Name: Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per lanalisi metabolica in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Scopri come isolare frazioni mitocondriali arricchite da Drosophila melanogaster per analisi metabolomiche. Questo metodo aumenta la sensibilità nella rilevazione di cambiamenti metabolici mitocondriali rispetto all'analisi dell'intero organismo.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione per lo sviluppo della facoltà dell'Università Adelphi e dalle sovvenzioni R15GM113156 da NIGMS assegnate a EVC, dalle sovvenzioni R01GM067862 da NIGMS e dalle sovvenzioni R01AG027849 da NIA assegnate a DMR.

1. I reagenti e soluzioni <ol><li> Preparazione di volare cibo e dei media <ol><li> Calore mosca gli ingredienti 11% di zucchero, 2% lievito Autolyzed, 5,2% farina di mais, agar 0,79% w / v in acqua in una piastra fissata a 90 ° C. Mescolare regolarmente fino ad ottenere una miscela omogenea leggermente densa. Preparare un volume finale di 550 ml di mosca cibo per un totale di 100 flaconcini con 5 ml volare alimentare in ogni. </li><li> Rimuovere dalla fonte di calore, agitare occasionalmente finché il cibo si raffredda a 80 ° C e aggiungere 0,2% tegosept-metil 4-idrossibenzoato disciolto in 95% di etanolo. </li><li> Dividere il cibo in due volumi uguali. Aggiungere 1,1 ml di 50 mM rapamicina sciolti in etanolo ad un volume e 1,1 ml di etanolo per l&#39;altro volume. Mescolare il le soluzioni di etanolo nel cibo e rapamicina. Assicurarsi che la temperatura scende a 50 ° C prima di aggiungere farmaci. </li></ol></li><li> Isolamento Buffer <ol><li> Preparare 500 ml di isolamento Buffer [225 mM Mannitolo, saccarosio 75 mm, 10 mM 3- (N &lt;/ em&gt; -morpholino) propanosulfonico (MOPS) e 1 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 2,5 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA)] in acqua. </li><li> Portare il pH a 7,2 utilizzando idrossido di sodio. Il pH iniziale sarà acida. </li><li> Utilizzare bottiglie di archiviazione filtro sterili con dimensione dei pori di 0,22 micron per sterilizzare soluzione e conservarlo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Tampone di lavaggio <ol><li> Preparare 500 ml di tampone di lavaggio [225 mM Mannitolo, saccarosio 75 mm, KCl 10 mm, 10 mM Tris HCl e 5 KH mM PO 2 4] in acqua. </li><li> Portare il pH a 7,2 utilizzando idrossido di sodio. Il pH iniziale sarà acida. </li><li> Utilizzare bottiglie di archiviazione filtro sterili con dimensione dei pori di 0,22 micron per sterilizzare soluzione e conservarlo a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Governo dei ceppi di Drosophila <ol><li> Per controllare la densità larvale durante lo sviluppo, inserire 25 coppie di genitori in una bottiglia cultura e di permettere loro di deporre le uova per 48 ore. </li> &lt;li&gt; Rimuovi genitori dopo 48 ore di regolare la densità di uova. </li><li> Ripetere i punti 2.1 e 2.2 con la prole F1 emergente, così due generazioni di questo controllo della densità è raggiunto. </li><li> Per raccogliere gli adulti, anestetizzare linea utilizzando l&#39;anidride carbonica (CO 2) e separati per sesso. <ol><li> Utilizzare un unico regolatore fase consegnato CO 2 pura da un serbatoio ad alta pressione in un flusso continuo di 5 psi. Per evitare l&#39;elettricità statica, utilizzare tubi di plastica per catalizzare la CO 2 in un matraccio da 500 ml di filtraggio con acqua. </li><li> Utilizzare un tappo di gomma con un foro per sigillare nel pallone. Utilizzare tubi di plastica per collegare l&#39;apertura laterale del pallone di un pad di CO 2. </li><li> Posizionare le mosche in tampone per non più di 10-15 minuti. Permette di recuperare da anestesia per 24 ore prima di metterli in condizioni sperimentali. </li></ol></li><li> Per generare abbastanza metaboliti frazioni arricchito mitocondriali, utilizzare 300 mosche per campione. Qui, utilizzare femmine, ma gender può differire in altri esperimenti. Trasferire 150 mosche per un 1 L demografia gabbia fatta in casa. Consentire l&#39;accesso a 5 ml di mosca alimentare in una fiala. </li><li> Trasferire i restanti 150 mosche in un altro 1 L gabbia. Non sovrappopolare gabbie con più di 150 mosche. </li><li> Utilizzare sei campioni replicati per ogni condizione sperimentale. Poiché estratti animali interi