Name: Utilizzando Analisi confocale di Xenopus laevis Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri l'analisi confocale in Xenopus laevis per studiare gradienti di morfogeni Wnt e Shh. Questo metodo permette di visualizzare la secrezione e la diffusione di ligandi fluorescenti nell'epitelio intatto.

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Questo lavoro è stato finanziato da un BBSRC concedere a parlamentare europeo (BB / H010297 / 1), una quota borsa di studio BBSRC a SAR, e una borsa di studio MRC in SWF.

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Una parte essenziale di questo protocollo genera ligandi biologicamente attivi che vengono normalmente trattati, secreti, e in grado di suscitare una risposta nella cellula ricevente, pur avendo una porzione fluorescente allegata. E &#39;fondamentale per stabilire che il prodotto del gene fluorescente-tag è biologicamente attivo utilizzando un dosaggio adeguato. Per Shh-GFP, la capacità di attivare l&#39;espressione di PTC1 stato confermato 16. Wnt8a ha notevolmente potente capacità di indurre un ass...

Durante lo sviluppo embrionale precoce, le cellule sono progressivamente impegnati a seguire linee specifiche di differenziazione: questo significa un gruppo di totipotente (o pluripotenti) cellule diventano gradualmente limitarsi a verificare popolazioni di cellule progenitrici decisi a dare origine a un tipo di cellula. Segnalazione cellula-cellula è centrale per la regolamentazione specifica stirpe durante lo sviluppo embrionale. La manipolazione di questi segnali dovrà dirigere le cellule staminali verso particolari sorti per sostenere cure mediche innovative. Un numero relativamente piccolo di vie di segnalazione sono ribadito durante lo sviluppo, tra cui percorsi di rispondere alla superfamiglia TGF (nodals e BMP) 1-2, FGFs 3, 4 Wnt, e Hedgehogs 5. Queste proteine ​​secrete legano recettori presenti sulla membrana cellulare per attivare trasduzione del segnale modificando così l&#39;espressione genica e / o il comportamento cellulare. La stretta regolazione di segno cellulareAlling è essenziale per la specifica linea cellulare e lo sviluppo normale. Mentre il cross-talk tra questi percorsi è importante per determinare il destino delle cellule, un singolo ligando può sé suscitare risposte diverse a diverse concentrazioni. Gradienti morfogeno sono stati descritti più di 100 anni fa come una teoria per spiegare come i diversi tipi di cellule possono derivare da un campo di celle 6. Segnalazione molecole prodotte da un gruppo di cellule si diffonda in un determinato intervallo, diminuendo in concentrazione con una maggiore distanza dalla sorgente. Cellule esposte al segnale risponderà alla concentrazione locale nella loro posizione nel campo delle celle, con le cellule nelle posizioni distinte risposta diverso a diversi livelli di segnale. La prova dell&#39;esistenza di morphogens deriva da studi dei primi Drosophila embrione 7 e il disco dell&#39;ala 8, così come l&#39;arto vertebrato 9 e 10 del tubo neurale. I metodi sono necessari alvestigate come gradienti morfogeno sono stabilite e di individuare altre molecole importanti nella regolazione questi gradienti. Eleganti esperimenti che utilizzano immunoistochimica di visualizzare le proteine ​​endogene in vivo nel contesto di differenti background genetici sono stati utilizzati per indagare gradienti morphogen 11-12. Tuttavia, i buoni anticorpi e mutanti specifici non sono sempre disponibili, così abbiamo descritto qui un protocollo con sovraespressione di ligandi fluorescenti Xenopus, per fornire un&#39;alternativa, metodo semplice per analizzare come i prodotti genici esogeni possono influenzare la distribuzione di ligandi attraverso un campo di celle. Xenopus laevis fornisce un ottimo sistema di intraprendere questo tipo di esperimenti come i loro embrioni si sviluppano esternamente in modo che siano accessibili nelle prime fasi. Loro grandi dimensioni (1-1.5mm di diametro) semplifica microiniezione e manipolazione chirurgica e blastula stadi cellule sono facili da immagine in quanto sono ancora relativamente grande (circa 2081; m di diametro). Studi iperespressione di Xenopus sono semplici da fare: mRNA iniettate nel embrione precoce possono essere mirati a particolari cellule ed è efficace tradotti. I costrutti Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescente con tag sono stati generati utilizzando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 e eGFP. Il peptide HA è importante includere non solo per fornire un ulteriore indicatore molecolare, ma anche perché è pensato per fungere da distanziatore che separa le proteine ​​Wnt e eGFP permettendo entrambi i prodotti genici di funzionare. Il costrutto utilizzato per la visualizzazione di Shh è stato precedentemente utilizzato per generare un topo transgenico che esprime una proteina di fusione shh-eGFP 15; questo è stato gentilmente fornito da Andy McMahon. È importante sottolineare che il tag GFP per tutti i costrutti è clonato 3 &#39;alla sequenza del segnale in modo tale che viene mantenuta dopo l&#39;elaborazione. È anche essenziale per garantire che la proteina finale comprende sequenze necessarie modifiche, come la addition di lipidi, come è il caso di Shh e Wnt ligands.The cDNAs stati subclonato nel vettore pCS2 + di espressione che è ottimizzato per il prodution di mRNA sintetico; esso include un promotore SP6 e il segnale di poliadenilazione (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors). Il lavoro qui descritto fornisce un protocollo semplice per confrontare la secrezione e la diffusione di fluorescente tag Wnt e Shh contrassegnati leganti. Iniettando quantità definite di mRNA sintetico, il protocollo circumnaviga eventuali problemi connessi con l&#39;espressione variabile da vettori diversi utilizzando diversi promotori. Questi metodi sono stati recentemente applicato per studiare gli effetti del solfato endosulfatase eparan Sulf1 su Shh-eGFP e Wnt8a / secrezione Wnt11b-HA-eGFP e diffusione in Xenopus 16-17.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio</td><td>Ambion</td><td>da Megascript SP6 Kit AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td>VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di calcio</td><td>Sigma</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>Tappo analogo (m7G(5'))</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina cloridrato monoidrato</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiji image J software</td><td></td><td></td><td>Download gratuito http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, n. 1.5</td><td>Forniture per laboratorio scientifico</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore di aghi in vetro</td><td>Narishige</td><td>Narishige PC -10</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per trazione in vetro</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G / X</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina cronica umana (HCG)</td> <td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>P / 7500 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di litio (LiCl)</td> <td>Sigma</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 e Software Zen (2008-2010)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Acqua di grado molecolare&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>Smalto per unghie&nbsp;</td><td>Stivali</td><td>Codice a barre 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Lab.tech International</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (55 mm)</td><td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo-cloroformio</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Software Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>DNA polimerasi ad alta fedeltà e tamponi&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>M0530S&nbsp; Tampone - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>Nastro isolante in PVC</td><td>Onecall</td><td>SH5006MPK</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>Enzimi di restrizione tamponi</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT Set di tamponi 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse senza RNAsi</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>Lame posteriori in acciaio a bordo singolo</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>SP6 kit di trascrizione</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Aghi di tungsteno</td><td></td><td></td><td>fatti in casa</td></tr><tr><td>Zen lite software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Download gratuito&nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

