Utilizzando Analisi confocale di

L'obiettivo generale di questa metodologia è visualizzare la secrezione e la diffusione di ligandi marcati con fluorescenza in un epitelio integro, utilizzando l'espressione in xip pos lavis. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sull'instaurazione di gradienti morfogenetici, noti essere essenziali nella specificazione delle linee cellulari durante lo sviluppo embrionale precoce. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice per visualizzare la distribuzione del ligando in un epitelio integro.

Una parte essenziale del protocollo consiste nella generazione di ligandi biologicamente attivi che vengono normalmente processati e secreti e sono in grado di indurre una risposta nelle cellule riceventi nonostante l'aggiunta di un marcatore fluorescente. La microscopia confocale rappresenta un metodo ideale per studiare la localizzazione di proteine marcate fluorescentemente all'interno di tessuti tridimensionali; l'uso di laser e rilevatori indipendenti consente un'analisi pulita all'interno di questi tipi di tessuti complessi e permette di raccogliere dati robusti. Dopo aver prodotto l'mRNA rivestito per i ligandi marcati fluorescentemente e aver ottenuto embrioni XUS lavis seguendo il protocollo scritto, si procede con l'iniezione dell'mRNA insieme a un marcatore di linea, come ad esempio la RFP membranaria, in una singola cellula allo stadio da 16 a 32 cellule; se desiderato, un modulatore può essere co-iniettato insieme al ligando fluorescente e al marcatore di linea per analizzarne gli effetti.

A volte è utile iniettare anche una cellula adiacente. Qui, una seconda cellula viene iniettata vicino alla cellula precedentemente iniettata. Una cellula viene iniettata con mRNA che codificano per il ligando marcato con GFP e un tracciante di linea cellulare come la RFP membranare, mentre l'altra cellula viene iniettata con mRNA che codificano per il modulatore e un diverso tracciante di linea cellulare come la cerulea membranare. Trasferire gli embrioni in un incubatore a 12,5 gradi Celsius e coltivare fino al nuovo stadio. Allo stadio di Faber otto, il giorno successivo, quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio otto, riempire le piastre rivestite con aros all'1% con NAM due e trasferire gli embrioni utilizzando una pipetta di vetro tagliata, con aghi al tungsteno.

Dissezionare l'esplanato circolare dal polo animale di embrioni iniettati e di controllo, avendo cura di non includere nessun mesoderma; trasferire l'esplanato animale in piatti di Petri da 55 millimetri, rivestiti con aros all'1% e coltivare gli embrioni per quattro ore. Attendere il completamento della maturazione delle proteine fluorescenti per generare il rilievo. Per le vetrini, applicare due strati di nastro isolante in PVC sui portavetrini, appiattendoli completamente.

Ritagliare un rettangolo di 14 per 10 millimetri dal nastro per il montaggio dei cappucci animali. Successivamente, pipettare due gocce separate di NM due nella cavità della vetrino. Poi, utilizzando una punta P 20 tagliata, trasferire fino a 15 espianti animali su ciascun vetrino e, con pinzette, orientare gli espianti X in modo che il lato apicale sia rivolto verso l'alto.

Utilizzando una penna diamantata, tracciare un solco su un vetrino coprioggetto di vetro e romperlo per ottenere un coprioggetto più piccolo. Per adattarlo alla cavità del vetrino portaoggetto, abbassare delicatamente un coprioggetto di vetro sulla cavità utilizzando un ago curvato da 19 gauge, comprimendo così lo strato apicale delle cellule del cappuccio animale.

Utilizzare lo smalto per unghie per sigillare il vetrino al buio per 20 minuti e acquisire le immagini entro quattro-sei ore. Per garantire capsula animale in buona salute, le capsule animali devono essere correttamente orientate nei vetrini personalizzati e quindi coperte con coprioggetti. Caricare delicatamente sui vetrini.

È fondamentale non utilizzare troppo smalto per unghie per sigillare i vetrini, poiché ciò causerebbe la formazione di grinze nel nastro e, successivamente, la rottura del sigillo sul vetrino. Una volta acquisita padronanza della tecnica, sarà necessario iniettare circa 25 embrioni per ottenere circa 20 calotte animali di buona qualità per ciascuna condizione di interesse. Queste possono quindi essere analizzate mediante microscopia confocale il giorno successivo.

Per eseguire l'acquisizione delle immagini, utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento per individuare X explan. Successivamente passare a un obiettivo 63 x 1,4 ad immersione in olio per ottenere immagini ad alta risoluzione. Accendere i laser necessari, inclusi il 405 per MIAN, il 488 per GFP e il 561.

Per la MRFP, ottimizzare le potenze del laser in modo che tutti i fluorocromi possano essere rilevati. Utilizzando l'array di 32 detector, ridurre al minimo la tensione e il guadagno necessari, quindi usare la modalità Lambda e selezionare i laser a 405 nanometri, 488 e 561 nanometri. Per consentire un campo visivo più ampio, eseguire uno zoom indietro sull'immagine fino a 0,6 x.

Successivamente, impostare la dimensione del fotogramma alla dimensione dell'immagine desiderata. Questo fornisce una risoluzione sufficiente per la media dell'insieme di analisi, che va da quattro a otto, al fine di aumentare il rapporto segnale-rumore e ottimizzare il pinhole per questo insieme di dati. Un'unità di area, secondo il laser a 561 nanometri, è stata utilizzata con 405 e 4 88 5 61.

Gli specchi dicromatici raccolgono la luce emessa dalla membrana Saru, GFP e membrana RFP. In questo esperimento, la luce è stata raccolta ogni circa 10 nanometri da 415 a 720 nanometri. Eseguire l'analisi dell'immagine secondo il protocollo descritto nel testo. Qui è mostrata la distribuzione di sonic hedgehog marcato con GFP in un'espianazione di animale cab X in condizioni di controllo: sonic hedgehog GFP viene secreto e diffonde al di fuori della regione che esprime gli mRNA iniettati.

Tuttavia, in presenza del modulatore, SULF uno, Sonic Hedgehog GFP ha una distribuzione più ristretta. E in questo campione si possono osservare solo pochi focolai di Sonic Hedgehog GFP a breve distanza dalla linea cellulare che lo produce. Questa figura mostra la caratterizzazione di due ligandi marcati con fluoroforo iniettati nelle cellule come indicato qui: sia wind eight A che win 11 B-H-A-E-G-F-P si accumulano sulla membrana delle cellule del blastoporo animale, con wind eight A-H-A-E-G-F-P che si accumula in modo più efficiente rispetto a wind 11 B. Questa figura mostra la distribuzione di wind eight A-H-A-E-G-F-P espresso in una linea cellulare marcata con cerulean legato alla membrana.

Si osserva che il ligando marcato con fluorescenza diffonde dalle cellule sorgente verso le cellule circostanti dell'epitelio. Un software di analisi delle immagini viene utilizzato per estrarre dati sulla distribuzione dei ligandi wind marcati con fluorescenza in diversi campioni sperimentali, come mostrato qui. Viene misurata la distanza dal clone che esprime mem Saru e il livello di fluorescenza GFP per determinare l'intervallo di diffusione di wind e la forma del gradiente.

Dopo aver misurato la distribuzione di un ligando, l'output di una via di segnalazione può essere valutato anche combinando questo protocollo con un altro saggio per monitorare la risposta delle cellule riceventi. In questo modo, è possibile tentare di determinare l'intervallo di soglia di un morfogeno.