Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare simultaneamente in modo ottico il calcio libero all'interno del reticolo sarcoplasmatico e il potenziale transmembrana nel cuore isolato di coniglio perfuso con LOR. Questo risultato si ottiene prima asportando il cuore di coniglio e canulando l'aorta per la perfusione retrograda con lanor. Il secondo passaggio consiste nell'eliminare la contrazione aggiungendo un agente di disaccoppiamento eccitazione-contrazione alla perfusione.

Successivamente, la perfusione viene commutata su un circuito chiuso a piccolo volume e viene aggiunto un indicatore del calcio a bassa affinità a temperatura ambiente. I passaggi finali consistono nel riscaldare il cuore a 37 gradi Celsius utilizzando il circuito di perfusione a grande volume e nell'aggiungere il colorante sensibile alla tensione. Pertanto, durante l'esperimento, le variazioni della concentrazione di calcio e del potenziale transmembranario vengono misurate eccitando il cuore con luce blu e rilevando la luce emessa mediante telecamere CMOS ad alta velocità.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente agli sperimentatori di esaminare direttamente il reticolo sarcoplasmatico, o SR, per brevi dinamiche del calcio senza interferenze da segnali transmembrana del calcio. Questo metodo può inoltre contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo al ruolo della gestione del calcio da parte del SR nel favorire le aritmie, poiché il potenziale transmembrana viene registrato simultaneamente al calcio del SR. Generalmente, le persone alle prime armi con questa tecnica incontreranno difficoltà perché i segnali ottici del calcio nel SR hanno un'ampiezza molto bassa. Pertanto, un corretto caricamento dell'indicatore del calcio è essenziale. Per questo protocollo, è necessario avere a disposizione una soluzione di Tyro appena preparata.

Quattro litri saranno sufficienti. Non mescolare le soluzioni concentrate senza diluizione. Inoltre, preparare in anticipo le altre soluzioni come indicato nel protocollo del testo, insufflando nella soluzione di tyros una miscela gassosa al 95% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica, e regolare il flusso del gas in modo da portare il pH della soluzione molto vicino a 7,4.

La soluzione deve essere a temperatura ambiente. Preparare il sistema di perfusione L andorf a ricircolo posizionando un filtro in nylon in linea con pori da 11 micron per filtrare il perfusato. Ora iniziare la messa a punto del sistema di perfusione principale con circa due litri di tyros ossigenato.

Il volume totale di due litri include la soluzione nel serbatoio. Successivamente, preparare e inizializzare una breve linea di perfusione che bypassi il serbatoio della soluzione, al fine di creare un circuito chiuso di perfusione a volume ridotto per flu oh five N am. Il volume totale nel sistema di ricircolo più piccolo dovrebbe essere di circa 150 millilitri.

Per preparare il sistema di monitoraggio della pressione, collegare un trasduttore di pressione alla linea di perfusione e connettere l'uscita del trasduttore a un amplificatore a ponte di trasduzione. Accendere ora il sistema di acquisizione dati. Impostarlo in modo da monitorare continuamente l'ECG e la pressione di perfusione.

Successivamente, regolare la pressione di perfusione di base a zero millimetri di mercurio. Infine, allineare la telecamera per la mappatura ottica come descritto nel protocollo testuale. Per iniziare, fissare il coniglio e anestetizzarlo con pentobarbital, insieme a un bolo di 1000 unità di eparina.

Coprire gli occhi per tranquillizzare il coniglio. Iniziare con un'incisione mediana per esporre lo sterno e le costole utilizzando forbici a punta smussata. Tagliare attraverso lo sterno tra il processo xifoidale e il meibomio.

Successivamente, aprire con attenzione lo sterno senza danneggiare il cuore ed espandere le costole per esporre il cuore. Quindi rimuovere rapidamente l'intero blocco cuore-polmone recidendo tutti i vasi e i tessuti circostanti. Trasferire il blocco cuore-polmone in circa 100 millilitri di soluzione di Tyro fredda con ghiaccio.

Nel blocco di tessuto escisso, individuare l'aorta e sezionare l'aorta ascendente appena prossimale ai tre rami dell'arco aortico. Successivamente, canulare l'aorta con la cannula di calibro otto collegata al sistema di perfusione. Fissare l'aorta alla cannula con un punto di sutura in seta USP zero.

Dopo aver fissato la cannula, dissezionare con cura la trachea, i polmoni e il grasso epicardico. Successivamente, identificare la valvola mitrale e utilizzare con attenzione pinze a punta e forbici per danneggiare o rimuovere una delle cuspidi. In questo modo, non può verificarsi congestione della soluzione nel ventricolo sinistro.

