All'inizio virali ingresso saggi per l'identificazione e la valutazione di composti antivirali

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare l'effetto antivirale dei composti in esame contro fasi specifiche dell'ingresso precoce del virus. Ciò si ottiene seminando prima le cellule ospiti per l'infezione virale. Il secondo passo consiste nell'eseguire l'infezione virale e i trattamenti con i composti in esame a tempi e temperature diverse.

Successivamente, gli inoculi trattati con il farmaco vengono lavati via e le cellule vengono ricoperte di terreno basale. Il passaggio finale consiste nell'incubare le cellule. In definitiva, l'infettività virale viene analizzata per determinare l'influenza dei composti in esame sulle prime fasi di ingresso virale dell'infezione virale.

Ad esempio, un luminometro viene utilizzato per valutare l'attività della luciferasi nella cellula da infezione da parte di un virus reporter. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può consentire un approccio più basato sui meccanismi nell'identificazione degli agenti antivirali, in particolare quelli che mirano all'ingresso virale. Per iniziare, per prima cosa, preparare le soluzioni madre dei composti in esame, acido trilogia o CHLA e collagene punico o PUG in DMSO che dissolvono l'eparina per un controllo positivo in acqua sterile a doppia distillazione per preparare le cellule ospiti per la coltura del saggio.

Epato carcinoma umano, HUH 7,5 cellule durante la notte in DMAM fresco integrato con FBS e antibiotici. Ricordarsi di seguire le procedure di livello due di biosicurezza durante l'esperimento per testare la citotossicità dei composti in esame. Trattare le cellule con concentrazioni crescenti di CHLA o PUG da zero a 500 micromolari diluiti in terreno basale, o 1% di DMSO come controllo negativo, quindi incubare le cellule per 72 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari.

Rimuovere il terreno e lavare due volte le cellule con 200 microlitri di PBS. Quindi, aggiungere 100 microlitri di reagente per il saggio XT T e incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi utilizzare un lettore di micropiastre per determinare l'assorbanza a 492 nanometri con una lunghezza d'onda di riferimento a 690 nanometri.

Calcola la percentuale di fattibilità con una data formula da questi valori. Determinare le concentrazioni di citotossicità cellulare del 50% per ciascun composto. Per iniziare il test di inattivazione virale.

Prima piastra, una volta 10 per la quarta cella per pozzetto. In una piastra a 96 pozzetti, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte per l'attaccamento per l'infezione. Prepara il reporter della luciferasi di Gaia etichettato con il virus dell'epatite C o le particelle HCV come indicato nel protocollo di testo.

In una provetta sterile mescolare 100 microlitri di CHLA o PUG 100 micromolari con 100 microlitri da 10 al quarto. Unità di formatura del fuoco o FFU di HCV per una miscela di controllo positivo. HCV con eparina a una concentrazione finale di 1000 microgrammi per millilitro.

Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo tre ore, diluire la miscela di composti virali 50 volte con 9,8 millilitri di terreno basale a temperatura ambiente. Quindi preparare una nuova miscela di composti virali e diluire immediatamente questa miscela in terreno basale per il campione di incubazione zero ore.

Dopo aver rimosso il terreno di incubazione dalle cellule, aggiungere 100 microlitri di soluzione virale diluita per pozzetto in triplicato. La soluzione contiene ora da 10 al secondo FFU per pozzetto incubare a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per tre ore per consentire l'infezione virale delle cellule. Dopo l'incubazione, rimuovere la sospensione virale dai pozzetti e lavare delicatamente le cellule con 200 microlitri di PBS. Due volte.

Incubare le cellule in 100 microlitri di terreno basale per 72 ore per la replicazione virale e il rilascio di luciferasi reporter nel surnatante. Quindi raccogliere il supernat dalle colture e dalle microprovette e centrifugare a 17.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Per rimuovere i detriti cellulari, mescolare 20 microlitri di ciascun supernat con 50 microlitri di reagente per il saggio della luciferasi gaussi e misurare la luminescenza dell'attività del reporter della luciferasi in un luminometro.

