetto al numero di agenti patogeni virali che minacciano la salute pubblica. Ancora più importante, a causa dell'aumento dei viaggi globali e della rapida urbanizzazione, la situazione è aggravata dai rischi di focolai epidemici dovuti a infezioni virali emergenti/riemergenti che vengono introdotte in aree non indigene6. Recenti epidemie causate dal virus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS), dai virus influenzali (H1N1, H5N1, H3N2 e H7N9), dal DENV, dal virus del Nilo occidentale (WNV), dal virus del morbillo (MV), dal virus della sindrome respiratoria mediorientale (MERS) e dal virus Ebola6-12 sono tra gli esempi che riflettono la necessità di sviluppare antivirali quando l'immunizzazione e/o le terapie non sono disponibili. Inoltre, c'è sempre un potenziale rischio di generare infezioni resistenti ai farmaci con gli antivirali attualmente utilizzati. Pertanto, il continuo sviluppo e l'espansione della portata degli antivirali per queste infezioni virali emergenti/riemergenti sono necessari per fornire migliori strategie di gestione e salvaguardare la salute pubblica.
La maggior parte delle terapie antivirali consiste in antivirali ad azione diretta (DAA) che prendono di mira una specifica proteina virale o cofattore che media passaggi importanti nel ciclo di vita virale. Ad esempio, l'analogo nucleosidico Acyclovir inibisce l'herpesvirus DNA polimerasi, gli inibitori della proteasi Boceprevir e Telaprevir antagonizzano l'HCV NS3 e Oseltamivir e Zanamivir sono inibitori della neuraminidasi che bloccano il rilascio di particelle del virus dell'influenza dalle cellule infette13-15. Esistono tuttavia pochissimi inibitori dell'ingresso virale autorizzati, tra cui Enfuvirtide, che ha come bersaglio l'HIV gp41 per prevenire la fusione, e Maraviroc, che blocca il co-recettore dell'HIV CCR5, impedendo così l'ingresso virale16. L'esplorazione di nuovi antagonisti/inibitori dell'ingresso virale potrebbe aiutare a fornire ulteriori terapie per uso profilattico o terapeutico, ad esempio in combinazione con altri antivirali con un diverso meccanismo d'azione per gestire meglio le infezioni virali17-19. 
L'identificazione degli antivirali può comportare la progettazione di farmaci guidata dalla struttura e una strategia basata sullo screening dei farmaci candidati. I metodi per valutare l'attività antivirale degli agenti in esame comprendono saggi biochimici dell'attività enzimatica e la valutazione mediante sistemi cellulari20-23. Nei sistemi cellulari, il ciclo di vita virale può essere suddiviso in fasi distinte dell'infezione, come gli eventi di ingresso (attaccamento, fusione, srivestimento), la fase di replicazione (replicazione del genoma virale e traduzione delle proteine) e l'uscita del virione (assemblaggio, maturazione e rilascio). Poiché i saggi possono essere adattati per studiare ogni stadio specifico utilizzando vari strumenti e metodi, questo approccio consente l'identificazione/l'esame di potenziali antivirali candidati con un meccanismo d'azione specifico mirato allo stadio distinto analizzato. Ad esempio, per analizzare l'effetto del farmaco in modo specifico sulle particelle virali libere prima del legame con la cellula ospite, è possibile eseguire un "saggio di inattivazione virale". In questo test, il virus viene lasciato incubare con il farmaco in esame e quindi diluito per titolare il farmaco prima di infettare un monostrato cellulare. Ulteriori passaggi come l'attaccamento virale e le fasi di ingresso/fusione possono anche essere analizzati individualmente, spostando la temperatura durante l'infezione. Per molti virus con involucro, l'ingresso/fusione virale nella membrana della cellula ospite è notevolmente facilitato a 37 °C, ma è tipicamente precluso a 4 °C, il che non influisce sul legame del virus24-29. Infine, l'uso di virus reporter o sistemi cellulari potrebbe facilitare questi studi e consentire un'analisi ad alto rendimento.
Abbiamo precedentemente impiegato l'approccio basato su cellule e analizzato l'ingresso precoce di vari virus avvolti per l'esame di composti antivirali che potenzialmente antagonizzano l'ingresso virale30,31. Qui vengono descritti i vari metodi utilizzati, tra cui l'inattivazione virale, l'attaccamento virale e i saggi di ingresso/fusione virale.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Kit di test tossicologici in vitro,</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr> <tr><td>basato su XTTPBS pH 7,4&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Thermo Scientific</td><td>89087-320</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio della luciferasi BioLux Gaussia New</td><td>England Biolabs</td><td>E3300L&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luminometro</td><td>Promega</td><td>GloMax-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio, diidrato</td><td>Sigma</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr></tbody></table>