Procedere immergendo orizzontalmente il cuore nella camera di perfusione con il lato anteriore rivolto verso l'alto. Posizionare la cannula su un pezzo di sard. Fissare la cannula con perni a forma di U inseriti attraverso il pezzo di sard e nel fondo in silicone della piastra di perfusione.

Questo impedirà al cuore di muoversi. Durante l'acquisizione delle immagini, se necessario, è possibile utilizzare un piccolo perno da insetto per stabilizzare l'apice, misurare la quantità di soluzione tyro utilizzata durante la cannuolatura e sostituirla con soluzione fresca per mantenere il volume totale della soluzione circolante a due litri. A questo punto, immergere completamente gli elettrodi dell'ECG nel bagno su entrambi i lati del cuore, senza tuttavia farli entrare in contatto con il cuore.

Quindi verificare che ciò produca una morfologia normale dell'ECG in derivazione I. Nel frattempo, mantenere la pressione aortica a 60-70 millimetri di mercurio regolando il flusso di perfusione tra 25 e 35 millilitri al minuto. Ora, spegnere le luci della stanza e aggiungere 0,3-0,6 millilitri della soluzione madre di BLEs statin al PERFU eight per ottenere una concentrazione finale di 10-20 micromolari.

Dopo 10-15 minuti, le contrazioni cardiache dovrebbero cessare. Passare quindi al sistema di perfusione a basso volume. Una delle chiavi per un'immagineggiatura soddisfacente del calcio nel reticolo sarcoplasmatico è il corretto caricamento del colorante flow five N am.

Questo richiede una perfusione con piccolo volume per ottenere un'elevata concentrazione del colorante e condizioni di temperatura ambiente. Per evitare l'estereificazione della D nel citosol, preparare ora 500 microlitri di soluzione di carico flu O five N am e mescolarli con 500 microlitri di soluzione road. Quindi aggiungere il tutto al PERFU eight.

Lasciare procedere il download per 45 minuti, quindi accendere il bagnomaria a circolazione per riscaldare il sistema a 37 gradi Celsius. Dopo un'ora di download, passare nuovamente al volume maggiore di Perfu otto. Successivamente, mescolare 50 microlitri del colorante sensibile al voltaggio RH 2 37 in un millilitro di tyros caldo.

Iniettare lentamente questo sistema nell'arco di circa cinque minuti e procedere con la mappatura ottica del cuore. Per iniziare, mettere a fuoco le telecamere di mappatura ottica sul campo appropriato per ridurre il movimento sulla superficie PERFU otto. Far galleggiare un vetrino sulla soluzione.

Ora regolare il fascio di luce del LED per fornire un'illuminazione uniforme al cuore. Per ogni registrazione ottica, impostare il protocollo di stimolazione desiderato. Accendere la luce di eccitazione e acquisire da uno a quattro secondi di dati entro uno o due ore.

Il rumore causato dal colorante fuoriuscito metterà fine all'esperimento. Quindi lavare il sistema con acqua deionizzata. Successivamente con etanolo al 70% e terminare con un altro risciacquo con acqua deionizzata.

Utilizzando il protocollo descritto, è possibile separare spettralmente il segnale del potenziale transmembrana dal segnale del calcio del reticolo sarcoplasmatico o SR. Sono state inoltre registrate tracce ottiche durante il pacing continuo. Successivamente, le mappe di attivazione sono state costruite dai dati riportando il tempo di attivazione di ciascun pixel.

In un grafico isocronale, vi è un ritardo tipico di otto-dieci millisecondi tra i due segnali. È stato possibile quantificare il cambiamento relativo del carico di calcio diastolico nel reticolo sarcoplasmatico e delle ampiezze del rilascio di calcio sistolico dal reticolo sarcoplasmatico a diversi cicli di stimolazione. È stato osservato un alterato controllo del calcio da parte del reticolo sarcoplasmatico in seguito all'applicazione dell'agonista del recettore beta-adrenergico isoproterenolo.

Le frecce rosse indicano una chiara perdita di calcio dal reticolo sarcoplasmatico. In queste condizioni, può verificarsi l'attivazione mediata dal calcio dei potenziali d'azione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la mappatura ottica simultanea del potenziale transmembranario e dei segnali di calcio del reticolo sarcoplasmatico nel cuore di coniglio intatto perfuso con la tecnica di Langendorff.