Name: Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Scopri la tecnica BiFC-PALM per visualizzare le interazioni proteiche Ras-Raf a scala nanometrica nelle cellule U2OS. Questo metodo avanzato consente di studiare i processi di segnalazione oncogenica con risoluzione a singola molecola.

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Gli autori ringraziano i dottori Steven Chu e Joe W. Gray per le utili discussioni, Henry Marr per il suo lavoro iniziale sul progetto BiFC-PALM e Alexis Shoemaker per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è supportato da fondi di avvio a X.N. da OHSU. La ricerca nel laboratorio Nan è stata supportata anche dal NIH 5U54CA143836-05, dalla Damon Runyon Cancer Research Foundation, dal MJ Murdock Charitable Trust e dalla società FEI.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

BiFC è una tecnica comunemente usata per il rilevamento e la visualizzazione PPI nelle cellule, mentre PALM è una recente tecnica di microscopia molecola SuperResolution unico che permette l&#39;imaging su nanoscala di campioni biologici intatti. La combinazione di BiFC con PALM raggiunto l&#39;imaging selettivo di PPI all&#39;interno di una cella con nanometrica risoluzione spaziale e sensibilità singola molecola. BiFC-PALM estende l&#39;utilità di entrambe le tecniche, e come dimostrato in questo lavoro, mostra una gr...

Interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la biologia 1 e sono strettamente regolati attraverso meccanismi spazio-temporali attraverso molte tempo e lunghezza scale. Gli studi sulla segnalazione cellulare sulla membrana cellulare, ad esempio, hanno rivelato dinamici, scompartimenti spaziali nanoscala che facilitano PPI specifici e processi cellulari 2. Quindi, la capacità di sondare PPI nei sistemi biologici con risoluzioni sufficienti spaziali e temporali, alta specificità e sensibilità elevata è la chiave per raggiungere una comprensione meccanicistica della biologia. Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) è uno dei pochi strumenti esistenti per la visualizzazione PPI in una cella con una risoluzione subcellulare e compatibilità live-cell 3-5. La tecnica è relativamente semplice e comporta frazionamento di una proteina fluorescente in due frammenti non fluorescenti; quando geneticamente etichettati per due proteine ​​che interagiscono eportato in prossimità, i frammenti possono ricostituire per formare una proteina fluorescente completo, producendo segnale fluorescente. Se correttamente progettato, le sonde BiFC non dovrebbero ricostituire spontaneamente, in assenza di PPI. Come tale, il segnale di fluorescenza in un saggio BiFC sorgerà solo in presenza degli IPP, che consente la visualizzazione diretta degli IPP con elevata specificità. Ulteriori vantaggi di utilizzare la fluorescenza come la lettura sono alta sensibilità, risoluzione subcellulare, e compatibilità con l&#39;alta produttività e alta test di screening di contenuti, tra gli altri. Per queste prestazioni, sono stati sviluppati una serie di sonde BiFC a base di proteine ​​fluorescenti genitore differenti. Come in tutte le altre tecniche di rilevazione basate sulla microscopia luce convenzionale, tuttavia, la risoluzione spaziale di BiFC è limitata a ~ 250 nm dalla diffrazione della luce. Questo lo rende una sfida per studiare la regolazione di PPI su scala nanometrica, che, come accennato in precedenza e esemplificato da un raft lipidici 6nd nanocluster Ras 7, è una scala di lunghezza fondamentale per comprendere molti processi cellulari, come la segnalazione. BiFC è stato combinato con la microscopia localizzazione fotoattivato (PALM) 8,9 per superare questo limite a risoluzione spaziale per l&#39;imaging PPI 10. PALM è una recente tecnica di microscopia Super Risoluzione che aggira il limite di diffrazione di imaging di fluorescenza attraverso l&#39;attivazione stocastico e localizzazione subdiffractive di molecole fluorescenti singoli. In ogni ciclo di attivazione, una molecola fluorescente emette poche centinaia a qualche migliaio di fotoni e dà luogo ad una singola immagine Molecola sul rivelatore. Mentre l&#39;immagine è diffrazione limitata (~ 250 nm in larghezza), il suo baricentro può essere determinata con precisione molto maggiore, tipicamente dell&#39;ordine di 10-50 nm in funzione del numero di fotoni rilevati. Attivando e localizzare ogni molecola fluorescente del campione, una immagine ad alta risoluzione può essere ricostruita. Performed su cellule viventi, singola molecola tracking (all&#39;SMT) PALM ulteriori permessi acquisizione di migliaia di traiettorie di diffusione proteine ​​da una singola cella 11. È importante sottolineare che, PALM utilizza sonde fluorescenti specializzati come proteine ​​fluorescenti fotoattivabile (PA-PQ) per ottenere l&#39;attivazione stocastico. Dal momento che sia BiFC e proteine ​​fluorescenti uso PALM, sono stati combinati dividendo PAmCherry1, un comunemente usato PA-FP per PALM, in due frammenti tra aminoacidi 159 e 160. Il sistema basato su PAmCherry1 BiFC scissione mostra basso segnale di fondo da ricostituzione spontanea dei due frammenti. Quando geneticamente etichettato ad una coppia di proteine ​​interagenti, i due frammenti (RN = residui 1-159; RC = Met + residui 160-236) ricostituito in modo efficiente per formare le proteine ​​complete PAmCherry1 anche a 37 ° C e senza incubazione a temperature più basse, che non è il caso per altre coppie BiFC 12, come il genitore mCherry 13. Furthermore, la proteina PAmCherry1 ricostituito mantenuto le proprietà fotofisiche del PAmCherry1 genitore, come l&#39;elevato rapporto di contrasto, resa fotoni media, e fotoattivazione veloce, tra gli altri, che sono fondamentali per la localizzazione precisa di singola molecola e immagini ad alta risoluzione PALM. In questo protocollo, l&#39;uso di BiFC-PALM per l&#39;imaging interazioni Ras-Raf in cellule U2OS utilizzando PAmCherry1 split (Figura 1A) è descritta. Il primo passo è quello di progettare i costrutti per l&#39;espressione di proteine ​​di fusione tra i frammenti PAmCherry1 (cioè, RN e RC) e le proteine ​​di interesse. In teoria, per ogni coppia di proteine ​​candidati (A e B), vi sono otto coppie di proteine ​​di fusione da testare: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; e A-RC / B-RN. Spesso il processo può essere semplificato tenendo conto delle proprietà strutturali o biochimiche delle proteine ​​candidate. Nel caso di Ras, la proteina èpost-traduzionale modificato nella casella CAAX C-terminale (C = Cys; A = alifatici; X = qualsiasi), dopo di che il motivo AAX viene aperto