all&#39;inizio virali ingresso saggi per l&#39;identificazione e la valutazione di composti antivirali

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

I sistemi basati su cellule sono utili per scoprire agenti antivirali. L'analisi del ciclo di vita virale, in particolare delle prime fasi di ingresso, consente un approccio meccanicistico per identificare e valutare gli agenti antivirali che mirano a fasi specifiche dell'ingresso virale. In questo rapporto, vengono descritti i metodi per esaminare l'inattivazione virale, l'attaccamento virale e l'ingresso/fusione virale come test antivirali per tali scopi, utilizzando il virus dell'epatite C come modello. Questi saggi dovrebbero essere utili per scoprire nuovi antagonisti/inibitori dell'ingresso precoce del virus e aiutare ad espandere la portata degli agenti antivirali candidati per l'ulteriore sviluppo di farmaci.

Nella figura 1, il &#39;inattivazione virale test&#39; stata effettuata per verificare se due specifici composti CHLA naturale e PUG potrebbero inattivare i diversi virus con involucro in stato senza cellulare e prevenire l&#39;infezione successiva. La citotossicità e antivirale dose-risposta di questi composti sono stati determinati prima di eseguire lo studio meccanicistica 31. I virus sono stati pretrattati con composti in esame e poi le miscele virus-farmaco sono stati diluiti a concentrazioni sub-terapeutiche prima dell&#39;inoculazione sul rispettivo monostrato cellulare per ogni sistema virus. Come mostrato in Figura 1, sia CHLA e PUG sembravano interagire con i virioni cellule libere, con gravi effetti irreversibili che proteggeva il monostrato cellulare dalla successiva infezione. I due composti in esame ha realizzato un vicino di inibizione 100% contro HCMV, HCV e DENV-2, mentre un 60 - blocco 80% è stata osservata contro MV e RSV. Questi risultati Suggest che CHLA e PUG hanno un impatto diretto su queste particelle virali libere inattivando loro e neutralizzando la loro infettività. Nella figura 2, l&#39;allegato e di ingresso / test di fusione sono stati eseguiti per esplorare l&#39;effetto di CHLA e PUG contro questi eventi rapida entrata correlati virali da HCMV, HCV, DENV-2, MV, e RSV. Sia CHLA e PUG efficacemente impedito vincolante del virus esaminati sui rispettivi cellula ospite come mostrato dalla inibizione virale risultante (Figura 2, &#39;Allegato&#39;: luce barre grigie). L&#39;effetto inibitorio sulla attaccamento virus da entrambi i composti era simile contro HCMV (Figura 2B), HCV (Figura 2C), DENV-2 (Figura 2D), e RSV (Figura 2F), che vanno da 90 - 100%. D&#39;altra parte, PUG sembrava essere più efficace contro CHLA MV assorbente (figura 2E), con il tasso di inibizione della two composti variabili tra 50 - 80%. L&#39;eparina trattamento di controllo, che è noto per impedire l&#39;ingresso di molti virus, anche inibito attaccamento di HCMV, DENV-2, RSV, annuncio MV, ma era meno efficace contro HCV. La conseguente &#39;test di ingresso / fusione virale&#39; esaminato se CHLA e PUG conservato la loro attività durante la fase di entrata del virus / fusione (Figura 2, &#39;Entry / Fusion&#39;: barre grigio scuro). Ancora una volta, sia CHLA e PUG stati osservati compromettere efficacemente l&#39;ingresso virale passo / fusione dei virus esaminati (Figura 2B - F), ottenendo un 50 - effetto protettivo 90% corrisponde monostrato cellulare. Eparina anche potentemente inibito l&#39;ingresso / fusione DENV-2 e infezioni da RSV, ma era meno efficace contro HCMV, HCV, e MV (&lt;40% di inibizione in media). