Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

L'obiettivo generale di questa tecnica di microscopia è quello di visualizzare le interazioni tra proteine e proteine su scala singola molecolare e nanometrica. Quindi questo metodo può aiutarci a rispondere ad alcune domande chiave nel campo della biologia, come le interazioni molecolari nei processi di segnalazione oncogenica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è sensibile, specifica e offre risoluzioni di singole molecole e nanometri.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Tahan, un ricercatore senior associato nel mio laboratorio: dopo la clonazione di RA e RAF, R-B-D-P-A-M, si frammenta la ciliegia in particelle virali e infetta le cellule U2 OS secondo il protocollo di testo. Per preparare un campione per la piastra di imaging, circa 5,5 volte 10 alla quarta cellula di espressione stabile per pozzetto di una camera con fondo in vetro a otto pozzetti, scivolare in 350 microlitri di DMEM privo di rosso fenolo. Utilizzare paraldeide fresca con glutaraldeide per fissare le cellule e dopo aver sostituito il fissativo con PBS o tampone di imaging vortex 100 nanometri particelle d'oro e aggiungere 35 microlitri per pozzetto per tracciare la deriva dello stadio durante l'imaging.

Avvicinarsi al microscopio e accendere i laser a 405 e 561 nanometri mantenendo gli otturatori chiusi a questo punto, assicurarsi che lo specchio dicroico a 561 nanometri e il filtro notch siano in posizione. Aprire il software di acquisizione delle immagini. Accendere la fotocamera E-M-C-C-D e lasciarla raffreddare e impostare il tempo di esposizione su 100 millisecondi e il guadagno E-M-C-C-D su un valore appropriato.

Aggiungere olio da immersione all'obiettivo e fissare il campione sul tavolino del microscopio. Successivamente, con il campo chiaro o con il laser a 561 nanometri, metti a fuoco il campione per l'imaging di RA e altre proteine di membrana. Utilizzare un obiettivo per tappeti erbosi con cromatico APO 60 x con un'apertura numerica di 1,49 e portare il microscopio in configurazione per tappeti erbosi.

Regolare il laser di eccitazione in modo che sia decentrato quando si colpisce l'apertura posteriore dell'obiettivo per tappeti erbosi, il che causerà la deflessione del laser quando raggiunge il tampone del vetrino coprioggetti sulla faccia. Continuare a regolare la posizione di incidenza del laser fino a quando non viene raggiunto l'angolo critico e il laser viene riflesso indietro. Cerca una cella da visualizzare con diverse particelle d'oro in vista.

Quindi impostare una regione di interesse che racchiuda la cellula o una regione di essa e le particelle d'oro nel caso in cui si stia già verificando un'attivazione sufficiente a causa di alti livelli di espressione. Inizia l'acquisizione con il laser a 405 nanometri spento e il laser 561 acceso. In caso contrario, accendere il laser a 405 nanometri alla potenza di fabbrica più bassa e aumentarlo gradualmente fino a quando non ci sono decine di molecole per fotogramma o in modo che le singole molecole siano ben separate.

Man mano che l'acquisizione dei dati continua, aumentare gradualmente la potenza del laser a 405 nanometri per mantenere la densità dello spot approssimativamente costante. Continuare l'acquisizione dell'immagine fino a quando non è alta 4 0 5. Il potere non inizia più.

Gli eventi di attivazione terminano per elaborare le immagini. Scarica il software di elaborazione delle immagini. Aprire MATLAB e caricare il software di lettura WFI.

Visualizza la sequenza di immagini grezze e determina l'area di interesse o ROI, seleziona l'area della pila da elaborare facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinando una casella attorno all'area desiderata. Se la regione di interesse non è stata ridotta durante l'acquisizione, selezionare un'area più piccola per ridurre il tempo di calcolo per deselezionare un'area ed elaborare l'intero fotogramma Fare clic con il pulsante destro del mouse in un punto qualsiasi dell'immagine accanto per definire una serie di marcatori fiduciari come le nanoparticelle d'oro assorbite sul vetrino coprioggetto che sono ben isolate, uniformi e di forma e presenti nel campo visivo in tutta la pila di immagini. Inizia selezionando una particella d'oro candidata facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sulla sua immagine e trascinando una piccola casella attorno ad essa.

In Tracciamento particelle, fare clic sul pulsante Traccia. Apparirà un grafico che mostra la posizione della particella d'oro selezionata attraverso la pila di immagini che descrivono l'entità della deriva. Ripeti questo processo per tenere traccia del maggior numero possibile di particelle d'oro e determinare le particelle che si tracciano insieme. Idealmente.

La deriva complessiva è della magnitudine di 0,1 pixel al massimo, uno alla volta. Seleziona le particelle d'oro che sono state tracciate insieme e sotto il tracciamento delle particelle. Fare clic sul pulsante Aggiungi marcatore.

Apparirà una croce verde a significare che la particella è stata aggiunta come marcatore e verrà utilizzata per correggere la deriva. Regolare l'intervallo sigma, l'intervallo di livellamento e la soglia secondo necessità modificando leggermente il valore. Fare clic sul pulsante Trova particella per testare le impostazioni e ispezionare visivamente le particelle di processo, come la ciliegia PAM, le molecole che sono relativamente rotonde e luminose verranno inscatolate e quelle che non lo sono verranno lasciate fuori.