resa più metaboliti, di generare 1 campione di tutto l&#39;animale isolati, trasferire 50 femminile vola a una gabbia. Per quanto riguarda gli isolati mitocondriali, utilizzare sei campioni replicati per ogni condizione sperimentale. </li><li> Inserire gabbie a 25 ° C con ciclo di 12 ore di luce e 12 ore scuro. </li><li> Fornire cibo fresco ogni 2 o 3 giorni in una fiala con 5 ml di cibo per mantenere la qualità del cibo. </li><li> Mantenere mosche sul cibo per 10 giorni. Questo passo è necessario per il trattamento rapamicina 7. Altri trattamenti o condizioni saranno diverse. </li></ol> 3. Isolamento di mitocondriali Frazioni <ol><li> Dump vola da una gabbia (150 mosche) in unvetro-teflon Dounce omogeneizzatore riempita con 1 ml di tampone isolamento refrigerati. </li><li> Omogeneizzare spostando il pestello su e giù per 15 colpi. Tenere il mortaio su ghiaccio per mantenere intatto mitocondri. </li><li> Trasferimento omogenato in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Prendere il surnatante e centrifugare a 6000 xg per 10 min a 4 ° C per arricchire per mitocondri. </li><li> Come il surnatante contiene la frazione citosolica, scartare il surnatante o usarlo per esperimenti alternativi. Risospendere il pellet in 300 ml di tampone di lavaggio. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,5 per il secondo gabbia. Unire i pellet risospeso di entrambe le gabbie in una provetta criogenica. </li><li> Centrifugare a 6000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Scartare il surnatante e flash-congelare il pellet in azoto liquido. </li><li> Conservare le frazioni arricchite mitocondriali a -80 ° C o temperature inferiori. <ol><li> In alternativa, per tutta la pre animaleparazione, posizionare le adulti in una provetta criogenica. Flash-congelare la fiala in azoto e conservare adulti liquido a -80 ° C o la temperatura più bassa. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheffler%2C+IE+%22Mitochondria+%28Scheffler%2C+Mitochondria%29%22">Mitochondria (Scheffler, Mitochondria)</a>. , Wiley-Liss. 484(2007).</li>
<li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria--a+nexus+for+aging%2C+calorie+restriction%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li>
<li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology%3A+stress+signals+from+the+energy+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li>
<li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+evolution%2C+changes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li>
<li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+Meaning+of+Life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life</a>. 368, Oxford University Press. USA. (2006).</li>
<li>Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-nuclear+epistasis+affects+fitness+within+species+but+does+not+contribute+to+fixed+incompatibilities+between+species+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+international+journal+of+organic+evolution%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila.</a> Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).</li>
<li>Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+increases+mitochondrial+efficiency+by+mtDNA-dependent+reprogramming+of+mitochondrial+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila.</a> Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).</li>
<li>Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%C3%97G%C3%97E+for+Lifespan+in+Drosophila%3A+Mitochondrial%2C+Nuclear%2C+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).</li>
<li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254(2014).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer%3A+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li>
<li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi più critiche di questo protocollo sono: 1) l&#39;allevamento abbastanza mosche nello spazio abbondante. E &#39;molto importante non sovrappopolare gabbie demografia con più di 150 mosche ciascuna; 2) cambiare il cibo delle gabbie frequentemente per evitare la concorrenza cibo e stress nutrizionale; e 3) il mantenimento di tutti i campioni a 4 ° C per garantire l&#39;integrità durante l&#39;isolamento della frazione mitocondriale. Si raccomanda inoltre di raffreddare il buffer di isolamento, il tampone di lavaggi...

