Name: Rapido In Situ Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Impara un metodo rapido di ibridazione in situ per tessuto cerebrale prefissato in paraformaldeide utilizzando sonde oligonucleotidiche. Questa tecnica semplificata riduce i tempi di elaborazione e consente di rilevare l'espressione genica htr2a nei ratti.

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Questo studio è stato sostenuto dalla concessione NIH (R15DA029863), la concessione Florida Atlantic University di ricerca triennale (M30014) e la Scuola di Medicina Veterinaria assegno di ricerca Ross University. Vorremmo ringraziare il National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) per la fornitura di (±) 3,4-metilene (± MDMA) per questo lavoro.

Procedure per l&#39;uso degli animali descritti di seguito sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso Comitato istituzionale animali (IACUC) Ross University School di Medicina Veterinaria e Florida Atlantic University. Anche se sono necessarie tecniche sterili e guanti, l&#39;ambiente privo di RNasi non è necessario durante l&#39;utilizzo di questo protocollo. 1. Preparazione <ol><li> Preparazione dei tessuti e sezionamento <ol><li> Assegnare i ratti a caso in tre gruppi: fresco / salina (SAL; 0,9% NaCl), il prefisso / SAL e prefissati / 3,4-metilene (MDMA; vedi dettagli nella tabella 1). </li><li> Somministrare tre dosi di 1 ml / kg SAL e 10 mg / kg per via intraperitoneale MDMA, rispettivamente, ai gruppi SAL e MDMA a intervalli 2 ore. Lasciare gli animali a sopravvivere il trattamento per 6 giorni. </li><li> Il giorno 7, somministrare 100 mg / kg di ketamina in combinazione di 5 mg / kg per via intraperitoneale xilazina ai ratti per una anestesia profonda (cioè, perdita di lampeggio corneale e tail pizzico riflessi). </li><li> Per il gruppo fresco / SAL, decapitate rapidamente ratti e rimuovere il cervello per il test del cervello fresco (vedi dettagli nel riferimento 5). </li><li> Per i gruppi / MDMA prefissati / SAL e prefissati, effettuare un taglio lungo lo sterno circa 10 -12 cm e quindi esporre l&#39;estremità dello sterno. </li><li> Tenere l&#39;estremità dello sterno con una pinza emostatica e tagliare il diaframma lateralmente da entrambi i lati con forbici affilate e poi tagliare verso l&#39;alto attraverso le costole e paralleli ai polmoni. </li><li> Con una mano, tenere la punta ventrale del cuore con piccole pinze. Con l&#39;altra mano, perforare il ventricolo sinistro con una G siringa 18 (notare il lato dell&#39;adattatore dell&#39;ago è collegato con un tubo flessibile di silicio a forma di Y per SAL e paraformaldeide contenitori ghiacciate e pompe peristaltiche, vedere il riferimento 9). </li><li> Accendere la pompa SAL al livello medio della portata (~ 5 ml / min) e forare l&#39;atrio destro con la pinza per consentire la fuoriuscita di ritorno circlamento. Mantenere SAL perfusione per 30 min. </li><li> Accendere la pompa paraformaldeide al livello medio e consentire il ghiacciata 4% paraformaldeide per defluire in all&#39;animale per 30 min. </li><li> Rimuovere strumento perfusione e decapitare il animali. Fare un postero tagliare la linea mediana del cranio, e poi sbattere il cranio per esporre la cavità del cranio 10. </li><li> Rimuovere il cervello con una spatola dalla cavità cranio e posizionare il cervello in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 25 ml di 4% paraformaldeide. Mantenere il cervello all&#39;interno del tubo-paraformaldeide contenente 4 ºC frigorifero per 24 ore. </li><li> Spostare il cervello in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 25 ml di soluzione di saccarosio al 30% a 4 ° C per 3 giorni. Infine, conservare il cervello in sacchetti di plastica a -80 ° C fino all&#39;uso. </li><li> Montare il cervello su un mandrino con i media embedding e congelare i media incorporamento contenenti cervello in un criostato ad una temperatura di -26 ° C. Tagliare il congelato frescon cervello in 20 sezioni micron e il cervello paraformaldeide-preceduti in sezioni di 10 micron. Trasferire la sezione di un vetrino da microscopio RT toccando la slitta alla sezione. </li><li> Asciugare a temperatura ambiente per 4 ore. Conservare i vetrini sezione in un sacchetto stretto sigillato a -80 ° C fino all&#39;uso. </li></ol></li><li> Disidratazione <ol><li> Prendere diapositive dal -80 ° C freezer e assegnare sezioni in una delle tre prove: HT2A, ppiB (controllo positivo) o dapB (controllo negativo); marchio e le sezioni di etichette con una penna a sfera (non usare una matita). Immergere i vetrini in 100% di alcol a temperatura ambiente per 5 minuti. Asciugare i vetrini per 5 minuti in una cappa aspirante. </li></ol></li><li> Pretrattamento <ol><li> Pipettare 20 ml di pretrattamento-1 (reagente