Per avviare l'elaborazione delle immagini, fare clic sul pulsante Crea file cavo e salvare il file con il nome desiderato per post-elaborare le immagini e renderizzare l'immagine del palmo. Avvia il pacchetto palm in MATLAB, carica il file dot core appena creato. Un'immagine di cui è stato eseguito il rendering viene visualizzata nella casella dell'immagine accanto ai pulsanti di controllo.

Ordina le singole coordinate utilizzando i seguenti valori tipici. Per PAM Cherry uno, la combinazione di fotogrammi equivale a otto. La combinazione della distanza in nanometri equivale a 100 RMS minimo uguale a quattro.

La bontà di adattamento minima è pari a 0,25 e l'eccentricità massima è pari a 1,4. Fai clic sul pulsante di ordinamento per generare un nuovo set di coordinate curate pronte per il rendering di immagini ad alta risoluzione. Immettere i valori per il rendering corretto dell'immagine finale, ad esempio la dimensione in pixel non elaborata determinata in precedenza, la dimensione della funzione desiderata nell'immagine di rendering, che in genere viene impostata su un valore leggermente superiore alla localizzazione media e la dimensione in pixel, ad esempio 10 nanometri.

Per l'immagine renderizzata, fare clic sul pulsante di rendering per generare l'immagine del palmo. Quindi utilizzare le icone di ingrandimento più e meno nella barra degli strumenti della finestra della figura per ingrandire e rimpicciolire per tracciare singole molecole nelle cellule vive. Trattare la superficie di coltura tissutale e piastrare le cellule come descritto in precedenza in questo video.

Assicurarsi che il vetro di copertura abbia lo spessore appropriato per la microscopia impostata Dopo aver sezionato le cellule ed eseguito tutti i trattamenti e le incubazioni necessarie per l'esperimento, posizionare il piatto di coltura su un incubatore sul palco. Lasciare riposare il piatto sul tavolino per alcuni minuti fino a quando la temperatura e la concentrazione di CO2 non si stabilizzano in questa fase. Blocca i laser.

Se il controllo della CO2 non è disponibile, passare a un mezzo indipendente dalla CO2 subito prima dell'imaging, come l'L 15 di leibovitz per deprimere la fluorescenza di fondo, infine acquisire le immagini come dimostrato in precedenza, impostando un tempo di esposizione appropriato per garantire un buon rapporto segnale/rumore senza perdere la risoluzione temporale. Il palmo BFC in questa figura è il mutante KRAS G 12 D che interagisce con il dominio di legame RA o RBD di CRAF. Ciascuna delle quattro combinazioni mostrate qui è stata introdotta in cellule OS U2 utilizzando cellule di infezione lentivirale con due delle configurazioni che avevano forti segnali BFC positivi, come identificato dal brusco aumento della fluorescenza quando il laser a 405 nanometri è stato acceso a causa della fotoattivazione di PAM Cherry ricostituito BFC, come dimostrato qui utilizzando le stesse impostazioni sperimentali del PAM Cherry genitore.

Un forte segnale BFC è stato generato dopo l'infezione con RN R e RAF RBD RC. Qui, RN e RC denotano rispettivamente il frammento terminale n e C di PAM Cherry quando vengono ingrandite le singole molecole e la loro distribuzione spaziale su scala nanometrica può essere chiaramente vista in questo esperimento in cui è stato eseguito il tracciamento di singole molecole per acquisire le traiettorie di diffusione dei singoli RA. Complessi RAF RBD in illuminazione continua con laser a 561 nanometri e 405 nanometri. Individuale PA m ciliegia una molecola st.

Accendi e dura alcuni fotogrammi prima di entrare negli stati oscuri in cui sono stati trovati immobili o mobili. Questo grafico di registrazioni per più molecole illustra chiaramente entrambi i tipi di traiettorie. La stessa distribuzione eterogenea degli stati di diffusione può essere dedotta dall'istogramma dello spostamento delle molecole tra fotogrammi successivi Mass mastered.

Questa tecnica può essere eseguita in una o tre settimane, a seconda che i costrutti siano trascendentali, trasfettati o costantemente oppressi se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare controlli come Putin mutanti che mancano dell'interazione che segue questa procedura. Altri metodi, come l'analisi dei cluster, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come sono organizzate spazialmente le interazioni proteiche nella cellula?

Per il tracciamento delle cellule di laboratorio, la base valutativa, il tracciamento di singole particelle può essere eseguito per determinare gli stati di diffusione e le probabilità di transizione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica viene utilizzata nel nostro laboratorio nel campo della biologia del cancro per esplorare le interazioni dell'unità RA e l'omo e l'izzazione dei recettori della sua famiglia nelle cellule tumorali umane. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e implementare una biopsia del palmo della mano per studiare un'interazione proteica di interesse.

Non dimenticare che lavorare con l'antivirus e le cellule tumorali può essere estremamente pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come i protocolli standard di biosicurezza.