Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l'analisi metabolica in

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere frazioni mitocondriali arricchite che forniscono un quantitativo sufficiente di metaboliti mitocondriali per studi metabolomici utilizzando Drosophila melanogaster. Questo risultato si ottiene innanzitutto allevando un numero sufficiente di moscerini per generare una quantità adeguata di metaboliti per le frazioni arricchite in mitocondri. Come secondo passaggio, i moscerini vengono omogeneizzati in un omogeneizzatore in vetro e teflon tipo Dounce, che degrada la membrana cellulare senza compromettere l'integrità mitocondriale.

In seguito, gli omogenati vengono sottoposti a centrifugazione differenziale al fine di ottenere campioni arricchiti in mitocondri. I risultati mostrano che, utilizzando questo protocollo, sono state rilevate significative alterazioni metaboliche mitocondriali che non erano state individuate mediante analisi metabolomiche effettuate su frazioni arricchite in mitocondri o su estratti di interi organismi. Il principale vantaggio di questo procedimento rispetto all'analisi metabolomica su interi insetti consiste nel fatto che l'isolamento dei mitocondri prima dell'analisi metabolomica consente una maggiore sensibilità e un rilevamento più accurato delle variazioni nei metaboliti mitocondriali.

Per iniziare l'esperimento, riscaldare gli ingredienti del terreno di coltura per moscerini su una piastra riscaldante a 90 gradi Celsius. Mescolare regolarmente la miscela fino a quando non diventa omogenea e leggermente densa. Rimuovere il terreno di coltura dalla sorgente di calore e mescolarlo occasionalmente quando si raffredda fino a 80 gradi Celsius, quindi aggiungere il metil 4-idrossibenzoato TE allo 0,2% disciolto in etanolo al 95%. Successivamente, dividere il terreno di coltura in due volumi uguali.

Assicurarsi che la temperatura del cibo sia diminuita a 50 gradi Celsius e aggiungere, mescolando, 1,1 millilitro di rapamicina 50 millimolare disciolta in etanolo in un volume e 1,1 millilitro di etanolo non trattato nel secondo volume. Per raccogliere gli adulti, utilizzare un regolatore a singolo stadio per erogare anidride carbonica pura da una bombola ad alta pressione. Con un flusso continuo di cinque PS, evitare l'elettricità statica utilizzando un tubo di plastica per convogliare l'anidride carbonica in un pallone filtrante da 500 millilitri dotato di tubicino, in modo da far gorgogliare l'anidride carbonica attraverso l'acqua.

A tale scopo, utilizzare un tappo di gomma con un foro per sigillare il matraccio. Collegare un tubo di plastica all'apertura laterale del matraccio e a un tampone di anidride carbonica per controllare la densità delle larve durante lo sviluppo. Introdurre 25 coppie di genitori in una bottiglia di coltura e lasciarle deporre le uova per 48 ore.

Quindi rimuovere gli insetti adulti per regolare la densità delle uova e ripetere questi passaggi utilizzando la progenie F1 emergente per ottenere due generazioni di questo controllo della densità. Dopo due generazioni in condizioni di densità controllata, separare le mosche in base al sesso, posizionandole sul tampone per non più di 10-15 minuti. Lasciare che le mosche si riprendano dall'anestesia per 24 ore prima di collocarle in condizioni sperimentali.

Assegnare 300 moscerini per campione per generare quantità sufficienti di metaboliti per le frazioni arricchite di mitocondri. Trasferire 150 moscerini in una gabbia fatta in casa da un litro. Successivamente, trasferire i rimanenti 150 moscerini in una gabbia separata da un litro e non sovraffollare le gabbie con più di 150 moscerini.

Utilizzare sei campioni replicati per ogni condizione sperimentale e posizionare le gabbie a 25 gradi Celsius in un ciclo luce-buio di 12 ore per completare l'allevamento di drosophila. Fornire alle mosche cibo fresco ogni due o tre giorni in un vial con cinque millilitri di cibo per mantenere la qualità del cibo per un totale di 10 giorni. Iniziare l'isolamento versando le mosche da una gabbia in un omogeneizzatore in vetro e teflon riempito con un millilitro di buffer di isolamento freddo.

Successivamente, posizionare un po' di mortaio su ghiaccio per mantenere intatti i mitocondri e omogeneizzare le mosche con 15 movimenti. Avendo cura di non ruotare il pestello, trasferire l'omogenato in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare la provetta a 300 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il soprannatante in una provetta diversa e centrifugare il soprannatante a 6.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per arricchire i mitocondri.

Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante contenente la frazione citosolica. Risospendere il pellet in 300 microlitri di buffer di lavaggio mediante pipettaggio su e giù. Ripetere delicatamente i passaggi precedenti per il secondo giroscopio della seconda gabbia.

Quindi combinare i pellet risospesi di entrambe le gabbie in un tubo criogenico per microcentrifuga e centrifugare i pellet combinati a 6.000 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il soprannatante e congelare rapidamente il pellet in azoto liquido. Infine, conservare le frazioni arricchite in mitocondri a meno 80 gradi Celsius.

Questo immunoblotting mostra un arricchimento della proteina del trasporto della membrana mitocondriale poin, che funge da indicatore della separazione efficace dei mitocondri nelle frazioni mitocondriali. La proteina poin è non rilevabile nelle frazioni citosoliche, mentre la proteina tubulina, una proteina citosolica dei microtubuli, non viene rilevata nella frazione mitocondriale, dimostrando una minima contaminazione da proteine citosoliche. Le analisi delle componenti principali (PCA) sono state generate utilizzando i valori ottenuti dall'analisi in spettrometria di massa, normalizzati rispetto alla concentrazione proteica di Bradford, trasformati in logaritmo e imputati con i valori minimi osservati per ciascun composto.

I grafici PCA sono stati generati utilizzando il metabolita completo. I profili di ceppi nativi e alterati di moscerini, ottenuti con un estratto standard di moscerino intero, possono essere confrontati con un grafico PCA dei metaboliti presenti in estratti arricchiti per mitocondri; i profili metabolici di moscerini interi si separano lungo l'asse PC2 e riflettono gli effetti principali del trattamento con rapamicina. Le differenze tra i diversi genotipi di mtDNA sono solo lievi.

Al contrario, i profili metabolici ottenuti da estratti arricchiti in mitocondri mostrano una separazione tra il genotipo nativo di mtDNA su cibo normale e gli altri tre campioni, il mtDNA nativo con rapamicina e il mtDNA alternativo sia su cibo normale che con rapamicina. Ciò implica che l'effetto del mtDNA alternativo modifica i profili metabolici in modo analogo agli effetti del trattamento con rapamicina. Durante l'esecuzione di questo protocollo, è importante e si raccomanda di eseguire tutte le replicazioni nello stesso giorno, per ridurre la variabilità tra i replicati.

Consiglio di preparare un piano in anticipo e di etichettare le provette, tenendo traccia dei tempi di attesa tra i replicati per migliorare la qualità della preparazione del campione.