Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca 2+ E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso
10 settembre 2015
Questo articolo viene descritto il protocollo dettagliato e le attrezzature necessarie per la mappatura ottica doppio di transmembrana potenziale (V m) e senza reticolo intra-sarcoplasmatico (SR) Ca 2+ nel cuore di coniglio Langendorff-perfusione. Questo metodo consente l'osservazione diretta e la quantificazione delle Vm e SR Ca 2+ dinamica nel cuore intatto.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare otticamente simultaneamente il reticolo intrasarcoplasmatico libero, il calcio e il potenziale transmembrana nel cuore di coniglio perfuso LOR isolato intatto. Ciò si ottiene asportando prima il cuore del coniglio e incannulando l'aorta per la perfusione lanorica retrograda. Il secondo passo consiste nell'eliminare la contrazione aggiungendo un disaccoppiamento della contrazione di eccitazione all'otto perfu.
Successivamente, la perfusione viene commutata in un circuito di ricircolo di piccolo volume e viene aggiunto un indicatore di calcio a bassa affinità a temperatura ambiente. I passaggi finali consistono nel riscaldare il cuore a 37 gradi Celsius utilizzando il circuito di profusione ad ampio volume e nell'aggiungere il colorante sensibile alla tensione. Pertanto, durante l'esperimento, i cambiamenti nel calcio e nel potenziale transmembrana vengono misurati eccitando il cuore con la luce blu e misurando la luce emessa con telecamere CM OS ad alta velocità.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente ai ricercatori di sondare direttamente il reticolo sarcoplasmatico o SR per brevi dinamiche del calcio senza interferenze da segnali di calcio transmembrana. Questo metodo può anche aiutare a rispondere a domande chiave relative al ruolo della gestione del calcio SR nel contribuire alle aritmie, perché il potenziale transmembrana viene registrato contemporaneamente al calcio SR, Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché i segnali ottici di calcio SR sono di ampiezza molto bassa. Pertanto, il corretto caricamento dell'indicatore di calcio è essenziale Per questo protocollo, è necessario avere a portata di mano una soluzione di tiro appena fatta.
Quattro litri saranno sufficienti. Non mescolare le soluzioni madre concentrate senza diluizione. Avere anche le altre soluzioni preparate in anticipo come indicato nel protocollo di testo bolla la fornitura di tyros con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica, e regolare il flusso di gas per impostare il pH della soluzione molto vicino a 7,4.
La soluzione deve essere a temperatura ambiente. Preparare il sistema di perfusione a ricircolo di L andorf posizionando un filtro in nylon in linea con pori da 11 micron per filtrare lo stato di perfu. Ora adescare il sistema di profusione principale con circa due litri di pneumatico ossigenato.
Il volume totale di due litri include la soluzione nel serbatoio. Successivamente, preparare e adescare una breve linea di profusione che bypassi il serbatoio della soluzione al fine di creare un circuito di ricircolo di piccolo volume per l'influenza oh cinque N am. Il download del volume totale nel sistema di ricircolo più piccolo dovrebbe essere di circa 150 millilitri.
Per preparare il sistema di monitoraggio della pressione, collegare un trasduttore di pressione alla linea di profusione e collegare l'uscita del trasduttore a un amplificatore a ponte trans. Ora accendi il sistema di acquisizione dati. Impostarlo per monitorare continuamente l'ECG e la pressione di profusione.
Quindi, regolare la pressione di perfusione di base a zero millimetri di mercurio. Infine, allineare la fotocamera di mappatura ottica come descritto nel protocollo di testo. Per iniziare, fissare il coniglio e anestetizzarlo con pentobarbital, insieme a un bolo di 1000 unità di eparina.
Copri gli occhi per calmare il coniglio. Inizia con un'incisione sulla linea mediana per esporre lo sterno e le costole usando le forbici a punta smussata. Taglia lo sterno tra lo xifoide e il meibo.
Quindi, apri con cura lo sterno senza danneggiare il cuore e allarga le costole per esporre il cuore. Quindi rimuovere rapidamente l'intero blocco cuore-polmone tagliando via tutti i vasi e i tessuti circostanti. Trasferire il blocco cuore-polmone in circa 100 millilitri di soluzione di tirolo ghiacciata.
Nel blocco di tessuto asportato, localizzare l'aorta e tagliare l'aorta ascendente appena prossimalmente ai tre rami dell'arco aortico. Quindi incannulare l'aorta con la cannula di otto gauge attaccata al sistema di profusione. Fissare l'aorta alla cannula con un pezzo di sutura di seta USP zero.