utilizzando analisi confocale di<em&gt; xenopus laevis</em&gt; per indagare modulatori di wnt e shh morphogen gradienti

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare ligandi distribuiti attraverso un campo di cellule. La facilità di esprimere proteine ​​esogene, insieme con le grandi dimensioni delle loro cellule in embrioni precoci, fare Xenopus laevis un modello utile per la visualizzazione di ligandi GFP-tag. MRNA sintetici sono efficacemente tradotte dopo l&#39;iniezione in fase iniziale di Xenopus embrioni, e le iniezioni possono essere mirati a una singola cella. Se combinato con un tracciante lignaggio come membrana legato RFP, la cella iniettato (ei suoi discendenti) che stanno producendo la proteina overexpressed possono facilmente essere seguite. Questo protocollo descrive un metodo per la produzione di fluorescenza etichettato Wnt e Shh ligandi da iniettare mRNA. I metodi coinvolgono la micro dissezione di espianti ectodermici (tappi di animali) e l&#39;analisi del ligando diffusione in più campioni. Utilizzando confocale, informazioni sulla secrezione ligando e diffusione su un campo di cellule può essere ottenuta. Le analisi statistiche delle immagini confocale forniscono dati quantitativi sulla forma di gradienti ligando. Questi metodi possono essere utili per i ricercatori che vogliono testare gli effetti dei fattori che possono regolare la forma di gradienti morphogen.