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Tipo di cella </td></tr><tr><td> HCMV </td> &lt;td&gt; HEL </td></tr><tr><td> HCV </td><td> Huh-7.5 </td></tr><tr><td> DENV-2 </td><td> Vero </td></tr><tr><td> MV </td><td> CHO-SLAM </td></tr><tr><td> RSV </td><td> HEp-2 </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Tipo cellula ospite per infezione virale è indicato il tipo cellulare utilizzato per ogni sistema infezione virale descritto nei risultati rappresentativi. Ulteriori dettagli riguardanti le cellule possono essere trovati in riferimento 31. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;inattivazione di infezioni virali da parte CHLA composti di prova e PUG diversi virus sono stati trattati con i composti di prova per un lungo periodo. (Incubate per 1,5-3 ora prima titolazione; luce barre grigie) o breve periodo (immediatamente diluita; grigio scuro bar) a 37 ° C prima di una diluizione di concentrazione sub-terapeuticizione e successiva analisi di infezione delle cellule rispettivo ospitanti. (A) Schema dell&#39;esperimento (mostrato a sinistra) con la concentrazione di virus finale (PFU / pozzetto o MOI), il periodo di incubazione del virus farmaco-lungo termine (i), e tempo di incubazione successivo (ii) indicato per ciascun virus nella tabella a destra. Analisi per (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) RSV sono indicati in ogni pannello supplementare. I risultati sono riportati contro il trattamento di controllo negativo DMSO per infezione da virus ed i dati indicati sono il mezzo ± errori standard della media (SEM) da tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata da riferimento 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" /> Figura 2. Valutazione delle attività antivirale del CHLA composti di prova e PUG contro virus e attaccamento entrata / fusion. (A) La procedura sperimentale, concentrazione virale (PFU / pozzetto o MOI), e il tempo di aggiunta e trattamento con i composti in esame (i, ii, iii) sono presentati per ogni virus negli schemi e le tabelle associate. Nell&#39;analisi allegato virus (luce barre grigie), monostrati di diversi tipi cellulari sono stati pre-raffreddato a 4 ° C per 1 ora, poi co-trattati con rispettivi virus e composti di prova a 4 ° C (1.5 - 3 ore; i) prima di lavare via i monostrati e composti di prova per la successiva incubazione (37 ° C; ii) e l&#39;esame di infezione da virus. In entrata virus / analisi fusione (barre grigio scuro), monostrati di cellule sono stati seminati pre-raffreddata a 4 ° C per 1 ora e poi sfidato con rispettivi virus a 4 ° C per 1,5 - 3 ore (i). Le cellule sono state poilavata e trattata con i composti di prova per un periodo di incubazione addizionale (ii) durante il quale la temperatura è stata spostata a 37 ° C per facilitare l&#39;evento di ingresso / fusione virale. Al termine dell&#39;incubazione, virus extracellulari sono stati rimossi da uno tampone citrato (pH 3,0) o lavaggi PBS e le cellule sono state ulteriormente incubate (iii) per l&#39;analisi di virus. Risultati per (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) RSV sono indicati in ogni pannello supplementare. I dati sono riportati contro il trattamento di controllo negativo DMSO di infezione da virus e sono presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata da riferimento 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo che esamina passaggi specifici dell'ingresso virale per identificare e valutare nuovi agenti antivirali.

