Name: Svelare entropico velocità di accelerazione indotta da solventi Dynamics a membrana Enzimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Scopri la dinamica dei solventi nella catalisi enzimatica utilizzando simulazioni di dinamica molecolare e analisi dei tunnel con CAVER 3.0. Questo metodo computazionale permette di ingegnerizzare canali di trasporto dell'acqua per ottimizzare specificità e attività enzimatica.

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Il Consiglio Svedese delle Ricerche (VR) è molto apprezzato per il sostegno finanziario a questo lavoro da una sovvenzione per giovani ricercatori #621-2013-5138. Il PDC Center for High Performance Computing presso il KTH Royal Institute of Technology è riconosciuto per la fornitura di supporto computazionale.

Modellazione 1. In Silico Computer <ol><li> Scarica una struttura PDB della proteina di interesse da parte della banca dati di proteine ​​(PPB). Preparare la struttura, rimuovendo subunità in eccesso e quindi aggiungendo mancanti atomi di idrogeno e solvente esplicito utilizzando la &quot;neutralizzazione delle cellule e p K una previsione&quot; esperimento di YASARA 16. Per membrana legato ciclasi triterpenici, adeguate dimensioni della scatola acqua sono 91x67x77 Å. Regolare lo stato protonazione degli amminoacidi cataliticamente attivi manualmente. Nota: se necessario, un analogo substrato nel file PDB può essere modificato per un vero e proprio supporto utilizzando &quot;Modifica | Swap | Atom&quot; comando. </li><li> Ridurre al minimo la struttura per il comando &quot;Energia minimizzazione&quot; utilizzando il campo suite di forza AMBER 17. Utilizzare l&#39;approccio a rete particella Ewald (PME) 18 per tener conto a lungo raggio interazioni elettrostatiche. Impostare il limite per van der Waals secondoa impostazioni standard. Nota: Il comando &quot;Energia minimizzazione&quot; elimina lo stress conformazionale da una breve ripida minimizzazione discesa, quindi una ricottura simulata (timestep 2 FSEC, velocità atomo ridimensionato da 0,9 ogni 10 ° passo) viene eseguito fino a raggiungere la convergenza (cioè, il miglioramento di energia da meno di 0.012 kcal / mol per atomo durante 200 gradini). </li></ol> 2. Modello di attivo del sito Solvatazione e accesso dell&#39;acqua <ol><li> Dopo la ricottura simulata, eseguire un 20 dinamica molecolare NSEC (MD) traiettoria e generare almeno 10 immagini dalla &quot;File | Simulazione Istantanea | Salva con nome&quot; comando seguito da &quot;Simulazione On&quot;. Eseguire le simulazioni su un computer standard con condizioni al contorno periodiche sotto l&#39;insieme canonico. Mantenere la temperatura a 298 K utilizza un termostato Berendsen. </li><li> Preparare le istantanee ottenuti da 2.1 cancellando tutte le molecole d&#39;acqua ed eventuali ligandi / substrati utilizzando il4; Modifica | Elimina | Residue &quot;comando Superpose ogni snapshot individualmente sull&#39;originale PDB-struttura per la&quot;. Superpose | comando Oggetto &quot;per garantire che tutte le strutture condividono la stessa posizione spaziale Salva ogni istantanea preparata in questo modo come un nuovo progetto preliminare di bilancio. -file (utilizzando il &quot;File | Save as | PDB&quot; di comando). Nota: per modellisti esperti: uno script per automatizzare questo processo in base al modello di cui al Codice supplementare File 1. </li><li> Utilizzare le istantanee preparate (PDB) da 2.2 che sono stati allineati in 3D-spazio come input per il speleologo software 3.0 19. Per l&#39;analisi di un numero limitato di istantanee, eseguire Caver su un computer standard. Utilizzare un raggio di 0,7 Å sonda 19 per assicurare il rilevamento di gallerie che sono specifici per il trasporto di molecole