fuori. Quindi, RN o RC possono essere fuse solo al N-terminale di Ras; Questo riduce il numero di coppie di proteine ​​di fusione di quattro (Figura 1B). Per Raf, dominio Ras vincolanti (RBD; residui 51-131) viene utilizzato e possono essere contrassegnati su entrambe le estremità. Sono stati generati Queste quattro configurazioni di fusione: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; e RC-KRAS / Raf RBD-RN. Inoltre, il linker tra i frammenti e le proteine ​​di interesse deve essere considerato. Un linker flessibile di circa dieci amminoacidi è spesso usato in quanto fornisce sufficiente libertà per complementazione a verificarsi. Uno di questi è linker (GGGGS) x2, anche se ci sono molti altri che sono state applicate con successo, tra cui sequenze casuali generati da un sito di clonazione multipla (MCS) 14. La lunghezza dei linker può avere bisogno di essere ottimizzato depending delle dimensioni delle proteine ​​di interesse e il loro orientamento quando interagenti. I frammenti PAmCherry1 sono contenuti in una piccola spina dorsale di clonazione con accompagnamento MCSs (vedi Lista dei materiali). I geni di interesse possono essere inseriti attraverso i siti di restrizione o con un metodo di legatura indipendente. Dopo la verifica clonazione e la sequenza, la cassetta di espressione viene trasferito in un vettore di espressione mediante una reazione ricombinasi, un processo di clonazione con alta fedeltà e ad alta efficienza. Successivamente, i costrutti di espressione risultanti vengono trasfettati nella linea cellulare di destinazione o, se una linea cellulare stabile è desiderato, confezionato in lentivirus per infettare la linea cellulare di destinazione. Trasfezione transitoria consente di convalida rapida delle configurazioni BiFC, ma i potenziali problemi deve essere notato. Trasfezione utilizzo di sostanze chimiche spesso sottolinea le cellule, con conseguente forte autofluorescenza; mentre l&#39;uso di riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopy può attenuare questo segnale di fondo limitando il volume illuminazione, TIRF ideale quando le IPP avvengono sulla membrana cellulare. Inoltre, trasfezioni transienti portano spesso ad alti livelli di espressione della proteina, di gran lunga superiori a quelli delle proteine ​​endogene, che possono causare artefatti nel rilevare i PPI. Pertanto, si raccomanda che le linee cellulari stabili essere stabiliti dopo una configurazione BiFC appropriata è stata determinata attraverso prove iniziali. Linee cellulari stabili hanno anche la possibilità di espressione sintonizzabile tramite induzione doxiciclina 15. Dopo l&#39;infezione, le cellule sono selezionate con antibiotici, tipicamente puromicina e neomicina, uno per ciascun costrutto. Le fasi successive per la preparazione del campione, l&#39;acquisizione delle immagini, e l&#39;analisi dei dati verranno descritti in dettaglio nei protocolli. Con questo approccio, la formazione di cluster in nanoscala nelle immagini BiFC-PALM di Ras-Raf RBD sono comunemente osservati (Figura 2A &lt;/ strong&gt;). Coerentemente, traiettorie SMT-PALM di Ras-Raf RBD mostrano una distribuzione eterogenea negli stati di diffusione (figura 2B-D). Questi risultati suggeriscono che esistono complessi Ras-Raf in più stati sulla membrana cellulare, presumibilmente come monomeri e cluster, con potenziali implicazioni biologiche. Questo lavoro dimostra la potenza di BiFC-PALM nell&#39;imaging selettiva di PPI in cellule con nanometrica risoluzione spaziale e sensibilità singola molecola, che sarebbe difficile da ottenere con BiFC convenzionale, a fluorescenza co-localizzazione o la risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET). Nel progettare gli esperimenti BiFC e interpretare i risultati, è importante tenere a mente che il processo è irreversibile BiFC nella maggior parte dei casi, di cui PAmCherry1 spaccato. Una volta che i due frammenti uniscono e formano una proteina PAmCherry1 completa, il collegamento tra i due frammenti, e quindi la PPI diventa permanente. Questo limita l&#39;uso di BiFC e BiFC-PALM per monitorare la dinamica dei PPI (cioè, la cinetica di legame e non la dinamica di diffusione del complesso proteico volta che è formata) e, a volte potrebbe anche portare alla mislocalization dei complessi PPI. Un ulteriore fattore da considerare nella progettazione di esperimenti BiFC-Palm è il ritardo nella maturazione cromoforo che è insita in proteine ​​fluorescenti. Dopo due proteine ​​interagiscono ei frammenti FP si incontrano, in genere ripiegare dell&#39;ordine di secondi (primo tempo di 60 sec per EYFP 3). Tuttavia, la successiva maturazione cromoforo e segnale fluorescente sviluppano dell&#39;ordine di minuti. Mentre fluorescenza può essere rilevabile entro 10 minuti dopo la ricostituzione del split-Venere, un fast-pieghevole variante YFP, il primo tempo per la maturazione in generale è spesso circa 60 min 16. Split-PAmCherry1 è stato osservato ad avere tassi simili. Quindi, BiFC e BiFC-PALM sono scelte attualmente poveri per monitorare la cinetica PPI in tempo reale; altro mithods, come FRET e dimerizzazione recentemente sviluppato proteina fluorescente dipendente 17, può essere più adatto per questo scopo.