All&#39;inizio virali ingresso saggi per l&#39;identificazione e la valutazione di composti antivirali

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare l'effetto antivirale di composti in esame contro specifici passaggi iniziali dell'ingresso virale. Questo viene raggiunto innanzitutto seminando le cellule ospiti per l'infezione virale. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire l'infezione virale e i trattamenti con i composti in esame in diversi momenti e a diverse temperature.Successivamente, i campioni trattati con il farmaco vengono rimossi mediante lavaggio e le cellule vengono ricoperte con mezzo basale. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare le cellule. Infine, l'infecciosità virale viene analizzata per determinare l'influenza dei composti in esame sui primi stadi di entrata del virus durante l'infezione virale.Ad esempio, un luminometro viene utilizzato per valutare l'attività della luciferasi nel lisato cellulare ottenuto dopo l'infezione da un virus reporter. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un approccio più basato sui meccanismi nell'identificazione di agenti antivirali, in particolare quelli che agiscono sull'ingresso virale. Per iniziare, preparare innanzitutto soluzioni stock dei composti da testare: acido triterpenico o CHLA e collagene punico o PUG in DMSO; sciogliere l'eparina come controllo positivo in acqua sterile doppiamente distillata; preparare quindi le cellule ospiti per la coltura necessaria al saggio.Cellule di carcinoma epatico umano, HUH 7.5, coltivate durante la notte in DMEM fresco integrato con FBS e antibiotici. Ricordare di seguire le procedure del livello di sicurezza biologica due durante l'esperimento per testare la citotossicità dei composti in esame. Trattare le cellule con concentrazioni crescenti di CHLA o PUG da zero a 500 micromolar diluite nel mezzo basale, oppure con 1% DMSO come controllo negativo, quindi incubare le cellule per 72 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari.Rimuovere il mezzo e lavare le cellule due volte con 200 microlitri di PBS. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di reagente per il saggio XT T e incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi utilizzare un lettore di microplacche per determinare l'assorbanza a 492 nanometri con una lunghezza d'onda di riferimento a 690 nanometri.Calcolare la percentuale di vitalità utilizzando una formula specifica a partire da questi valori. Determinare le concentrazioni di citotossicità cellulare al 50% per ciascun composto. Iniziare il saggio di inattivazione virale.Prima piastra, una volta 10 alla quarta cellule per pozzetto. In una piastra a 96 pozzetti, incubare le cellule a 37 °C con il 5% di anidride carbonica durante la notte per l'adesione prima dell'infezione. Preparare il virus dell'epatite C o particelle di HCV marcate con il reporter Gaia luciferasi come indicato nel protocollo del testo.In un tubo sterile, mescolare 100 microlitri di CHLA 100 micromolare o PUG con 100 microlitri di 10 alla quarta unità formanti focolai o FFU di HCV per ottenere una miscela di controllo positivo. HCV con eparina a una concentrazione finale di 1000 microgrammi per millilitro.Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo tre ore, diluire la miscela del composto virale di 50 volte con 9,8 millilitri di mezzo basale a temperatura ambiente. Quindi preparare una nuova miscela del composto virale e immediatamente diluire questa miscela in mezzo basale per il campione di incubazione allo zero ore.Dopo aver rimosso il mezzo di incubazione dalle cellule, aggiungere 100 microlitri di soluzione del farmaco virale diluita per pozzetto in triplice replicazione. La soluzione contiene ora da 10 alla seconda FFU per pozzetto; incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre ore per consentire l'infezione virale delle cellule. Al termine dell'incubazione, rimuovere la sospensione virale dai pozzetti e lavare delicatamente le cellule con 200 microlitri di PBS, due volte.Incubare le cellule in 100 microlitri di mezzo basale per 72 ore per consentire la replicazione virale e il rilascio del reporter luciferasi nel sopranatante. Successivamente, raccogliere il sopranatante dalle colture e dai microtubi e centrifugare a 17.000 × g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Per rimuovere i detriti cellulari, mescolare 20 microlitri di ciascun sopranatante con 50 microlitri di reagente per il saggio di luciferasi