Dopo aver fissato la cannula, sezionare con cura la trachea, i polmoni e il grasso epicardico. Quindi, identificare la valvola mitrale e utilizzare con attenzione pinze e forbici affilate per danneggiare o rimuovere un foglietto. Pertanto, non può verificarsi una congestione della soluzione nel ventricolo sinistro.
Continuare immergendo il cuore nella camera di perfusione orizzontalmente con il lato anteriore rivolto verso l'alto. Posizionare la cannula su un pezzo di sarda. Fissare la cannula con perni a forma di U inseriti attraverso il pezzo di sarda e nel fondo in silicone della capsula di perfusione.
Questo impedirà al cuore di muoversi. Durante l'imaging, è possibile utilizzare un piccolo perno per insetti per stabilizzare l'apice, se necessario, misurare la quantità di soluzione tireconica utilizzata durante l'incannulamento e sostituirla con una soluzione fresca per mantenere la soluzione circolante totale a due litri. Ora immergi completamente gli elettrodi ECG nella vasca da bagno su entrambi i lati del cuore, ma non a contatto con il cuore.
Quindi verificare che questo renda una derivazione normale una morfologia ECG. Nel frattempo, mantenere la pressione aortica a 60-70 millimetri di mercurio regolando il flusso di perfusi tra 25 e 35 millilitri al minuto. Ora, spegni le luci della stanza e aggiungi da 0,3 a 0,6 millilitri di soluzione stock di statine BLE all'otto PERFU per una concentrazione finale da 10 a 20 micromolari.
Dopo 10-15 minuti, le contrazioni cardiache dovrebbero cessare. Quindi passare al sistema a profusione per piccoli volumi. Una delle chiavi per il successo dell'imaging SR del calcio è il corretto caricamento del colorante flow five N am.
Ciò richiede una piccola perfusione di volume per ottenere un'elevata concentrazione di colorante e condizioni di temperatura ambiente. Per evitare l'esterificazione D della D nel citosol, ora preparare 500 microlitri di soluzione di carico flu O five N am e mescolarla con 500 microlitri di soluzione stradale. Quindi aggiungilo agli otto PERFU.
Lasciare che il download proceda per 45 minuti, quindi accendere il bagno d'acqua circolante per riscaldare il sistema a 37 gradi Celsius. Dopo un'ora di download, torna al volume più grande di Perfu otto. Quindi, mescolare 50 microlitri del colorante sensibile alla tensione RH 2 37 in un millilitro di tiro caldo.
Iniettare lentamente questo nel sistema per circa cinque minuti e procedere con la mappatura ottica del cuore. Per iniziare, focalizzare le telecamere di mappatura ottica sul campo appropriato per ridurre il movimento sulla superficie PERFU otto. Applicare un vetrino coprioggetti sulla soluzione.
Ora regola il fascio di luce LED per fornire un'illuminazione uniforme al cuore. Per ogni registrazione ottica, impostare il protocollo di stimolazione desiderato. Accendi la spia di eccitazione e raccogli da uno a quattro secondi di dati entro una o due ore.
Il rumore del colorante fuoriuscito metterà fine all'esperimento. Quindi lavare il sistema con acqua deionizzata. Quindi etanolo al 70% e terminare con un altro risciacquo di acqua deionizzata.
Utilizzando il protocollo descritto, è possibile separare la separazione spettrale del segnale del potenziale transmembrana e del reticolo sarcoplasmatico o del segnale del calcio SR. Sono state registrate anche tracce ottiche durante la stimolazione continua. Le mappe di attivazione sono state quindi costruite a partire dai dati tracciando il tempo di attivazione di ciascun pixel.
Su un grafo isocrona, c'è un ritardo tipico da otto a 10 millisecondi tra i due segnali. È stato possibile quantificare la variazione relativa della SR diastolica. Carico di calcio e SR sistolica Ampiezze di rilascio del calcio a vari cicli di stimolazione. È stato osservato un trattamento patologico del calcio SR in seguito all'applicazione dell'agonista del recettore beta adrenergico isoproterenolo.