<table><tbody><tr><td>Telaio per microscopio</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60X obiettivo TIRF a immersione in olio con 1,49 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm laser</td><td>Opto Engine</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm laser</td><td>Coherent</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm specchio</td> <td>dicroicoSemrock</td><td>&nbsp; Filtro Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>561 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>405/561 nm filtro notch</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura e CO2 stadio controllato</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td></tr> <tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD Cloning</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Lentivirus Packaging</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione X-tremeGENE</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Coverglass a camera</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td><td>#1.5 piastre con fondo in vetro</td></tr><tr><td>Celle U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17 celle</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con rosso fenolo</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM senza rosso fenolo</td><td>Life Technologies</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>L-15 di Leibovit, senza rosso fenolo</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Siero ridotto medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore lentivirale</td><td>Clontech</td><td>631231</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore retrovirale</td><td>Clontech</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>coltura da 10 cm piatto</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>piastra di coltura a 6 pozzetti</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomicina</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td> Idrossido di <td></td></tr><tr><td>sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>TUBI</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>100 nm particelle d'oro</td><td>BBI Soluzioni</td><td>EM. GC100</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado molecolare</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Kit Midiprep</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 0,6 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 15 ml</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 5 ml in polipropilene a fondo tondo</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>14 ml in polipropilene provette a fondo tondo</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>tubo da 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per PCR</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB brodo</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Cellule competenti</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fotoattivato localizzazione microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (bifc-palm)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Le interazioni proteina-proteina (PPI) sono eventi molecolari chiave per la biologia. Tuttavia, rimane una sfida visualizzare i PPI con risoluzione e sensibilità sufficienti nelle cellule, perché la risoluzione della microscopia ottica convenzionale è limitata alla diffrazione a ~250 nm. Combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM), i PPI possono essere visualizzati in cellule con sensibilità a singola molecola e risoluzione spaziale nanometrica. BiFC è una tecnica comunemente usata per visualizzare i PPI con contrasto di fluorescenza, che comporta la scissione di una proteina fluorescente in due frammenti non fluorescenti. PALM è una recente tecnica di microscopia a superrisoluzione per l'imaging di campioni biologici su scala nanometrica e di singola molecola, che utilizza sonde fluorescenti fototrasformabili come le proteine fluorescenti fotoattivabili (PA-FP). BiFC-PALM è stato dimostrato dividendo PAmCherry1, un PA-FP compatibile con PALM, per la sua natura monomerica, la buona luminosità di una singola molecola, l'elevato rapporto di contrasto e l'utilità per le misure stechiometriche. Se diviso tra gli amminoacidi 159 e 160, PAmCherry1 può essere trasformato in una sonda BiFC che si ricostituisce in modo efficiente a 37 °C con un'elevata specificità per i PPI e una bassa ricostituzione aspecifica. L'interazione Ras-Raf viene utilizzata come esempio per mostrare come BiFC-PALM aiuti a sondare le interazioni su scala nanometrica e con risoluzione di una singola molecola. La loro diffusione può essere tracciata anche in cellule vive utilizzando il tracciamento di singole molecole (smt-) PALM. In questo protocollo, vengono discussi i fattori da considerare durante la progettazione delle proteine di fusione per BiFC-PALM, vengono spiegate la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini e le fasi di analisi dei dati e vengono presentati alcuni risultati esemplari. Fornendo un'elevata risoluzione spaziale, specificità e sensibilità, BiFC-PALM è uno strumento utile per lo studio dei PPI in campioni biologici intatti.