inattivazione della fosfatasi alcalina), alle sezioni su vetrini. Porre i vetrini su una cremagliera in un vassoio di umidità (notare che il vassoio è coperta con un coperchio per mantenere una elevata umidità per prevenire evaporazione dal solutio reazionen). </li><li> Agitare delicatamente il vassoio di umidità su un agitatore orizzontale a bassa velocità per 10 min. Lavare i vetrini due volte con acqua bidistillata (DDH 2 O) per 2 min. Immergere il vetrino in un becher da 200 ml contenente 150 ml del pretrattamento-2 reagente (rottura dei legami trasversali indotte da fissazione paraformaldeide). Lessare i vetrini per un totale di 5 min a 100 ° C (ripristino indotta dal calore della struttura dell&#39;RNA 11). </li><li> Lavare i vetrini due volte con DDH 2 O per 2 min. Porre i vetrini in 100% di alcol per 5 min. Essiccare i vetrini per 5 min in cappa. Utilizzare una penna idrofobico per disegnare un cerchio attorno all&#39;area selezionata nella sezione di tessuto (ad esempio, strutture non corticali, tra talamo e ipotalamo come delineate nella figura 2). </li><li> Pipettare 10 ml di pretrattamento-3 reagente (aumenti di penetrazione della sonda) per ogni area selezionata, e coprire il vassoio di umidità con il coperchio. Posizionare il vassoio nel forno di ibridazioneequipaggiato con lo shaker orizzontale e impostare la temperatura del forno a 40 ° C; scuotere delicatamente il cassetto per 30 min. Lavare i vetrini due volte con DDH 2 O per 2 min. </li></ol></li></ol> 2. Ibridazione e Amplificazione <ol><li> Pipettare 10 ml di HTR2A, ppiB e dapB reagenti sonda, rispettivamente, sulle aree selezionate. Coprire il vassoio di umidità con il coperchio per evitare l&#39;evaporazione del reagente. Agitare delicatamente l&#39;agitatore orizzontale impostato a bassa velocità. Incubare i vetrini a 40 ° C in forno per 2 ore. </li><li> Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di amplificazione-1 reattivo su ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 30 min. </li><li> Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-2 per ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 15 minuti. </li><li> Lavare i vetrini due volte with un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di amplificazione-3 reattivo su ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 30 min. </li><li> Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-4 per ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 15 minuti. </li><li> Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-5 per ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-6 su ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 15 min. Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. </li></ol> 3. Rilevamento segnale <ol><li> Pipettare 10 ml di reagente Red a ciascuna area selezionata (Si noti che il reagente è una miscela di rosso-B e Red-A con un rapporto 1:60 e deve essere utilizzato imediatamente). Posizionare il vetrino nel cassetto umidità sulla agitatore orizzontale a temperatura ambiente e agitare delicatamente a bassa velocità per 10 min. </li><li> Lavare i vetrini due volte con (DDH 2 O) per 10 min. Essiccare i vetrini a 60 ° C in forno per 15 min. Porre i vetrini in xilene sotto la cappa per 5 min. Dispensare 20 ml di mezzo di montaggio a base di xilene, su ogni area selezionata e coprire con un coprioggetto. </li></ol> 4. Acquisizione Immagine <ol><li> Prendere microfotografie digitali delle aree selezionate (ad esempio, ipotalamo, le figure 1 e 3) con un ingrandimento di 4 × 20 × e lenti dell&#39;obiettivo. Salvare il file di immagine. </li></ol> Analisi Particle 5. Immagine <ol><li> Trascinare e rilasciare il file immagine nella finestra di ImageJ principale. Vai alla barra dei menu e selezionare &#39;Immagine&#39;, successiva selezionare &#39;Tipo&#39; dal menu a discesa, quindi selezionare &#39;8-bit&#39;. </li><li> Seleziona &#39;Regola&#39;, quindi selezionare &#39;Threshold &#39;per aprire la finestra di dialogo. Regolare il valore barra inferiore della finestra di dialogo in modo che il fondo indesiderato viene rimosso. Vai alla barra dei menu e selezionare &#39;Analizza&#39;, quindi selezionare &#39;Analizza Particelle&#39; per aprire una seconda finestra di dialogo. </li><li> Impostare la dimensione delle particelle a 10, prossimo selezionare &#39;Mostra delinea&#39; e selezionare &#39;Mostra risultati &quot;e&quot; scatole Riassumere&#39;. Infine, fare clic su &#39;OK&#39; per visualizzare i dati delle particelle nelle finestre di dialogo. </li></ol> 6. Foglio di calcolo <ol><li> Inserire i dati nel foglio Excel e la media dei numeri di particelle nel gruppo SAL come linea di base. Calcolare il livello percentuale di ogni sezione e fare un grafico di conseguenza (Figura 4). </li></ol>