Analisi confocale di espianti protezione animale che esprimono proteine ​​fluorescenti tag fornisce un sistema efficace per la visualizzazione di distribuzione ligando in diverse condizioni sperimentali. In un esempio, la distribuzione di GFP etichettato Shh è mostrato (Figura 1). Nella fase 2 cellule, embrioni di Xenopus vengono iniettate in entrambe le cellule con una o con mRNA di controllo o con mRNA codificante per Sulf1, un enzima che modifica superficie cellulare eparan solfato e influen...

Il manoscritto qui fornisce un semplice insieme di metodi per analizzare la secrezione e la diffusione di fluorescenza ligandi marcati nel Xenopus. Ciò fornisce un contesto per valutare la capacità di altre proteine ​​di modificare la distribuzione ligando e permettendo esperimenti che possono dare comprensione dei meccanismi che regolano gradienti morphogen.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è visualizzare la secrezione e la diffusione di ligandi marcati con fluorescenza in un epitelio integro, utilizzando l'espressione in xip pos lavis. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sull'instaurazione di gradienti morfogenetici, noti essere essenziali nella specificazione delle linee cellulari durante lo sviluppo embrionale precoce. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice per visualizzare la distribuzione del ligando in un epitelio integro.Una parte essenziale del protocollo consiste nella generazione di ligandi biologicamente attivi che vengono normalmente processati e secreti e sono in grado di indurre una risposta nelle cellule riceventi nonostante l'aggiunta di un marcatore fluorescente. La microscopia confocale rappresenta un metodo ideale per studiare la localizzazione di proteine marcate fluorescentemente all'interno di tessuti tridimensionali; l'uso di laser e rilevatori indipendenti consente un'analisi pulita all'interno di questi tipi di tessuti complessi e permette di raccogliere dati robusti. Dopo aver prodotto l'mRNA rivestito per i ligandi marcati fluore

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Biologia dello sviluppo

Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Xenopus ectoderma embrionale è diventato un modello attraente per gli studi di polarità cellulare. Un saggio è descritta, in cui la distribuzione subcellulare delle proteine ​​fluorescenti è valutata in cellule ectoderma. Questo protocollo aiuterà a trattare questioni relative al controllo spaziale della segnalazione.

Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus</emEctoderma> in risposta alla segnalazione Wnt

Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

Negli embrioni di Xenopus, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti e possono essere programmate per generare vari tessuti. Qui, descriviamo i protocolli per utilizzare gli espianti di tetti di blastocele di anfibi come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Questo articolo descrive il video di una semplice metodologia vivo che può essere utilizzata per caratterizzare in modo sistematico ed efficiente componenti di vie di segnalazione complessi e reti di regolazione in molti embrioni invertebrati.

La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelli di sviluppo per lo studio delle cellule cellula-Complex segnalazione di rete Interazioni

Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Qui descriviamo strumenti e metodi computazionali che consentono la visualizzazione e l'analisi di dati di immagini tridimensionali e quadridimensionali di embrioni di topo nel contesto dell'allungamento e della segmentazione assiale, ottenuti mediante tomografia a proiezione ottica in toto e mediante imaging dal vivo e colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero utilizzando la microscopia multifotonica.

Approcci di visualizzazione e analisi tridimensionali e quadridimensionali per studiare l'allungamento e la segmentazione assiale dei vertebrati

Qui, viene fornito un protocollo passo-passo ottimizzato per la fissazione, l'immunocolorazione e il sezionamento degli embrioni per rilevare filopodi di segnalazione specializzati chiamati citonemi nello sviluppo di tessuti di topo.

Fissazione del tessuto embrionale di topo per l'analisi del citonemo

L'embrione di Xenopus laevis continua ad essere eccezionalmente utile nello studio dello sviluppo precoce grazie alle sue grandi dimensioni e alla facilità di manipolazione.   Viene fornito un protocollo semplificato per l'ibridazione in situ dell'intera montatura che può essere utilizzato nell'identificazione di organi specifici in questo sistema modello.

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Scopri l'analisi confocale in Xenopus laevis per studiare gradienti di morfogeni Wnt e Shh. Questo metodo permette di visualizzare la secrezione e la diffusione di ligandi fluorescenti nell'epitelio intatto.

Utilizzando Analisi confocale di

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