L&#39;obiettivo di questa procedura è quello di sviluppare le frazioni mitocondriali arricchito che producono sufficienti metaboliti mitocondriali per metabolomica studi che utilizzano Drosophila melanogaster. Nella nostra esperienza, la metabolomica analisi che utilizzano interi metodi di estrazione cellulari sono in grado di rilevare i cambiamenti sottili metaboliti mitocondriali in Drosophila. Tuttavia, frazionamento mitocondriale prima dell&#39;analisi metabolomica aumenta la sensibilità per identificare spostamenti metaboliti mitocondriali. I mitocondri sono organelli cellulari responsabili della fornitura del 90% dell&#39;energia che le cellule hanno bisogno per la normale funzione 1. Negli ultimi anni è stato riconosciuto che i mitocondri hanno un ruolo molto più dinamico in funzione cellulare e organismal che soltanto la produzione di adenosina trifosfato (ATP), e sono ora riconosciuti come hub per la regolazione del metabolismo omeostasi 2,3. I mitocondri sono il risultato di un processo in cui endosimbiontica dislignaggi microbiche stinti fuse ~ 1,5 miliardi di anni fa 4. Come si sono evoluti in veri mitocondri organelli, i geni della endosimbionte sono stati incorporati nel genoma nucleare emergente. Negli animali oggi, circa 1.500 proteine ​​mitocondriali sono codificate dal nucleo, mentre 37 geni rimangono nel mtDNA, 13 dei quali codificano proteine ​​mitocondriali che sono subunità dei complessi enzimatici della fosforilazione ossidativa 5. Coordinamento tra mitocondri e compartimenti nucleari è necessaria per mantenere una corretta funzione mitocondriale. Utilizzando i metodi descritti qui siamo stati in grado di rilevare i cambiamenti metabolici mitocondriali in Drosophila che derivano dalla manipolazione del coordinamento tra genomi mitocondriali e nucleari. Abbiamo utilizzato un ceppo di Drosophila in cui mtDNA dalle specie sorelle D. simulans è stato posto su un singolo D. melanogaster sfondo nucleare 6. Questo mitonuclear &#39;interrotto&#39;il genotipo è stato confrontato con il &#39;nativo&#39;, o co-evoluti genotipo mitonuclear di D. melanogaster portando lo stesso genoma nucleare con la sua nativa D. melanogaster mtDNA. Il D. melanogaster e D. simulans mtDNA differiscono di ~ 100 amminoacidi e&gt; 500 sostituzioni sinonime che influenzano mitonuclear 7,8 comunicazione. Abbiamo generato estratti mosca integrali e estratti arricchiti mitocondriali per studiare cambiamenti metabolici in risposta allo stress farmacologico. Qui mostriamo che quando si utilizza mitocondriali arricchito frazioni rileviamo cambiamenti pronunciati in metaboliti mitocondriali tra i nativi, genotipo co-evoluta portando la D. mtDNA melanogaster e il genotipo perturbato che trasportano D. simulans mtDNA. Al contrario, le modifiche dei metaboliti tra questi due genotipi sono sottili utilizzando normali metodi che utilizzano estratto intero volo. Pertanto, questo metodo ha fornito un percorso per capire come mtDNA mediare i cambiamenti mitocondriali inrisposta ai farmaci diversi.

<table><tbody><tr><td>0,2% tegosept-metil 4-idrossibenzoato</td><td>VWR</td><td>AAA14289</td><td></td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792799</td><td></td></tr><tr><td>mannitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) acido propansulfonico (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38057&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T-B7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi CO2 per anestetizzare le mosche</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>1 L gabbia</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999RD32</td><td></td></tr><tr><td>1 L gabbia coperchio</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999LRD</td><td></td></tr><tr><td>un omogeneizzatore di vetro-teflon dounce</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9661231</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>rapamicina&nbsp;</td><td>Laboratori LC&nbsp;</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>anti-porina</td><td>MitoSciences</td><td>MSA03</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa tubulina</td><td>Studi sullo sviluppo Banca dell'ibridoma</td><td>12G10</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi della proteina BCA Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>CO2 pad</td><td>Tritech Research, Inc</td> Pallone filtrante <td>MINJ-DROS-FP ENASCO</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SB08184M tappo</td> in <td></td> gomma enasco S08512M <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l&#39;analisi metabolica in<em&gt; drosophila</em

