All'inizio virali ingresso saggi per l'identificazione e la valutazione di composti antivirali

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare l'effetto antivirale di composti in esame contro specifici passaggi iniziali dell'ingresso virale. Questo viene raggiunto innanzitutto seminando le cellule ospiti per l'infezione virale. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire l'infezione virale e i trattamenti con i composti in esame in diversi momenti e a diverse temperature.

Successivamente, i campioni trattati con il farmaco vengono rimossi mediante lavaggio e le cellule vengono ricoperte con mezzo basale. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare le cellule. Infine, l'infecciosità virale viene analizzata per determinare l'influenza dei composti in esame sui primi stadi di entrata del virus durante l'infezione virale.

Ad esempio, un luminometro viene utilizzato per valutare l'attività della luciferasi nel lisato cellulare ottenuto dopo l'infezione da un virus reporter. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un approccio più basato sui meccanismi nell'identificazione di agenti antivirali, in particolare quelli che agiscono sull'ingresso virale. Per iniziare, preparare innanzitutto soluzioni stock dei composti da testare: acido triterpenico o CHLA e collagene punico o PUG in DMSO; sciogliere l'eparina come controllo positivo in acqua sterile doppiamente distillata; preparare quindi le cellule ospiti per la coltura necessaria al saggio.

Cellule di carcinoma epatico umano, HUH 7.5, coltivate durante la notte in DMEM fresco integrato con FBS e antibiotici. Ricordare di seguire le procedure del livello di sicurezza biologica due durante l'esperimento per testare la citotossicità dei composti in esame. Trattare le cellule con concentrazioni crescenti di CHLA o PUG da zero a 500 micromolar diluite nel mezzo basale, oppure con 1% DMSO come controllo negativo, quindi incubare le cellule per 72 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari.

Rimuovere il mezzo e lavare le cellule due volte con 200 microlitri di PBS. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di reagente per il saggio XT T e incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi utilizzare un lettore di microplacche per determinare l'assorbanza a 492 nanometri con una lunghezza d'onda di riferimento a 690 nanometri.

Calcolare la percentuale di vitalità utilizzando una formula specifica a partire da questi valori. Determinare le concentrazioni di citotossicità cellulare al 50% per ciascun composto. Iniziare il saggio di inattivazione virale.

Prima piastra, una volta 10 alla quarta cellule per pozzetto. In una piastra a 96 pozzetti, incubare le cellule a 37 °C con il 5% di anidride carbonica durante la notte per l'adesione prima dell'infezione. Preparare il virus dell'epatite C o particelle di HCV marcate con il reporter Gaia luciferasi come indicato nel protocollo del testo.

In un tubo sterile, mescolare 100 microlitri di CHLA 100 micromolare o PUG con 100 microlitri di 10 alla quarta unità formanti focolai o FFU di HCV per ottenere una miscela di controllo positivo. HCV con eparina a una concentrazione finale di 1000 microgrammi per millilitro.

Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo tre ore, diluire la miscela del composto virale di 50 volte con 9,8 millilitri di mezzo basale a temperatura ambiente. Quindi preparare una nuova miscela del composto virale e immediatamente diluire questa miscela in mezzo basale per il campione di incubazione allo zero ore.

Dopo aver rimosso il mezzo di incubazione dalle cellule, aggiungere 100 microlitri di soluzione del farmaco virale diluita per pozzetto in triplice replicazione. La soluzione contiene ora da 10 alla seconda FFU per pozzetto; incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre ore per consentire l'infezione virale delle cellule. Al termine dell'incubazione, rimuovere la sospensione virale dai pozzetti e lavare delicatamente le cellule con 200 microlitri di PBS, due volte.

Incubare le cellule in 100 microlitri di mezzo basale per 72 ore per consentire la replicazione virale e il rilascio del reporter luciferasi nel sopranatante. Successivamente, raccogliere il sopranatante dalle colture e dai microtubi e centrifugare a 17.000 × g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Per rimuovere i detriti cellulari, mescolare 20 microlitri di ciascun sopranatante con 50 microlitri di reagente per il saggio di luciferasi gaussiana e misurare la luminescenza derivante dall'attività del reporter luciferasi mediante un luminometro.