gaussiana e misurare la luminescenza derivante dall'attività del reporter luciferasi mediante un luminometro.In base alle istruzioni del produttore per la piastra dell'assay di attacco virale, aggiungere una volta 10 alla quarta cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti e incubare tutta la notte per consentire l'adesione cellulare. La mattina successiva, raffreddare innanzitutto la piastra a 96 pozzetti contenente il monocito cellulare a quattro gradi Celsius per un'ora.Preparare i composti di prova e la miscela di virus sul ghiaccio. Ad esempio, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V al 1% di DMSO o soluzioni di controllo positivo di Eparina HCV con 10 alla seconda FFU di virus. Per ogni trattamento, rimuovere delicatamente il mezzo dai pozzetti di coltura cellulare.Quindi aggiungere immediatamente 100 microlitri della miscela del composto in esame sul virus in pozzetti triplicati, avendo cura di non aumentare la temperatura. Incubare la piastra in un refrigeratore mantenuto a quattro gradi Celsius per tre ore. Le particelle virali si attaccheranno alla superficie cellulare a quattro gradi Celsius, ma non verranno internalizzate.Successivamente, aspirare i soprannatanti. Lavare delicatamente le cellule due volte con 200 microlitri di PBS freddo, aggiungere 100 microlitri di mezzo basale in ogni pozzetto e quindi incubare a 37 gradi Celsius per 72 ore.Infine, per quantificare il rilascio del reporter luciferasi dalle cellule infette, raccogliere il sopranatante da ogni pozzetto del campione ed eseguire il saggio di luciferasi gaussiano per valutare la fusione e l'ingresso virale. Raffreddare preventivamente la piastra per colture cellulari a quattro gradi Celsius per un'ora.Dopo l'incubazione notturna per l'adesione delle cellule, rimuovere il mezzo esistente dalle pozzette e infettare le cellule con 10 alla seconda F-F-U-H-C-V su ghiaccio. Incubare la piastra a quattro gradi Celsius per tre ore. Lavare delicatamente le cellule due volte con 200 microlitri di PBS freddo di ghiaccio per rimuovere il virus non adeso.Quindi, a ghiaccio, trattare le cellule con i composti in esame sciolti nel mezzo basale o nel mezzo basale con il 1% di DMSO come controllo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore. Questo consente di valutare l'effetto dei composti in esame sull'ingresso virale, che avviene a 37 gradi Celsius. Aspirare il mezzo e lavare due volte i virus non internalizzati con 200 microlitri di tampone citrato o PBS.Aggiungere 100 microlitri di mezzo basale per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per ulteriori 72 ore. Raccogliere il sopranatante ed eseguire il saggio Gaussian Luciferase come mostrato in precedenza per rilevare il reporter luciferasi rilasciato. Ecco gli effetti dei composti in prova sull'HCV. Nell'attivazione, il virus è stato incubato con i composti in prova per zero o tre ore prima dell'infezione.La percentuale di inibizione dell'infezione virale viene riportata per ogni trattamento. Il controllo negativo con DMSO non mostra alcuna inibizione. CHLA mostra un'elevata inibizione al contatto, dopo un'incubazione di zero ore, così come dopo un'incubazione più lunga di tre ore.Risultati aggiuntivi con un altro test. Il composto PUG è mostrato qui, adattando questo disegno sperimentale generale, CHLA e PUG sono dimostrati inibire ulteriormente l'infecciosità del citomegalovirus umano o HCMV nei fibroblasti polmonari embrionali. L'effetto di CHLA e PUG sull'attacco di HCV è mostrato qui.Ricordare che le cellule sono state incubate con il virus in presenza o assenza dei composti in esame a quattro gradi Celsius, quindi le cellule a cui era stato rimosso il virus non legato sono state incubate a 37 gradi Celsius per consentire l'infezione da parte del virus. Le barre ombreggiate mostrano l'effetto di C-H-L-A-P-U-G o dell'eparina sull'ingresso dell'HCV nelle cellule. Notare che, in questo caso, l'attacco virale è stato eseguito inizialmente a quattro gradi Celsius.Successivamente, dopo aver rimosso il virus non legato, le cellule sono state incubate con i composti in esame a 37 gradi Celsius per consentire l'ingresso virale. Analogamente, nel caso dell'HCMV, il trattamento di fibroblasti polmonari embrionali con CHLA o PUG mostra una forte inibizione dell'attacco virale e dell'ingresso virale. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di eseguire i passaggi alla temperatura indicata, poiché ciò influenzerà l'accuratezza dei risultati.