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Poiché i mitocondri svolgono un ruolo nel metabolismo degli aminoacidi, nel metabolismo dei carboidrati e nell'ossidazione degli acidi grassi, i difetti nella funzione mitocondriale spesso compromettono la vita di coloro che soffrono di queste malattie complesse. Rilevare i cambiamenti metabolici mitocondriali è fondamentale per la comprensione dei disturbi mitocondriali e delle risposte mitocondriali agli agenti farmacologici. Sebbene il metabolismo mitocondriale sia al centro della regolazione metabolica, l'individuazione di sottili cambiamenti nel metabolismo mitocondriale può essere ostacolata dalla sovrarappresentazione di altri metaboliti citosolici ottenuti utilizzando estrazioni di tutto l'organismo o dell'intero tessuto. 
Qui descriviamo un metodo di isolamento che ha rilevato cambiamenti metabolici mitocondriali pronunciati in Drosophila che erano distinti tra le preparazioni di mosca intera e quelle arricchite di mitocondriali. Per illustrare la sensibilità di questo metodo, abbiamo utilizzato una serie di Drosophila che ospitano DNA mitocondriali geneticamente diversi (mtDNA) e li abbiamo esposti al farmaco rapamicina. Utilizzando questo metodo abbiamo dimostrato che la rapamicina modifica il metabolismo mitocondriale in modo dipendente dal genotipo mitocondriale. Tuttavia, questi cambiamenti sono molto più distinti negli studi di metabolomica, quando i metaboliti sono stati estratti da frazioni arricchite di mitocondri. Al contrario, gli estratti di tessuto intero hanno rilevato solo cambiamenti metabolici mediati dal farmaco rapamicina indipendentemente dal mtDNA.

Utilizzando il protocollo spiegato in precedenza, abbiamo effettuato l&#39;analisi metabolomica sulle frazioni arricchito mitocondriali ed estratti di animali interi per testare l&#39;effetto del farmaco rapamicina sul mtDNA divergenti 7. Abbiamo consegnato 200 mM di rapamicina sciogliendo il farmaco nel cibo mosca. Le mosche sono stati esposti a rapamicina per 10 giorni. I metaboliti da estratti interi fly e da estratti mitocondriali sono stati ottenuti usando la spettro...

I mitocondri svolgono un ruolo centrale nella regolazione del metabolismo e dell'omeostasi. Sottili cambiamenti nel metabolismo mitocondriale che influenzano la fisiologia dell'organismo potrebbero essere difficili da rilevare negli studi di metabolomica dell'intero organismo. Qui descriviamo un metodo di isolamento che migliora il rilevamento di sottili cambiamenti metabolici in Drosophila melanogaster.

Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l&#39;analisi metabolica in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere frazioni mitocondriali arricchite che forniscono un quantitativo sufficiente di metaboliti mitocondriali per studi metabolomici utilizzando Drosophila melanogaster. Questo risultato si ottiene innanzitutto allevando un numero sufficiente di moscerini per generare una quantità adeguata di metaboliti per le frazioni arricchite in mitocondri. Come secondo passaggio, i moscerini vengono omogeneizzati in un omogeneizzatore in vetro e teflon tipo Dounce, che degrada la membrana cellulare senza compromettere l'integrità mitocondriale.In seguito, gli omogenati vengono sottoposti a centrifugazione differenziale al fine di ottenere campioni arricchiti in mitocondri. I risultati mostrano che, utilizzando questo protocollo, sono state rilevate significative alterazioni metaboliche mitocondriali che non erano state individuate mediante analisi metabolomiche effettuate su frazioni arricchite in mitocondri o su estratti di interi organismi. Il principale vantaggio di questo procedimento rispetto all'analisi metabolomica su interi insetti consiste nel fatto che l'isolamento dei mitocondri prima dell'analisi metabolomica consente una maggiore sensibilità e un rilevamento più accurato delle variazioni nei metaboliti mitocondriali.Per iniziare l'esperimento, riscaldare gli ingredienti del terreno di coltura per moscerini su una piastra riscaldante a 90 gradi Celsius. Mescolare regolarmente la miscela fino a quando non diventa omogenea e leggermente densa. Rimuovere il terreno di coltura dalla sorgente di calore e mescolarlo occasionalmente quando si raffredda fino a 80 gradi Celsius, quindi aggiungere il metil 4-idrossibenzoato TE allo 0,2% disciolto in etanolo al 95%. Successivamente, dividere il terreno di coltura in due volumi uguali.Assicurarsi che la temperatura del cibo sia diminuita a 50 gradi Celsius e aggiungere, mescolando, 1,1 millilitro di rapamicina 50 millimolare disciolta in etanolo in un volume e 1,1 millilitro di etanolo non trattato nel secondo volume. Per raccogliere gli adulti, utilizzare un regolatore a singolo stadio per erogare anidride carbonica pura da una bombola ad alta pressione. Con un flusso continuo di cinque PS, evitare l'elettricit&agrave; statica utilizzando un tubo di plastica per convogliare l'anidride carbonica in un pallone filtrante da 500 millilitri dotato di tubicino, in modo da far gorgogliare l'anidride carbonica attraverso l'acqua.A tale scopo, utilizzare un tappo di gomma con un foro per sigillare il matraccio. Collegare un tubo di plastica all'apertura laterale del matraccio e a un tampone di anidride carbonica per controllare la densità delle larve durante lo sviluppo. Introdurre 25 coppie di genitori in una bottiglia di coltura e lasciarle deporre le uova per 48 ore.Quindi rimuovere gli insetti adulti per regolare la densità delle uova e ripetere questi passaggi utilizzando la progenie F1 emergente per ottenere due generazioni di questo controllo della densità. Dopo due generazioni in condizioni di densità controllata, separare le mosche in base al sesso, posizionandole sul tampone per non più di 10-15 minuti. Lasciare che le mosche si riprendano dall'anestesia per 24 ore prima di collocarle in condizioni sperimentali.Assegnare 300 moscerini per campione per generare quantità sufficienti di metaboliti per le frazioni arricchite di mitocondri. Trasferire 150 moscerini in una gabbia fatta in casa da un litro. Successivamente, trasferire i rimanenti 150 moscerini in una gabbia separata da un litro e non sovraffollare le gabbie con più di 150 moscerini.Utilizzare sei campioni replicati per ogni condizione sperimentale e posizionare le gabbie a 25 gradi Celsius in un ciclo luce-buio di 12 ore per completare l'allevamento di drosophila. Fornire alle mosche cibo fresco ogni due o tre giorni in un vial con cinque millilitri di cibo per mantenere la qualità del cibo per un totale di 10 giorni. Iniziare l'isolamento versando le mosche da una gabbia in un omogeneizzatore in vetro e teflon riempito con un millilitro di buffer di isolamento freddo.Successivamente, posizionare un po' di mortaio su ghiaccio per mantenere intatti i mitocondri e omogeneizzare le mosche con 15 movimenti. Avendo cura di non ruotare il pestello, trasferire l'omogenato in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare la provetta a 300 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il soprannatante in una provetta diversa e centrifugare il soprannatante a 6.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per arricchire i mitocondri.Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante contenente la frazione citosolica. Risospendere il pellet in 300 microlitri di buffer di lavaggio mediante pipettaggio su e gi&ugrave;. Ripetere delicatamente i passaggi precedenti per il secondo giroscopio della seconda gabbia.Quindi combinare i pellet risospesi di entrambe le gabbie in un tubo criogenico per microcentrifuga e centrifugare i pellet combinati a 6.000 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il soprannatante e congelare rapidamente il pellet in azoto liquido. Infine, conservare le frazioni arricchite in mitocondri a meno 80 gradi Celsius.Questo immunoblotting mostra un arricchimento della proteina del trasporto della membrana mitocondriale poin, che funge da indicatore della separazione efficace dei mitocondri nelle frazioni mitocondriali. La proteina poin è non rilevabile nelle frazioni citosoliche, mentre la proteina tubulina, una proteina citosolica dei microtubuli, non viene rilevata nella frazione mitocondriale, dimostrando una minima contaminazione da proteine citosoliche. Le analisi delle componenti principali (PCA) sono state generate utilizzando i valori ottenuti dall'analisi in spettrometria di massa, normalizzati rispetto alla concentrazione proteica di Bradford, trasformati in logaritmo e imputati con i valori minimi osservati per ciascun composto.I grafici PCA sono stati generati utilizzando il metabolita completo. I profili di ceppi nativi e alterati di moscerini, ottenuti con un estratto standard di moscerino intero, possono essere confrontati con un grafico PCA dei metaboliti presenti in estratti arricchiti per mitocondri; i profili metabolici di moscerini interi si separano lungo l'asse PC2 e riflettono gli effetti principali del trattamento con rapamicina. Le differenze tra i diversi genotipi di mtDNA sono solo lievi.Al contrario, i profili metabolici ottenuti da estratti arricchiti in mitocondri mostrano una separazione tra il genotipo nativo di mtDNA su cibo normale e gli altri tre campioni, il mtDNA nativo con rapamicina e il mtDNA alternativo sia su cibo normale che con rapamicina. Ciò implica che l'effetto del mtDNA alternativo modifica i profili metabolici in modo analogo agli effetti del trattamento con rapamicina. Durante l'esecuzione di questo protocollo, è importante e si raccomanda di eseguire tutte le replicazioni nello stesso giorno, per ridurre la variabilità tra i replicati.Consiglio di preparare un piano in anticipo e di etichettare le provette, tenendo traccia dei tempi di attesa tra i replicati per migliorare la qualità della preparazione del campione.