<ol><li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosomatics%22%5BJournal%5D)">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li>
<li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome%2C+severe+rhabdomyolysis%2C+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung%22%5BJournal%5D)">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li>
<li>Bosch, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verbal+memory+deficits+are+correlated+with+prefrontal+hypometabolism+in+18FDG+PET+of+recreational+MDMA+users%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+On%22%5BJournal%5D)">Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users.</a> PLoS On. 8, e61234(2013).</li>
<li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychopharmaco%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li>
<li>Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+radioactive+in+situ+hybridization+using+full+length+hydrolyzed+riboprobes+to+detect+%CE%B12+adrenoceptor+subtype+mRNAs+in+adult+and+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Proto%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain.</a> Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).</li>
<li>Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-ethylmaleimide+%28NEM%29+can+significantly+improve+in+situ+hybridization+results+using+35S-labeled+oligodeoxynucleotide+or+complementary+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes.</a> J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diag%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+E%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> J Vis E. , (2014).</li>
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<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pericytes+and+capillary+diameter+in+brain+slices+and+isolated+retinae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proto%22%5BJournal%5D)">Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae.</a> Nat Proto. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+techniques%3A+current+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).</li>
<li>Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+in+rat+dentate+granule+cells%3A+comparison+between+fresh+and+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Method%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue.</a> J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).</li>
<li>Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+messenger+RNA+expression+by+in+situ+hybridization+using+RNA+probes+synthesized+via+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription.</a> Method. 52, 322-331 (2010).</li>
<li>Mijnster, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+cellular+distribution+of+serotonin+5-hydroxytryptamine2a+receptor+mRNA+in+the+nucleus+accumbens%2C+olfactory+tubercle%2C+and+caudate+putamen+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neuro%22%5BJournal%5D)">Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat.</a> J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region-specific+alterations+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+serotonin+transporter+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroche%22%5BJournal%5D)">Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice.</a> J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).</li>
<li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Re%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li>
<li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacolog%22%5BJournal%5D)">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li>
<li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+%28%27Ecstasy%27%29+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Una delle principali preoccupazioni del test di ibridazione in situ è quella di scegliere le tecniche appropriate utilizzate per la conservazione dell'RNA a causa degli enzimi RNasi. È noto che questi enzimi sono ampiamente presenti nelle cellule e nell'ambiente, il che può influenzare i risultati. Tuttavia, l'attività enzimatica può essere rapidamente distinta posizionando il tessuto nella soluzione di ghiaccio secco/alcol5,12. Sebbene la conservazione rapida sia fondamentale per l'ibridazione utiliz...