Secondo le istruzioni del produttore per la piastra del saggio di attacco virale, una volta 10 per la quarta cellula per pozzetto. In una piastra a 96 pozzetti e incubare per una notte per l'attacco delle cellule la mattina successiva. Per prima cosa, la piastra a 96 pozzetti contenente il monostrato di celle a quattro gradi Celsius per un'ora.

Preparare i composti in esame e la miscela virale con ghiaccio. Ad esempio, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1%DMSO o soluzioni di eparina HCV di controllo positivo con 10 al secondo virus FFU. Per ogni trattamento, aspirare bene il terreno dai pozzetti di coltura cellulare delicatamente.

Quindi aggiungere immediatamente 100 microlitri di miscela di composti per il test del virus in pozzetti in triplice foglio, facendo attenzione a non aumentare la temperatura. Incubare la piastra in frigorifero mantenuto a quattro gradi Celsius per tre ore. Le particelle virali si attaccheranno al servizio cellulare a quattro gradi Celsius, ma non saranno internalizzate.

Quindi, aspirare i surnatanti. Lavare delicatamente le celle due volte con 200 microlitri di ghiaccio freddo. PBS aggiunge 100 microlitri di terreno basale a ciascun pozzetto, quindi incuba a 37 gradi Celsius per 72 ore.

Infine, per quantificare il rilascio di luciferasi reporter dalle cellule infette. Raccogliere il supernat da ogni pozzetto del campione ed eseguire il saggio gaussiano della luciferasi per saggiare la fusione virale e l'ingresso. Pre-raffreddare la piastra di coltura cellulare a quattro gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione notturna per l'attacco delle cellule, rimuovere il terreno esistente dai pozzetti e infettare le cellule con 10 al secondo F-F-U-H-C-V su ghiaccio. Incubare la piastra a quattro gradi Celsius per tre ore. Lavare delicatamente le cellule due volte con 200 microlitri di PBS ghiacciato per rimuovere il virus non aderito all'AD.

Quindi, su ghiaccio, trattare le cellule con i composti in esame disciolti in terreno basale o terreno basale con l'1% di DMSO come controllo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore. Ciò consente la valutazione dei composti in esame all'ingresso virale, che avviene a 37 gradi Celsius. Aspirare il terreno e lavare due volte i virus non internalizzati con 200 microlitri di tampone citrato o PBS.

Aggiungere 100 microlitri di terreno basale per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per altre 72 ore. Raccogliere il supernat ed eseguire il test gaussiano della luciferasi come dimostrato in precedenza per rilevare il reporter della luciferasi rilasciata, mostrato Di seguito sono riportati gli effetti dei composti in esame sull'HCV. Durante l'attivazione, il virus è stato incubato con i composti in esame per zero o tre ore prima dell'infezione.

La percentuale di inibizione dell'infezione virale è tracciata per ciascun trattamento. Il DMSO controllato negativamente non mostra inibizione. CHLA mostra un'elevata inibizione al contatto, dopo l'incubazione a zero ore, così come dopo un'incubazione più lunga di tre ore.

Risultati aggiuntivi con un altro test. I composti PUG sono mostrati qui, adattando questo disegno sperimentale generale, CHLA e PUG hanno dimostrato di inibire ulteriormente l'infettività del citomegalovirus umano o HCMV nei fibroblasti polmonari embrionali. L'effetto di CHLA e PUG sull'attacco dell'HCV è mostrato qui.

Ricordiamo che le cellule sono state incubate con il virus in presenza o in assenza dei composti in esame a quattro gradi Celsius, e quindi rimuovendo le cellule virali non legate sono state incubate a 37 gradi Celsius per l'infezione da parte del virus. Le barre ombreggiate dimostrano l'effetto di C-H-L-A-P-U-G o eparina sull'ingresso dell'HCV nelle cellule. Si noti che in questo caso, l'attacco virale è stato effettuato per la prima volta a quattro gradi Celsius.

Quindi, dopo aver rimosso il virus non legato, le cellule sono state incubate con composti di prova a 37 gradi Celsius per l'ingresso virale. Allo stesso modo, nel caso dell'HCMV, il trattamento con CHLA o PUG per infezione da fibroblasti polmonari embrionali mostra una forte inibizione dell'attaccamento virale e dell'ingresso virale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire i passaggi alla temperatura indicata, che influenzerà l'accuratezza dei risultati.