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Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Questa procedura illustra come isolare dal cervello di topo adulto i mitocondri associate membrane ER o MAMS e glicosfingolipidi-arricchiti frazioni microdomini di MAMs e preparati mitocondriali.

I mitocondri associati Membrane ER (MAMs) e glicosfingolipidi microdomini arricchiti (GEM): Isolamento dal cervello di topo

L'analisi della relazione struttura-funzione mitocondriale è necessaria per una comprensione approfondita dei meccanismi regolatori della funzionalità mitocondriale. In questo articolo sono descritti e dimostrati metodi specifici per lo studio della struttura e della funzione mitocondriale nelle ovaie di Drosophila vive e fisse.

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in Drosophila ovaie

In questo protocollo, dimostriamo l'applicazione della tomografia elettronica di serie-sezione per delucidare la struttura mitocondriale nel muscolo di Drosophila voli indiretti.

3D ultrastruttura mitocondriale del muscolo di voli indiretti di Drosophila ha rivelato tramite tomografia dell'elettrone Serial-sezione

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

Questo protocollo descrive come preparare larve di Drosophila per analisi metabolomica basati su GC-MS.

Preparazione di campioni larvale della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del Gas (GC-MS)-base di metabolomica

Vi presentiamo un protocollo per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare nei cervelli di larve e adulti di Drosophila melanogaster . Un analizzatore metabolico è utilizzato con un protocollo adattato e ottimizzato. Vincoli di micro-tessuto sono una componente fondamentale del presente protocollo e progettate e create appositamente per il loro uso in questa analisi.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

Nonostante i recenti progressi, molte proteine mitocondriali del lievito rimangono ancora con le loro funzioni completamente sconosciute. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine, che è stato fondamentale per la delucidazione delle loro funzioni molecolari.

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Qui presentiamo un protocollo di respirometria ad alta risoluzione per analizzare la bioenergetica nei moscerini della frutta mutanti PINK1B9-null. Il metodo utilizza il protocollo SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

Scopri come isolare frazioni mitocondriali arricchite da Drosophila melanogaster per analisi metabolomiche. Questo metodo aumenta la sensibilità nella rilevazione di cambiamenti metabolici mitocondriali rispetto all'analisi dell'intero organismo.

Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l'analisi metabolica in

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