La sindrome da serotonina (5-idrossitriptamina; 5-HT) è un disturbo neurologico acuto causato da farmaci che promuovono la 5-HT come gli antidepressivi1, mentre si verifica anche in situazioni di uso di MDMA per scopi ricreativi2. I meccanismi molecolari responsabili degli sbalzi d'umore, dei deficit di apprendimento e di memoria che si verificano in associazione con la sindrome acuta non sono ben compresi3,4. L'ibridazione in situ è un potente strumento di ricerca che consente l'individuazione e la quantificazione di specifici mRNA espressi potenzialmente a livello di singola cellula. Il modo convenzionale per eseguire l'ibridazione in situ consiste nell'utilizzare una ribosonda marcata con radioattività che ibrida specificamente il gene di interesse. Tuttavia, uno dei principali svantaggi è che il metodo richiede fasi complicate e dispendiose in termini di tempo per la preparazione della sonda e l'ibridazione, nonché l'accesso a tessuti freschi congelati mantenuti in un ambiente privo di RNasi5,6. 
Le sonde oligonucleotidiche sono state recentemente sviluppate per ibridare frammenti di RNA più corti di quelli richiesti per le ribosonde7. Inoltre, le sonde producono un basso segnale di fondo senza sacrificare la specificità8. Questa tecnologia di sonda di nuova concezione può essere utilizzata nell'ibridazione in situ su tessuti cerebrali con prefisso di paraformaldeide comunemente disponibili nei laboratori di immunocitochimica.
Qui, descriviamo un protocollo per l'ibridazione in situ utilizzando sonde oligonucleotidiche su cervello di ratto con prefisso di paraformaldeide e confrontiamo i risultati con quelli osservati in un cervello fresco congelato5,6. Questo protocollo viene utilizzato per testare l'ipotesi che l'abuso di sostanze MDMA causi cambiamenti nel gene del recettore 5-HT2A htr2a mRNA nel cervello. Abbiamo iniziato la procedura con il trattamento con MDMA seguito dalla perfusione tissutale di paraformaldeide dell'animale, dall'ibridazione in situ della sonda thr2a e dall'analisi dei dati. Si noti che il dapB (il gene batterico che codifica per la diidrodipicolinato reduttasi) è usato come controllo negativo e il ppiB (gene di housekeeping che codifica per la peptidilprolil isomerasi B) come controllo positivo.

<table><tbody><tr><td>RNAscope Negative Control Probe-DapB</td><td>Diagnostica cellulare avanzata, INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Pretreat 4</td><td>Diagnostica cellulare avanzata, Kit</td> di reagenti INC <td>320046</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD - Rosso</td><td>Diagnostica cellulare avanzata, INC</td><td>310036</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope - Rn-Ppib</td><td>Diagnostica cellulare avanzata, INC</td><td>313921</td><td></td></tr><tr><td>Rat Htr2a</td><td>Diagnostica cellulare avanzata, INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orizzontale</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>Forno di ibridazione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Penna idrofobica</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>Provis AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

rapido<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su paraformaldeide prefissa cervello di ratti con sindrome serotoninergica

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

'3,4-Metilendiossimetamfetamina (MDMA; ecstasy) può causare cambiamenti region-specifici nell'espressione dell'mRNA serotoninergico a causa della sindrome acuta da serotonina (5-idrossitriptamina; 5-HT). Questa ipotesi può essere testata utilizzando l'ibridazione in situ per rilevare il gene del recettore della serotonina 5-HT2A htr2a. In passato, tali procedure, che utilizzavano la ribosonda radioattiva, erano difficili a causa del complicato flusso di lavoro che richiede diversi giorni per essere eseguito e della difficoltà aggiuntiva che la tecnica richiedeva l'uso di tessuti freschi congelati mantenuti in un ambiente privo di RNasi. Recentemente, lo sviluppo di sonde corte di oligonucleotidi ha semplificato le procedure di ibridazione in situ e ha permesso l'uso di sezioni cerebrali con prefisso di paraformaldeide, che sono più ampiamente disponibili nei laboratori. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato utilizzando sonde oligonucleotidiche non radioattive sui tessuti cerebrali prefissati. Le sonde di ibridazione utilizzate per questo studio includono dapB (un gene batterico che codifica per la diidrodipicolinato reduttasi), ppiB (un gene di housekeeping che codifica per la peptidilprolil isomerasi B) e htr2a (un gene della serotonina che codifica per i recettori 5-HT2A). Questo metodo è relativamente semplice, economico, riproducibile e richiede meno di due giorni per essere completato.