d&#39;acqua. </li><li> Visualizzare i tunnel generati da speleologo 3.0 in un software di grafica molecolare. Per una facile visualizzazione di gallerie, utilizzare la macro mostrato in integrativa Codice File 2. </li></ol> 3. In Silico Enzyme Engineering di modificare i modelli di acqua e dinamiche d&#39;acqua <ol><li> Identificare le gallerie più alto ordinati secondo l&#39;intestazione &quot;ID&quot; elencato nel file di output &quot;summary.txt&quot; generato dal software speleologo 3.0. </li><li> Identificare gli aminoacidi che rivestono i tunnel più alta classifica (3.1) e che mostra una piccola catena laterale che punta verso l&#39;interno del canale mediante ispezione visiva (utilizzando il modello ottenuto dal 2,4). Identificare sostituzioni di singoli aminoacidi che bloccano il tunnel da un aumento sterico utilizzando il comando &quot;Scambia Residue&quot;. Verificare che il tunnel è ostruito da ispezione visiva, e quindi ripetendo i passi 1,2-3,1 del protocollo. </li></ol> 4. L&#39;espressione di geni mutati <ol><li> Introdurre le mutazioni nel gene wild-type da Mutagenesi PCR usando primer non sovrapposti 20. </li><li> Aggiungere DNA plasmide contenente il gene di interesse a tubos con cellule competenti di un ceppo adatto clonazione e incubare in ghiaccio per 30 min. Eseguire una trasformazione shock termico per 45 secondi in un bagno d&#39;acqua con la temperatura impostata a 42 ° C. Aggiungere 500 pl di una ricca mezzo fresco (2YT, 16 g / L di triptone, estratto di lievito 10 g / L, 5 g / L di NaCl) e incubare a 37 ° C, 200 rpm per 45 min. Effettuare una selezione placcando le cellule trasformate su piastre di agar integrati con antibiotici appropriati. </li><li> Dopo aver verificato la sequenza di DNA del gene mutato, trasformare il DNA plasmidico in un ceppo espressione utilizzando scossa di calore come descritto sopra. Per l&#39;espressione di membrana legati ciclasi triterpenici, utilizzare BL21 (DE3). </li><li> Avviare un 5 ml O cultura / N a 37 ° C del ceppo espressione 2YT-media integrato con antibiotici appropriati. </li><li> Inoculare un dibattimento in pallone sconcertato 2 L, contenente 300 ml 2YT-media integrato con antibiotici appropriati, ad una OD finale di 0,05-,09 (misurata a 600 nm). Dopo l&#39;induzione con un diametro esterno di 0,6-0.8 e l&#39;espressione della proteina, congelare il pellet di cellule e conservare a -80 ° C. <ol><li> Per di membrana ciclasi triterpenici in un vettore pD861, indurre con 0,5 a 2 mM ramnosio e 4 ore di espressione a 37 ° C per ottenere alte rese di proteine ​​21. </li></ol></li></ol> 5. membrana Estrazione con centrifuga normale e purificazione delle proteine <ol><li> Preparare i seguenti buffer: buffer di risospensione (100 potassio fosfato mM, pH 7,5 addizionato di inibitori della proteasi compresse), tampone detergente (1% (v / v) Triton X-100, potassio fosfato 50 mM, pH 7,5) e tampone di reazione (0,2 % Triton X-100, 50 mM potassio fosfato, pH 7.5). <ol><li> Per ciclasi squalene-hopene o altri enzimi legati alla membrana con pH ottimale inferiore, sostituire il fosfato di potassio nel buffer risospensione con citrato. Per tali enzimi utilizzare i seguenti buffer: buffer di detersivo (1% Triton X-100, Citrato 60 mM, pH 6,0) e tampone di reazione (citrato 0,2% Triton X-100, 60 mM, pH 6,0). Nota: se un His-tag viene utilizzato per la purificazione, integrare il buffer di risospensione con imidazolo mm 20 (concentrazione finale). </li></ol></li><li> Pesare un pellet di cellule congelate in un bicchiere di vetro. Risospendere le cellule in tampone risospensione utilizzando un omogeneizzatore ad una concentrazione finale di 0,3 g cellule / ml. Lisare le cellule risospese di ultrasuoni con un&#39;ampiezza di 80% e un impulso di 1 sec acceso e 1 sec