In base alle istruzioni del produttore per la piastra dell'assay di attacco virale, aggiungere una volta 10 alla quarta cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti e incubare tutta la notte per consentire l'adesione cellulare. La mattina successiva, raffreddare innanzitutto la piastra a 96 pozzetti contenente il monocito cellulare a quattro gradi Celsius per un'ora.

Preparare i composti di prova e la miscela di virus sul ghiaccio. Ad esempio, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V al 1% di DMSO o soluzioni di controllo positivo di Eparina HCV con 10 alla seconda FFU di virus. Per ogni trattamento, rimuovere delicatamente il mezzo dai pozzetti di coltura cellulare.

Quindi aggiungere immediatamente 100 microlitri della miscela del composto in esame sul virus in pozzetti triplicati, avendo cura di non aumentare la temperatura. Incubare la piastra in un refrigeratore mantenuto a quattro gradi Celsius per tre ore. Le particelle virali si attaccheranno alla superficie cellulare a quattro gradi Celsius, ma non verranno internalizzate.

Successivamente, aspirare i soprannatanti. Lavare delicatamente le cellule due volte con 200 microlitri di PBS freddo, aggiungere 100 microlitri di mezzo basale in ogni pozzetto e quindi incubare a 37 gradi Celsius per 72 ore.

Infine, per quantificare il rilascio del reporter luciferasi dalle cellule infette, raccogliere il sopranatante da ogni pozzetto del campione ed eseguire il saggio di luciferasi gaussiano per valutare la fusione e l'ingresso virale. Raffreddare preventivamente la piastra per colture cellulari a quattro gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione notturna per l'adesione delle cellule, rimuovere il mezzo esistente dalle pozzette e infettare le cellule con 10 alla seconda F-F-U-H-C-V su ghiaccio. Incubare la piastra a quattro gradi Celsius per tre ore. Lavare delicatamente le cellule due volte con 200 microlitri di PBS freddo di ghiaccio per rimuovere il virus non adeso.

Quindi, a ghiaccio, trattare le cellule con i composti in esame sciolti nel mezzo basale o nel mezzo basale con il 1% di DMSO come controllo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore. Questo consente di valutare l'effetto dei composti in esame sull'ingresso virale, che avviene a 37 gradi Celsius. Aspirare il mezzo e lavare due volte i virus non internalizzati con 200 microlitri di tampone citrato o PBS.

Aggiungere 100 microlitri di mezzo basale per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per ulteriori 72 ore. Raccogliere il sopranatante ed eseguire il saggio Gaussian Luciferase come mostrato in precedenza per rilevare il reporter luciferasi rilasciato. Ecco gli effetti dei composti in prova sull'HCV. Nell'attivazione, il virus è stato incubato con i composti in prova per zero o tre ore prima dell'infezione.

La percentuale di inibizione dell'infezione virale viene riportata per ogni trattamento. Il controllo negativo con DMSO non mostra alcuna inibizione. CHLA mostra un'elevata inibizione al contatto, dopo un'incubazione di zero ore, così come dopo un'incubazione più lunga di tre ore.

Risultati aggiuntivi con un altro test. Il composto PUG è mostrato qui, adattando questo disegno sperimentale generale, CHLA e PUG sono dimostrati inibire ulteriormente l'infecciosità del citomegalovirus umano o HCMV nei fibroblasti polmonari embrionali. L'effetto di CHLA e PUG sull'attacco di HCV è mostrato qui.

Ricordare che le cellule sono state incubate con il virus in presenza o assenza dei composti in esame a quattro gradi Celsius, quindi le cellule a cui era stato rimosso il virus non legato sono state incubate a 37 gradi Celsius per consentire l'infezione da parte del virus. Le barre ombreggiate mostrano l'effetto di C-H-L-A-P-U-G o dell'eparina sull'ingresso dell'HCV nelle cellule. Notare che, in questo caso, l'attacco virale è stato eseguito inizialmente a quattro gradi Celsius.

Successivamente, dopo aver rimosso il virus non legato, le cellule sono state incubate con i composti in esame a 37 gradi Celsius per consentire l'ingresso virale. Analogamente, nel caso dell'HCMV, il trattamento di fibroblasti polmonari embrionali con CHLA o PUG mostra una forte inibizione dell'attacco virale e dell'ingresso virale. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di eseguire i passaggi alla temperatura indicata, poiché ciò influenzerà l'accuratezza dei risultati.