Usando le sonde oligonucleotidi RNA (&lt;25 nt), ibridazione può essere rilevato come punti rossi nelle cellule dell&#39;ipotalamo preparate dal cervello paraformaldeide-prefissato e freschi congelati. Le molecole di mRNA HTR2A sono presenti in alcune cellule (indicati dalle frecce solidi), ma non altri (frecce aperti). Abbiamo osservato che non vi è alcuna differenza tra la paraformaldeide-prefissato e tessuti freschi congelati (Figura 1). Un ibridazione successo può essere valutato per primo ...

Questo protocollo descrive un metodo di ibridazione in situ rapido e semplificato ideale per il cervello con prefisso di paraformaldeide, riducendo così la necessità di passaggi complessi prolungati durante l'utilizzo di tessuti freschi congelati. Il metodo è convalidato utilizzando l'identificazione del gene del recettore della serotonina 5-HT2A htr2a nei ratti.

Rapido<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'ibridazione in situ rapida su tessuto cerebrale fissato con paraformaldeide. Ciò viene ottenuto innanzitutto disidratando le sezioni di tessuto cerebrale e trattando le sezioni con i reagenti di pretrattamento uno, due e tre. Il secondo passaggio consiste nell'ibridare le sezioni con sonde oligonucleotidiche primarie e successivamente con le sonde seconda, terza e quarta.Successivamente, aggiungere il substrato rosso rapido per rilevare l'RNA bersaglio. L'ultimo passaggio consiste nel quantificare il livello dei segnali di mRNA mediante il software Image J. Infine, le variazioni nell'espressione genica dell'RNA possono essere ottenute confrontando i gruppi sperimentali e di controllo.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che è relativamente semplice, economica, riproducibile e richiede meno di due giorni per essere completata. Questo lavoro è stato sviluppato da me e da John Jay Lenan della Ross University School of Veterinary Medicine e da Jean Soza e RU Tao del College of Medicine della Florida Atlantic University. In questa procedura, prelevare quattro vetrini da cassette per vetrini conservate nel congelatore a meno 80 gradi Celsius.Assegnare le sezioni ai test di P-P-I-B-D-A-P-B e HT due geni A, marcare e etichettare con una penna a sfera. Successivamente, immergere i vetrini in alcol al 100% a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi asciugare i vetrini per cinque minuti nella cappa per la pre-trattamento, aggiungere con una pipetta 20 microlitri del reagente di pre-trattamento uno su ciascuna sezione, posizionare i vetrini su un supporto in un vassoio umido.Agitare delicatamente il vassoio dell'umidità su un agitatore orizzontale a bassa velocità per 10 minuti. Quindi lavare i vetrini due volte con acqua doppio distillata per due minuti. Immergere i vetrini in un becher da 1000 millilitri contenente 450 millilitri del reagente di pretrattamento due.Successivamente, far bollire i vetrini per un totale di cinque minuti a 100 gradi Celsius per ripristinare la struttura dell'RNA. Dopodiché, lavare i vetrini due volte con acqua distillata doppia per due minuti ciascuna. Posizionare i vetrini in alcol al 100% per cinque minuti.Quindi asciugare le preparazioni per cinque minuti. Nella cappa, utilizzare una penna idrofoba per tracciare un cerchio intorno all'area selezionata nella sezione di tessuto. Successivamente, pipettare 10 microlitri del reagente di pretrattamento tre su ciascuna area selezionata per aumentare la penetrazione della sonda e coprire il vassoio dell'umidità con un coperchio.Successivamente, posizionare il vassoio nel forno di ibridazione dotato di agitatore orizzontale. Impostare la temperatura del forno a 40 gradi Celsius e agitare delicatamente il vassoio per 30 minuti. Successivamente, lavare i vetrini due volte con acqua distillata doppia per due minuti ciascuna. In questo passaggio, pipettare 10 microlitri di sonda P-P-I-B-D-A-P-B o HTR two A sulle aree selezionate.Quindi coprire il vassoio dell'umidità con un coperchio per prevenire l'evaporazione del reagente. Agitare delicatamente i vetrini sullo shaker orizzontale a bassa velocità, incubandoli a 40 gradi Celsius in forno per due ore. Successivamente, lavare i vetrini due volte con il buffer di lavaggio per due minuti ogni volta, pipettando 10 microlitri del reagente di amplificazione uno su ciascuna area selezionata.Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi lavare i vetrini due volte con il buffer di lavaggio per due minuti ogni volta, aggiungere con la pipetta 10 microlitri del reagente di amplificazione due su ciascuna area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 15 minuti.Successivamente, lavare i vetrini due volte con il buffer di lavaggio per due minuti. Ogni volta, pipettare 10 microlitri del reagente di amplificazione tre su ciascuna area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi lavare i vetrini due volte con il buffer di lavaggio per due minuti. Pipettare 10 microlitri del reagente di amplificazione quattro su ciascuna area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 15 minuti.Successivamente, lavare i vetrini due volte con il buffer di lavaggio per due minuti. Pipettare 10 microlitri del reagente di amplificazione 5 su ciascuna area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti.Successivamente, lavare i vetrini due volte con il buffer di lavaggio per due minuti. Pipettare 10 microlitri del reagente di amplificazione sei su ciascuna area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 15 minuti.Quindi lavare nuovamente le preparazioni due volte con il buffer di lavaggio per due minuti ogni volta. Ora aggiungere 10 microlitri del reagente rosso in ciascuna area selezionata, posizionare le preparazioni nel vassoio umido sullo shaker orizzontale a temperatura ambiente e agitare delicatamente a bassa velocità per 10 minuti. Successivamente, lavare le preparazioni due volte con acqua doppio distillata per 10 minuti. Ogni volta, asciugare i vetrini a 60 gradi Celsius in forno per 15 minuti. Successivamente, posizionare i vetrini in xilene nella cappa per cinque minuti. Poi, pipettare 20 microlitri di un mezzo di montaggio a base di xilene su ciascuna area selezionata e coprire con un coprioggetto.In questo passaggio, trascinare e rilasciare il file immagine nella finestra principale di J. Andare sulla barra del menu e selezionare immagine. Successivamente, selezionare tipo dal menu a discesa e scegliere otto bit.Successivamente, selezionare "adjust", quindi selezionare "threshold" per aprire la finestra di dialogo. Regolare il valore della barra inferiore nella finestra di dialogo in modo da rimuovere lo sfondo indesiderato. Andare sulla barra del menu e selezionare "Analyze", quindi selezionare "analyze particles" per aprire una seconda finestra di dialogo.Impostare la dimensione delle particelle a 10. Successivamente, selezionare "mostra contorni" e selezionare "visualizza risultati" e "riepiloga caselle". Infine, fare clic su "ok" per visualizzare i dati delle particelle nelle finestre di dialogo.Per il calcolo tramite foglio elettronico, inserire i dati nel foglio Excel e calcolare la media del numero di particelle nel gruppo con soluzione salina come valore di base. Successivamente, calcolare la percentuale di ciascuna sezione e creare un grafico di conseguenza. Di seguito sono riportate le immagini al microscopio ottico dei segnali di ibridazione indicati dai punti rossi.I tessuti sono stati prefissati con paraformaldeide in ratti profondamente anestetizzati, precedentemente trattati con soluzione fisiologica e MDMA. Le sonde oligonucleotidiche utilizzate sono D-A-P-B-P-P-I-B e HT due A. Questa figura mostra l'effetto sull'espressione genica ipotalamica di HT due A in ratti precedentemente trattati con MDMA: è stata osservata una riduzione del 20% dell'espressione di HT due A. Questa tecnica facilita ai ricercatori nel campo delle neuroscienze la misurazione dell'espressione genica dell'RNA messaggero, mediante ibridazione in situ su tessuto cerebrale prefissato con paraformaldeide.

