Utilizzando Analisi confocale di Xenopus laevis Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di visualizzare la secrezione e la diffusione di ligandi marcati in fluorescenza in un epitelio intatto utilizzando l'espressione in xip pos lavis. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla creazione di morfo in gradienti che sono noti per essere essenziali nella specificazione delle linee cellulari durante lo sviluppo embrionale precoce. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo semplice per visualizzare la distribuzione del ligando in un epitelio intatto.

Una parte essenziale del protocollo è la generazione di ligandi biologicamente attivi che vengono normalmente elaborati e secreti e in grado di suscitare una risposta nelle cellule riceventi nonostante abbiano un tag fluorescente attaccato. La microscopia confocale è un modo ideale per studiare la localizzazione di proteine marcate in fluorescenza all'interno di tessuti tridimensionali utilizzando laser e rivelatori indipendenti, che consentono un'analisi pulita all'interno di questi tipi di tessuto complessi e consentono di raccogliere dati affidabili. Dopo aver generato il rivestimento di mRNA per ligandi marcati in fluorescenza e aver acquisito embrioni di XUS lavis secondo il protocollo scritto, iniettare l'mRNA insieme a un tracciante di lignaggio come RFP di membrana, in una singola cellula allo stadio da 16 a 32 cellule, se lo si desidera, un modulatore può essere co-iniettato con un ligando fluorescente e il marcatore di lignaggio per analizzarne gli effetti.

A volte è utile iniettare anche una cellula vicina Qui, una seconda cellula viene iniettata adiacente alla cellula precedentemente iniettata. Una cellula viene iniettata con mRNA che codificano per il ligando marcato GFP e un tracciante di lignaggio come la RFP di membrana, mentre l'altra cellula viene iniettata con mRNA che codificano per il modulatore e un tracciante di lignaggio diverso, come il ceruleo di membrana, trasferisce gli embrioni in un'incubatrice a 12,5 gradi Celsius e la coltura in un nuovo pollaio. Nell'ottavo stadio di Faber, il giorno successivo, quando gli embrioni hanno raggiunto l'ottavo stadio, riempire le piastre rivestite con l'1% di aros con NAM 2 e trasferire gli embrioni utilizzando una pipetta di vetro tagliata con aghi di tungsteno.

Sezionare l'explan circolare dal palo animale degli embrioni iniettati e di controllo, facendo attenzione a non includere alcun mesoderma trasferimento animale explan in piastre di Petri da 55 millimetri, rivestite con 1%aros ed embrioni di coltura per quattro ore. Per consentire alle proteine fluorescenti di maturare per generare sollievo. I vetrini applicano due strati di nastro isolante in PVC sui vetrini del microscopio, appiattendoli completamente.

Taglia un rettangolo di 14 x 10 millimetri dal nastro per il montaggio dei cappucci degli animali. Quindi, pipettare due goccioline separate di NM due nel vetrino di scarico. Quindi, utilizzando un cutoff P 20 tip tip trasferire fino a 15 animali su ciascun vetrino e con una pinza, orientare gli espianti X in modo che il lato apicale sia rivolto verso l'alto.

Usando un segnalibro a penna a diamante, un vetrino coprioggetto e rompilo per creare un vetrino coprioggetto più piccolo. Per montare il vetrino di scarico, abbassare delicatamente un vetrino di copertura sul vetrino di scarico utilizzando un ago piegato calibro 19. Comprimere lo strato apicale delle cellule del cappello animale.

Usa lo smalto per unghie per sigillare la diapositiva, asciugarla al buio per 20 minuti e scattare l'immagine entro quattro o sei ore. Per garantire la salute dei cappucci degli animali, i cappucci degli animali devono essere orientati correttamente nelle guide personalizzate e quindi nei vetrini copritutto. Caricare delicatamente sulle diapositive.

È fondamentale non usare troppo smalto per unghie per sigillare le diapositive in quanto ciò causerà la stropicciatura del nastro e quindi romperà il sigillo sulla diapositiva in seguito. Una volta padroneggiato, dovrai iniettare circa 25 embrioni per prendere 20 buoni cappucci di animali per condizione che ti interessa. Questi possono poi essere analizzati con la microscopia confocale il giorno successivo.

Per eseguire l'imaging, utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento per trovare l'esempio X. Quindi passa a un obiettivo a olio 63 x 1,4 per immagini a risoluzione più elevata. Accendere i laser richiesti, tra cui 405 per MIAN, 488 per GFP e 561.

Per MRFP, ottimizzare le potenze del laser in modo che tutti i fluoro quattro possano essere rilevati. Utilizzando l'array di 32 rivelatori riducendo al minimo la quantità di tensione e guadagno richiesti, utilizzare la modalità Lambda e selezionare i laser a 405 nanometri, 488 e 561 nanometri. Per consentire un campo visivo più ampio, ingrandire l'immagine a 0,6x.

Quindi, imposta la dimensione del fotogramma sulla dimensione dell'immagine desiderata. Ciò fornisce una risoluzione sufficiente per il set di analisi, con una media da quattro a otto, per aumentare il rapporto segnale/rumore e ottimizzare il foro stenopeico per questo set di dati. Un'unità di area, secondo il laser a 561 nanometri, è stata utilizzata utilizzando 405 e 4 88 5 61.

Gli specchi Diic raccolgono la luce emessa da Saru a membrana, GFP e RFP a membrana. In questo esperimento, la luce è stata raccolta circa ogni 10 nanometri da 415 a 720 nanometri. Effettuare l'analisi delle immagini secondo il protocollo di testo mostrato qui è la distribuzione di GFP taggato riccio sonico in una cabina animale X explan in condizioni di controllo riccio sonico GFP è secreto e si diffonde al di fuori della regione esprimendo gli mRNA iniettati.

Tuttavia, in presenza del modulatore, SULF one, Sonic Hedgehog GFP è più ristretto nella sua distribuzione. E in questo campione si possono vedere solo pochi focolai di GFP sonica di Hedgehog a breve distanza dal clone di cellule che lo producono. Questa figura mostra la caratterizzazione di due ligandi con tag fluorescenti iniettati nelle cellule come indicato qui, entrambi il vento otto A e win 11 B-H-A-E-G-F-P si accumulano sulla membrana delle cellule di cap animale con win otto A-H-A-E-G-F-P che si accumulano in modo più efficiente del vento 11 B.Questa figura mostra la distribuzione del vento otto A-H-A-E-G-F-P espressa in un clone di cellule marcate con ceruleo legato alla membrana.

Si vede che il ligando marcato in fluorescenza si diffonde lontano dalle cellule sorgente e nelle cellule circostanti dell'epitelio. Il software di analisi delle immagini viene utilizzato per estrarre dati sulla distribuzione di leganti eolici marcati in fluorescenza in più campioni sperimentali, come mostrato qui. La distanza dal clone che esprime mem Saru e il livello di fluorescenza GFP vengono misurati per determinare l'intervallo di diffusione del vento e la forma del gradiente.

Dopo aver misurato la distribuzione di un ligando, l'output di una via di segnalazione può anche essere valutato combinando questo protocollo con un altro test per monitorare la risposta delle cellule riceventi. E in questo modo, puoi tentare di determinare l'intervallo di soglia del morfogeno am.