Rapido In Situ Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire una rapida ibridazione in C 2 su tessuto cerebrale con aldeide paraforme prefissata. Ciò si ottiene disidratando prima le sezioni di tessuto cerebrale e trattando le sezioni con uno, due e tre reagenti di pretrattamento. Il secondo passo consiste nell'ibridare le sezioni con sonde di oligonucleotidi primari e poi con la seconda, la terza e la quarta sonda.

Quindi, aggiungi un substrato rosso veloce per rilevare l'RNA bersaglio. Il passaggio finale consiste nel quantificare il livello dei segnali di mRNA con il software Image J. In definitiva, i cambiamenti nell'espressione genica dell'RNA possono essere ottenuti confrontando i gruppi sperimentali e di controllo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che è relativamente semplice, poco riproducibile e richiede meno di due giorni per essere completata. Questo lavoro è stato sviluppato da me e John Jay Lenan della Ross University School of Veterinary Medicine e Jean Soza e RU Tao del College of Medicine, Florida Atlantic University. In questa procedura, la sua disidratazione prende quattro vetrini da scatole di vetrini da microscopio conservate nel congelatore a 80 gradi Celsius negativi.

Assegnare le sezioni ai test di P-P-I-B-D-A-P-B e HT due segni di geni A ed etichettarle con una penna a sfera. Quindi, immergere i vetrini in alcol al 100% a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi asciugare i vetrini per cinque minuti nella cappa aspirante per la pipetta di pretrattamento 20 microlitri di pretrattamento un reagente per ogni sezione, posizionare i vetrini su una guida rack in un vassoio per l'umidità.

Agitare delicatamente la vaschetta dell'umidità su uno shaker orizzontale a bassa velocità per 10 minuti. Quindi lavare i vetrini due volte con acqua distillata doppia per due minuti. Immergere i vetrini in un becher da 1000 millilitri contenente 450 millilitri del reagente di pretrattamento due.

Quindi, far bollire i vetrini per un totale di cinque minuti a 100 gradi Celsius per ripristinare la struttura dell'RNA. Successivamente, lavare i vetrini due volte con acqua distillata doppia per due minuti ogni volta. Mettere i vetrini in alcool al 100% per cinque minuti.

Quindi asciugare i vetrini per cinque minuti. Nella cappa aspirante, utilizzare una penna idrofobica per disegnare un cerchio attorno all'area selezionata nella sezione del tessuto. Successivamente, pipettare 10 microlitri di reagente di pretrattamento tre in ciascuna area selezionata per aumentare la penetrazione della sonda e coprire il vassoio dell'umidità con un coperchio.

Successivamente, posizionare la teglia nel forno di ibridazione dotato di agitatore orizzontale. Impostare la temperatura del forno a 40 gradi Celsius e scuotere delicatamente la teglia per 30 minuti Successivamente, lavare le diapositive due volte con doppia acqua distillata per due minuti ogni volta. In questa fase, pipettare 10 microlitri di P-P-I-B-D-A-P-B o HTR due sonde A sulle aree selezionate.

Quindi coprire la vaschetta dell'umidità con un coperchio per evitare l'evaporazione del reagente. Agitare delicatamente i vetrini sull'agitatore orizzontale a bassa velocità mentre li incubano a 40 gradi Celsius in forno per due ore. Successivamente, lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti ogni volta, pipettare 10 microlitri di un reagente di amplificazione su ciascuna area selezionata.

Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti ogni volta, pipettare 10 microlitri di reagente di amplificazione due su ciascuna area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 15 minuti.

Successivamente, lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti. Ogni volta, pipettare 10 microlitri di tre reagenti di amplificazione su ciascuna area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti. Pipettare 10 microlitri di quattro reagenti di amplificazione su ogni area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a 40 gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi, lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti. Pipet 10 microlitri di cinque reagenti di amplificazione su ogni area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti.

Successivamente, lavare due volte i vetrini con un tampone di lavaggio per due minuti. Pipet 10 microlitri di sei reagenti di amplificazione su ogni area selezionata. Agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 15 minuti.

Quindi lavare nuovamente i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti ogni volta. Ora pipettare 10 microlitri di reagente rosso in ogni area selezionata, posizionare i vetrini nel vassoio dell'umidità sull'agitatore orizzontale a temperatura ambiente e agitare delicatamente a bassa velocità per 10 minuti. Quindi lavare i vetrini due volte con acqua distillata doppia per 10 minuti.

Ogni volta, asciugare i vetrini a 60 gradi Celsius in forno per 15 minuti. Successivamente, posizionare i vetrini in xilene nella cappa aspirante per cinque minuti. Quindi, pipettare 20 microlitri di terreno di montaggio a base di xilene su ciascuna area selezionata e coprire con un vetrino coprioggetto.

In questo passaggio, trascina e rilascia il file immagine nella finestra J dell'immagine principale. Vai alla barra dei menu e seleziona l'immagine. Quindi, seleziona il tipo dal menu a discesa e seleziona otto bit.

Quindi, seleziona Regola, quindi seleziona la soglia per aprire la finestra di dialogo. Regola il valore della barra inferiore nella finestra di dialogo in modo che lo sfondo indesiderato venga rimosso. Vai alla barra dei menu e seleziona Analizza, quindi seleziona analizza particelle per aprire una seconda finestra di dialogo.

Imposta la dimensione delle particelle su 10. Quindi, seleziona Mostra contorni e seleziona Visualizza risultati e caselle di riepilogo. Infine, fai clic su OK per visualizzare i dati delle particelle nelle finestre di dialogo.

Per il calcolo del foglio di calcolo, inserire i dati nel foglio Excel e calcolare la media del numero di particelle nel gruppo salino come linea di base. Quindi calcola il livello percentuale di ogni sezione e crea un grafico di conseguenza. Ecco le viste al microscopio leggero dei segnali di ibridazione indicati dai punti rossi.

I tessuti sono stati preceduti da aldeide paraforme in ratti profondamente anestetizzati precedentemente trattati con soluzione salina e MDMA. Le sonde oligonucleotidiche utilizzate sono D-A-P-B-P-P-I-B e HT due A.Questa figura mostra l'effetto sull'espressione genica HT 2 A ipotalamica nei ratti precedentemente trattati con MDMA e una riduzione del 20% in HT 2, è stata osservata un'espressione. Questa tecnica rende più facile per i ricercatori nel campo delle neuroscienze misurare l'espressione genica del messaggero Ra, utilizzando la situ izzazione su paraforma, il tessuto cerebrale prefissato all'altezza.