early-viral-entry-assays-for-identification-evaluation-antiviral

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra il test di inattivazione virale, mostrando la valutazione dell'impatto degli agenti antivirali sulle particelle virali.

Valutazione dell'efficacia di un composto di test antivirale attraverso un test di inattivazione virale

Questo video mostra un test di attaccamento virale per lo screening di composti antivirali. Utilizzando il virus dell'epatite C geneticamente modificato e la luciferasi, valuta gli effetti inibitori sull'attaccamento virale, come indicato dalla minore intensità della luce nei pozzetti co-trattati rispetto ai pozzetti trattati con il solo virus.

Un test di attacco virale per lo screening di composti antivirali

Questo video mostra un test per valutare agenti antivirali che mirano a fasi specifiche dell'ingresso virale nelle cellule ospiti e della fusione con l'endosoma. Le cellule vengono incubate a bassa temperatura e quindi infettate con l'HCV. La bassa temperatura consente il legame virale con le cellule ospiti, ma inibisce l'internalizzazione tramite endocitosi. Viene aggiunto il composto antivirale in esame e le cellule vengono incubate a temperatura fisiologica. Questo passaggio a una...

Un test per valutare l'effetto dei composti in esame sull'ingresso e la fusione virale nelle cellule ospiti

Questo video mostra il metodo per eseguire un test della placca utilizzando un virus ottenuto da cornea suina infetta. La cornea suina viene utilizzata per testare l'efficacia antivirale di farmaci sperimentali.

Determinazione dell'efficacia antivirale di farmaci sperimentali attraverso un test a placca

Tre saggi, tra cui l'effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d'azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione.

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

Saggi in vitro per misurare la replicazione del virus sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus a RNA ricombinanti esprimenti luciferasi o altri enzimi in grado di bioluminescenza. Qui i dettagli di una pipeline screening ad alto rendimento che unisce tali ceppi ricombinanti di morbillo e virus chikungunya per isolare antivirali ad ampio spettro di librerie chimiche.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

Qui si descrive la citotossicità cellulare e singoli saggi di infettività rotonde che consentono lo screening rapido e preciso dei composti di determinare la loro citotossicità cellulare (CC 50) e valori di IC 50 contro WT e resistente di HIV-1 farmaco.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Il primo passo nel ciclo di vita dell'arenavirus è l'attaccamento delle particelle virali alle cellule ospiti. Riportiamo un test quantitativo basato su (q)RT-PCR per il rilevamento e la quantificazione ultrasensibili degli eventi di attacco all'arenavirus.

Saggio altamente sensibile per la misura dell&#39;attaccamento Arenavirus-cell

L'obiettivo del protocollo è quello di illustrare i diversi saggi relativi all'ingresso virale che possono essere utilizzati per identificare gli inibitori di ingresso virale candidati.

Uso di saggi di ingresso virale e analisi di docking molecolare per l'identificazione di candidati antivirali contro il coxsackievirus A16

In questo lavoro, descriviamo i protocolli utilizzati nei saggi basati su enzimi replicon e virali per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika in un formato di screening ad alto rendimento.

Saggi antivirali ad alto rendimento per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika

Questo articolo descrive la metodologia per generare particelle pseudotipate di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema di segnalazione luciferasi e il suo impiego per identificare gli inibitori di ingresso. Questi protocolli sono dimostrati utilizzando due diversi inibitori di ingresso, una proteina di fusione umana ACE2-Fc ricombinante e il composto a piccole molecole arbidolo.

Procedure per l'identificazione degli inibitori dell'ingresso del SARS-CoV-2 come potenziali antivirali utilizzando pseudovirus basati su MLV

Scopri saggi di ingresso virale per identificare e valutare composti antivirali che inibiscono le fasi iniziali dell'infezione. Questo metodo utilizza saggi luciferasi per misurare l'infettività virale in vitro.

All'inizio virali ingresso saggi per l'identificazione e la valutazione di composti antivirali

Esplora altri video