L&#39;esempio BiFC-PALM mostrata è KRAS G12D mutante interagire con Ras legame dominio (RBD) del CRAF (Figura 1A). Come discusso, la RN o frammenti RC non contrassegnati al C-terminale di Ras perché interromperebbe la localizzazione di membrana e quindi l&#39;attività biologica di Ras. Questo riduce le possibili combinazioni da otto a quattro (Figura 1B). Ciascuno di questi quattro combinazioni stato introdotto in cellule U2OS utilizzando infezione lentivirale. Le cellule sono state fis...

Le interazioni proteina-proteina vengono visualizzate in cellule con risoluzione spaziale nanometrica combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM). Qui viene descritto l'uso di BiFC-PALM per l'imaging delle interazioni Ras-Raf nelle cellule U2OS per visualizzare il clustering e la diffusione su scala nanometrica di singoli complessi Ras-Raf.

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di microscopia è visualizzare proteine e le loro interazioni a livello di singola molecola e su scala nanometrica. Pertanto, questo metodo può aiutarci a rispondere ad alcune domande fondamentali nel campo della biologia, come ad esempio le interazioni molecolari nei processi di segnalazione oncogenica. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua elevata sensibilità e specificità, nonché la risoluzione a livello di singola molecola e nanometrica.La procedura sarà dimostrata dal Dott. Tahan, ricercatore senior associato nel mio laboratorio. Dopo il clonaggio dei frammenti RAs e RAF R-B-D-P-A-M Cherry uno, il loro incapsulamento in particelle virali e l'infezione delle cellule U2 OS secondo il protocollo testuale, preparare un campione per l'immagine piastrando circa 5,5 × 10⁴ cellule con espressione stabile per pozzetto su una piastra a otto camere con fondo in vetro, aggiungendo 350 µL di DMEM privo di rosso fenolo. Fissare le cellule utilizzando paraformaldeide fresca con glutaraldeide; successivamente, sostituire il fissativo con PBS o buffer per imaging, vortexare le particelle d'oro da 100 nanometri e aggiungere 35 µL per pozzetto al fine di monitorare la deriva dello stadio durante l'acquisizione delle immagini.Avvicinarsi al microscopio e accendere i laser a 405 e 561 nanometri, mantenendo i relativi otturatori chiusi in questa fase; verificare che il divisore ottico (dicroico) e il filtro notch a 561 nanometri siano correttamente posizionati. Aprire il software di acquisizione delle immagini. Accendere la fotocamera E-M-C-C-D e lasciarla raffreddare, quindi impostare il tempo di esposizione a 100 millisecondi e il guadagno E-M-C-C-D a un valore appropriato.Aggiungere olio ad immersione all'obiettivo e fissare il campione sulla piastra del microscopio. Successivamente, utilizzando l'illuminazione in campo chiaro o il laser a 561 nanometri, mettere a fuoco il campione per l'acquisizione di immagini di RAs e altre proteine di membrana. Utilizzare un obiettivo APO 60x con un'apertura numerica di 1,49 e configurare il microscopio in modalità turf.Regolare il laser di eccitazione in modo che sia decentrato rispetto al punto in cui colpisce la diaframma posteriore dell'obiettivo turf, in modo che il laser venga deviato raggiungendo il tampone del vetrino coprioggetto. Continuare a regolare la posizione di incidenza del laser finché non si raggiunge l'angolo critico e il laser viene riflesso all'indietro. Cercare una cellula da immaginiare, in cui siano visibili diverse particelle d'oro.Quindi impostare una regione di interesse che racchiuda la cellula o una sua parte e le particelle d'oro, nel caso in cui si verifichi già un'attivazione sufficiente a causa di elevati livelli di espressione. Iniziare l'acquisizione con il laser a 405 nanometri spento e il laser a 561 acceso. In caso contrario, accendere il laser a 405 nanometri alla potenza minima di fabbrica e aumentarla gradualmente fino a ottenere decine di molecole per fotogramma, in modo che le singole molecole siano ben separate.Continuando l'acquisizione dei dati, aumentare gradualmente la potenza del laser a 405 nanometri per mantenere la densità dei punti approssimativamente costante. Continuare l'acquisizione delle immagini finché l'elevata potenza a 405 non inizia più.Gli eventi di attivazione terminano l'elaborazione delle immagini. Scaricare il software per l'elaborazione delle immagini. Aprire MATLAB e caricare il software di lettura WFI.Visualizzare la sequenza di immagini grezze e determinare la regione di interesse (ROI), selezionando l'area dello stack da elaborare cliccando con il tasto sinistro e trascinando un riquadro intorno all'area desiderata. Se la regione di interesse non è stata ridotta durante l'acquisizione, selezionare un'area più piccola per ridurre il tempo di calcolo; per deselezionare un'area ed elaborare l'intero fotogramma, fare clic con il tasto destro in un punto qualsiasi dell'immagine. Successivamente, definire un insieme di marcatori fiduciali, come nanoparticelle d'oro assorbite sul vetrino, ben isolate, uniformi nella forma e presenti nel campo visivo per tutta la durata dello stack di immagini. Iniziare selezionando una nanoparticella d'oro candidata cliccando con il tasto sinistro sull'immagine e trascinando un piccolo riquadro intorno ad essa.Sotto il tracciamento delle particelle, fare clic sul pulsante di tracciamento. Apparirà un grafico che mostra la posizione della particella d'oro selezionata attraverso la serie di immagini, indicando l'entità della deriva. Ripetere questo processo per tracciare il maggior numero possibile di particelle d'oro e determinare quali particelle si muovono insieme. Idealmente.La deriva complessiva è al massimo dell'ordine di 0,1 pixel, uno alla volta. Selezionare le particelle d'oro che sono state tracciate insieme e sotto il tracciamento delle particelle. Fare clic sul pulsante aggiungi marcatore.Apparirà una croce verde che indica che la particella è stata aggiunta come marcatore e verrà