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Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Questo video mostra il rilevamento della sintesi dell'RNA del recettore della serotonina utilizzando sonde oligonucleotidiche nel tessuto cerebrale di ratto affetto da sindrome serotoninergica. Il protocollo include il pretrattamento tissutale, l'ibridazione della sonda e il rilevamento enzimatico per visualizzare e quantificare l'espressione dell'RNA del recettore della serotonina al microscopio.

Ibridazione in situ mediante sonde oligonucleotidiche per studiare l'espressione dell'RNA in sezioni cerebrali di ratto

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinazione di ibridazione a doppia fluorescenza  in situ con immunomarcatura per il rilevamento dell'espressione di tre geni in sezioni cerebrali di topo. J. Vis. Exp. (2016). Questo video dimostra l'uso dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per visualizzare l'espressione di due bersagli di RNA in sezioni cerebrali di topo. Il protocollo prevede il rilevamento sequenziale dell'RNA utilizzando sonde marcate con isotiocianato di fluoresceina e digossigenina,...

 Esecuzione dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per rilevare l'espressione genica nelle sezioni cerebrali di topo

L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) consente la visualizzazione degli RNA nelle cellule e nei tessuti. Qui mostriamo come la combinazione di RNAscope ISH con immunoistochimica o coloranti istologici possa essere utilizzata con successo per rilevare mRNA localizzati negli assoni in sezioni di cervelli di topo e umani.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Localizzare l'espressione genica in specifici tipi di cellule può essere difficile a causa della mancanza di anticorpi specifici. Qui descriviamo un protocollo per la tripla rilevazione simultanea dell'espressione genica combinando l'ibridazione in situ a doppia fluorescenza con l'immunocolorazione.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Abbiamo applicato la stimolazione magnetica transcranica ripetitiva (rTMS) all'emisfero unilaterale del cervello di ratto, posizionando una bobina a forma di 8 da 25 mm 1 cm lateralmente al vertice sulla linea biauricolare e angolando la bobina di 45°. Per rTMS è stato utilizzato un sistema di raffreddamento ad acqua interno per più di 20 minuti.

Repetitive stimolazione magnetica transcranica al unilaterale emisfero del cervello di ratto

Identificazione del recettore D1-alfa della dopamina nel nucleus accumbens è fondamentale per chiarire la disfunzione dei recettori D1 durante una malattia del sistema nervoso centrale. Abbiamo effettuato un romanzo determinazione del RNA in situ di ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in un'area specifica del cervello.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

Questo protocollo descrive un metodo per combinare l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e l'immunoistochimica a fluorescenza (IHC) in sezioni cerebrali di topo sia fresche congelate che fisse, con l'obiettivo di ottenere FISH multimarca e segnale IHC di fluorescenza. IHC ha preso di mira le proteine citoplasmatiche e attaccate alla membrana.

Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse

DetectSyn è un saggio fluorescente rapido e imparziale che misura i cambiamenti nel numero relativo di sinapsi (impegno pre e postsinaptico) tra trattamenti o stati patologici. Questa tecnica utilizza una tecnica di legatura di prossimità che può essere utilizzata sia nei neuroni in coltura che nei tessuti fissi.

DetectSyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi

Abbiamo messo a punto un saggio di ibridazione in situ Duplex per mappare le isoforme del recettore dell'insulina IR-A e IR-B nel plesso coroideo murino, superando i limiti dei metodi tradizionali. Questo approccio ad alta risoluzione rivela l'espressione specifica dell'isoforma, offrendo nuove intuizioni sulla segnalazione dell'insulina cerebrale e sulle potenziali terapie mirate all'isoforma per i disturbi neurologici.

Visualizzazione precisa dei recettori dell'insulina A e B nel cervello murino con un test di ibridazione in situ dell'RNA

Impara un metodo rapido di ibridazione in situ per tessuto cerebrale prefissato in paraformaldeide utilizzando sonde oligonucleotidiche. Questa tecnica semplificata riduce i tempi di elaborazione e consente di rilevare l'espressione genica htr2a nei ratti.

Rapido In Situ Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica (Video) | JoVE Journal

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