Le frecce rosse indicano una chiara perdita di calcio dalla sr. In queste condizioni, può verificarsi l'innesco mediato dal calcio dei potenziali d'azione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come eseguire la mappatura ottica simultanea del potenziale transmembrana e dei segnali SR di calcio nel cuore di coniglio perfuso di Lang Endorf intatto.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per la mappatura ottica duale del potenziale transmembrana e del calcio libero intra-sarcoplasmatico nel cuore di coniglio perfuso in Langendorff. Questo metodo consente l'osservazione diretta e la quantificazione di queste dinamiche nel cuore intatto.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Fisiopatologia cardiovascolare
- Tecniche di imaging ottico
Sfondo
- Comprendere le dinamiche cardiache è fondamentale per studiare la funzione cardiaca.
- Il potenziale transmembrana e i livelli di calcio sono indicatori chiave della salute cardiaca.
- La mappatura ottica fornisce un metodo non invasivo per studiare questi parametri.
- La tecnica di perfusione Langendorff permette studi su cuori isolati.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per la mappatura ottica simultanea di V m e SR Ca 2+.
- Migliorare la comprensione dell'elettrofisiologia cardiaca.
- Fornire un protocollo dettagliato per i ricercatori nel campo.
Metodi utilizzati
- Escissione del cuore di coniglio e cannulazione dell'aorta per perfusione retrograda.
- Utilizzo di un disaccoppiatore eccitazione-contrazione per eliminare la contrazione.
- Passaggio a un circuito di perfusione ricircolante con un indicatore del calcio a bassa affinità.
- Riscaldamento del cuore e aggiunta di un colorante sensibile al voltaggio per la mappatura ottica.
Risultati principali
- Misurazione simultanea di successo delle dinamiche di V m e SR Ca 2+.
- Dimostrazione dell'efficacia della tecnica di mappatura ottica.
- Fornitura di approfondimenti sulla relazione tra calcio e potenziale transmembrana.
- Stabilimento di un protocollo affidabile per futuri studi.
Conclusioni
- La tecnica di mappatura ottica duale è efficace per studiare le dinamiche cardiache.
- Questo metodo può far progredire la ricerca in fisiopatologia cardiaca.
- Le future applicazioni potrebbero includere studi su malattie cardiache.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables direct, simultaneous measurement of intra-sarcoplasmic reticulum calcium and transmembrane potential in intact cardiac tissue, providing mechanistic insight into excitation-contraction coupling and arrhythmogenic substrates. By resolving spatial and temporal dynamics of SR Ca2+ handling in a physiologically relevant model, it supports target validation and de-risking in cardiovascular drug discovery. The approach bridges molecular mechanisms with tissue-level phenotypes, enhancing predictive confidence in preclinical safety and efficacy assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying SR Ca2+ load and release dynamics under pathophysiological stress, such as beta-adrenergic stimulation.
- Operational Value: Enables functional validation of targets involved in calcium handling, reducing mechanistic ambiguity in early target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with dual-readout capability for assessing compound effects on both electrophysiology and calcium homeostasis.
- Operational Value: Supports assay standardization through simultaneous Vm and SR Ca2+ monitoring, improving reproducibility in ion channel and calcium modulator screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links molecular perturbations to tissue-level arrhythmogenic phenotypes, enabling disease-relevant system modeling for translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying pro-arrhythmic signals early in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical safety profiling, particularly for compounds affecting cardiac ion channels or calcium regulatory proteins.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing bidirectional relationships between Vm and SR Ca2+ under pacing and pharmacological challenge.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs that allow comparison of test compounds against control conditions in a standardized format.
- Analytics: Provides high-resolution spatiotemporal measurements of calcium transients and action potential dynamics, enabling comparative analysis across experimental groups.
- Translational Research: Connects findings to preclinical continuity by modeling arrhythmogenic substrates observed in disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiac safety pharmacology and mechanism-of-action studies across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of SR Ca2+ handling and its electrophysiological consequences.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via dual-parameter optical mapping in a controlled Langendorff-perfused system.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by detecting calcium-mediated arrhythmogenic triggers before costly late-stage failures.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on SR calcium stability and transmembrane stability.
Implementation Considerations
- Expertise in optical mapping, perfusion techniques, and fluorescent dye handling is required for successful signal acquisition.
- Instrumentation includes high-speed CMOS cameras, LED excitation systems, and perfusion setups capable of recirculating and large-volume modes.
- Cross-team standardization depends on consistent dye loading, temperature control, and pacing protocols across laboratories.
- Adaptation to other model systems (e.g., rat, human tissue) may require optimization of indicator concentration and perfusion parameters.
- Practical limitations include low signal amplitude of SR calcium indicators, necessitating careful dye loading and minimization of cytosolic interference.