utilizzata per correggere la deriva. Regolare il raggio di smoothing e la soglia del raggio sigma secondo necessità, modificando leggermente il valore. Fare clic sul pulsante "trova particella" per testare le impostazioni ed esaminare visivamente le particelle elaborate: le molecole di PAM cherry, ad esempio, che sono relativamente rotonde e luminose verranno evidenziate con un riquadro, mentre quelle che non lo sono verranno escluse.Per iniziare l'elaborazione delle immagini, fare clic sul pulsante crea file cord e salvare il file con un nome desiderato per post-elaborare le immagini e generare l'immagine palm. Avviare il pacchetto palm in MATLAB e caricare il file dot core appena creato. Un'immagine approssimativamente renderizzata apparirà nella finestra dell'immagine accanto ai pulsanti di controllo.Ordinare le singole coordinate utilizzando i seguenti valori tipici. Per PAM Cherry uno, il frame di combinazione è pari a otto. La distanza di combinazione in nanometri è pari a 100, il valore minimo di RMS è quattro.Il valore minimo di adattamento corrisponde a 0,25 e l'eccentricità massima a 1,4. Fare clic sul pulsante di ordinamento per generare un nuovo insieme di coordinate curate, pronte per la creazione di immagini ad alta risoluzione. Inserire i valori necessari per una corretta resa dell'immagine finale, come la dimensione effettiva del pixel precedentemente determinata e la dimensione desiderata della caratteristica nell'immagine renderizzata, che di norma viene impostata su un valore leggermente superiore rispetto alla localizzazione media e alla dimensione del pixel, ad esempio 10 nanometri.Per l'immagine renderizzata, fare clic sul pulsante di rendering per generare l'immagine del palmo. Quindi utilizzare le icone di ingrandimento più e meno nella barra degli strumenti della finestra della figura per zoomare avanti e indietro al fine di tracciare singole molecole in cellule vive. Trattare la superficie di coltura dei tessuti e seminare le cellule come descritto in precedenza in questo video.Assicurarsi che il vetrino coprioggetto abbia lo spessore appropriato per l'allestimento microscopico dopo aver sezionato le cellule ed eseguito tutti i trattamenti e le incubazioni necessarie per l'esperimento; quindi posizionare la piastra di coltura su un incubatore da palco. Lasciare che la piastra si stabilizzi sul palco per alcuni minuti, fino a quando la temperatura e la concentrazione di CO2 non raggiungono l'equilibrio in questo passaggio. Bloccare i laser.Se non è disponibile il controllo della CO2, sostituire il mezzo con un mezzo indipendente dalla CO2 immediatamente prima dell'acquisizione delle immagini, ad esempio il mezzo di Leibovitz L-15, per ridurre la fluorescenza di fondo; infine, acquisire le immagini come illustrato in precedenza, impostando un tempo di esposizione appropriato per garantire un buon rapporto segnale-rumore senza compromettere la risoluzione temporale. Il BFC palm mostrato in questa figura corrisponde al mutante KRAS G12D che interagisce con il dominio di legame per RAS (RBD) di CRAF. Ciascuna delle quattro combinazioni qui mostrate è stata introdotta in cellule U2OS mediante infezione lentivirale. Due delle quattro configurazioni hanno prodotto segnali BFC fortemente positivi, identificati dall'aumento brusco della fluorescenza al momento dell'accensione del laser a 405 nanometri, dovuto all'attivazione fotochemica del BFC ricostituito PAM Cherry uno, come dimostrato qui utilizzando le stesse condizioni sperimentali adottate per il costrutto parentale PAM Cherry uno.Un segnale BFC intenso è stato generato dopo l'infezione con RN R e RAF RBD RC. Qui, RN e RC indicano rispettivamente i frammenti terminale N e terminale C di PAM Cherry uno; ingrandendo singole molecole, la loro distribuzione spaziale a livello nanometrico può essere chiaramente osservata in questo esperimento, in cui è stato eseguito il tracciamento di singole molecole mediante palm per ottenere le traiettorie di diffusione di singoli RAs. Complessi RAF RBD sotto illuminazione continua con laser a 561 nanometri e 405 nanometri. Singole molecole di PA m cherry uno st.Si accendono e durano alcuni fotogrammi prima di entrare in stati scuri in cui si è osservato che fossero o immobili o mobili. Questo grafico delle registrazioni per molteplici molecole illustra chiaramente entrambi i tipi di traiettorie. La stessa distribuzione eterogenea di stati di diffusione può essere dedotta dall'istogramma degli spostamenti molecolari tra fotogrammi successivi. Massimo dominio.Questa tecnica può essere eseguita in una a tre settimane, a seconda che i costrutti siano transitoriamente trasfettati o stabilmente soppressi, qualora venga eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare controlli come mutanti di Putins privi dell'interazione successiva a questo procedimento. Altri metodi, come un'analisi di cluster, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio: come sono organizzate spazialmente le interazioni proteiche nella cellula?Per il tracciamento cellulare in laboratorio, come base valutativa, può essere eseguito un tracciamento di singole particelle per determinare gli stati di diffusione e le probabilità di transizione dopo il loro sviluppo. Questa tecnica viene utilizzata nel nostro laboratorio nel campo della biologia del cancro per esplorare le interazioni indotte dall'acido retinoico (RA) nonché l'omodimerizzazione e l'oligomerizzazione dei recettori della famiglia HER in cellule tumorali umane. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come progettare e attuare un esperimento di tracciamento mediante biopsia per indagare un'interazione proteica di interesse.Non dimenticare che lavorare con agenti antivirali e cellule tumorali può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come i protocolli standard di sicurezza biologica devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Bioingegneria

La localizzazione subcellulare delle proteine ​​è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine ​​all'interno della cellula.

Bimolecolari complementazione fluorescenza

Questo video descrive BiFC-PALM - una combinazione di microscopia di localizzazione fotoattivata e complementazione a fluorescenza bimolecolare - per valutare le interazioni proteina-proteina. La BiFC prevede la fusione di due frammenti proteici fluorescenti con due proteine di interesse interagenti. Quando le due proteine interagiscono, i frammenti vengono portati in prossimità, il che consente alle due parti di unirsi e ricostituire una proteina fluorescente funzionale. La fluorescenza di un...

Microscopia di localizzazione fotoattivata accoppiata a complementazione a fluorescenza bimolecolare

Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l'organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Dimostriamo l'uso della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) per visualizzare simultaneamente più tipi di molecole marcate in fluorescenza all'interno delle cellule. Le tecniche descritte producono la localizzazione di migliaia o centinaia di migliaia di singole proteine marcate con fluorescenza, con una precisione di decine di nanometri all'interno di singole cellule.

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) in combinazione con inseguimento singola molecola permette l'osservazione diretta e la quantificazione delle interazioni proteina-DNA in cellule di Escherichia coli vive.

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

PI (4,5) P2 regola diverse funzioni cellulari, ma la sua organizzazione su scala nanometrica nella membrana plasmatica delle cellule è poco conosciuta. Etichettando PI (4,5) P2 con una sonda fluorescente a due colori fusa al dominio Pleckstrin omologia, si descrive un nuovo approccio per studiare il PI (4,5) P2 distribuzione spaziale nella membrana plasmatica su scala nanometrica .

Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

Presentiamo un protocollo di applicazione del interferometrica fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM), un metodo di risoluzione di microscopia eccellente 3-dimensional localizzazione singola molecola, per l'imaging del citoscheletro actina in cellule di mammifero aderenti. Questo approccio permette la visualizzazione basata sulla luce delle caratteristiche strutturali nanoscala che altrimenti rimarrebbero irrisolti da convenzionale microscopia ottica di diffrazione limitata.

Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM)

Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

I coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per la microscopia per la localizzazione a singola molecola a cellule vive (SMLM) attraverso lo sfruttamento dei loro dimeri di stato del suolo con formazione transitoria e spostata verso il rosso. Vi presentiamo un protocollo SMLM ottimizzato per tracciare e risolvere i lipidi neutri subcellulari e gli acidi grassi nelle cellule viventi di mammiferi e lieviti alla scala nanoscopica della lunghezza.

Convenzionale BODIPY Coniugato per la microscopia a super-risoluzione a celle vive e il tracciamento a singola molecola

La formazione di una corretta rete di sarcomi è importante per la maturazione dei cardiomiociti derivati da iPSC. Presentiamo un approccio basato sulla super risoluzione che consente la valutazione quantitativa della maturazione strutturale dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali, per migliorare le condizioni di coltura che promuovono lo sviluppo cardiaco.

Analisi della α-Actinin Network in Cardiomiociti derivati da iPSC umani utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola

Scopri la tecnica BiFC-PALM per visualizzare le interazioni proteiche Ras-Raf a scala nanometrica nelle cellule U2OS. Questo metodo avanzato consente di studiare i processi di segnalazione oncogenica con risoluzione a singola molecola.

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

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