spento. Utilizzare tre cicli ripetuti di 50 sec ciascuno. </li><li> Aggiungere tampone detersivo una concentrazione finale di 0,2% (v / v) di detersivo. Equilibrare da end-over-end miscelazione a 4 ° C per 1 ora. Recupero della frazione proteina di membrana salvando surnatante dopo una singola fase di centrifugazione a 39.000 xg per 50 min a 4 ° C. Nota: Se si utilizza His-tag purificazione, aggiungere circa 1,5 ml di Ni-NTA agarosio cellule / g e incubare per 1 ora. </li><li> Eseguire una prima purificazionepasso da uno scambio ionico o purificazione 21 His-tag. Supplemento le equilibrazione e eluizione buffer con 0,2% Triton X-100. Concentrare la proteina purificata cinque volte utilizzando filtro centrifugo Unità con un cut-off di 10 kDa. Nota: La dimensione del Triton X-100 micelle risultati in una concentrazione di detersivo ad una concentrazione finale di circa 1%. </li><li> Finalizzare la purificazione da una filtrazione su gel lucidatura passo con la proteina concentrata e una matrice compatibile con una serie di frazionamento per le proteine ​​globulari di 2 × 10 4 × 10 -8 6. Utilizzare il tampone di reazione come tampone di corsa. Misurare la quantità di proteina purificata utilizzando il kit Ultra Bradford secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 6. Cinetica <ol><li> Fare un fresco 5 soluzione madre mM di substrato in tampone di reazione. Ottenere un&#39;emulsione omogenea da ultrasuoni al 30% di ampiezza per 2-5 min. </li><li> Equilibrare un thermomixeralla temperatura di reazione desiderata. Verificare la temperatura all&#39;interno di una fiala di vetro contenente l&#39;acqua da un termometro esterno. </li><li> Per cinetiche singolo substrato, diluire il substrato emulsionato in almeno cinque fiale di vetro alla stessa concentrazione finale del substrato. <ol><li> Per uno-pot relativa cinetica con più substrati, preparare almeno cinque fiale di vetro identiche mescolando tutti i supporti in ogni fiala. Per triterpeni idrofobiche, usare concentrazioni di substrato finale nel range di 10-200 micron. </li></ol></li><li> Preincubare le fiale di vetro nel thermomixer per 10 min. Avviare la reazione aggiungendo l&#39;enzima. Un volume di reazione totale di 1 ml è adatto. Utilizzare una velocità di agitazione di almeno 1.200 giri al minuto. </li><li> Fermare le reazioni in diversi momenti con l&#39;aggiunta di 500 microlitri etilacetato spillo con 100 micron decanolo come standard di integrazione. </li></ol> 7. Estrazione e analisi termodinamica <ol><li> Estrarre le miscele di reazione divortex e agitazione manuale, le fiale di vetro vigorosamente per 1 min. Centrifugare i flaconi di vetro a 9.600 xg in una centrifuga da tavolo per 10 minuti a RT. Trasferire lo strato superiore (fase organica) ad un tubo vuoto. Aggiungere un ulteriore 500 ml di estrazione con solventi per le provette di reazione e ripetere la procedura di estrazione. </li><li> Essiccare le miscele di reazione estratti con Na 2 SO 4. Vortex per 5 secondi e lasciare che i tubi riposare per 10 minuti. Eseguire una fase di centrifugazione finale a 9.600 xg per 1 min a temperatura ambiente usando una centrifuga da tavolo. Trasferire i campioni estratti per gascromatografia (GC) fiale. </li><li> Ripetere i passaggi sotto 6,1-7,2 per ciascuna variante enzima di interessi, utilizzando almeno quattro diversi concentrazione iniziale del substrato (per cinetiche singolo substrato) e quattro diverse temperature (sia per singolo substrato e la cinetica della concorrenza). </li><li> Eseguire GC-analisi come descritto precedentemente 3. Utilizzare una colonna non polare per l&#39;analisi di hydrophobic prodotti pentaciclici. Impostare la temperatura iniziale del forno a 120 ° C e utilizzare un gradiente di temperatura di 5 ° C / min, a seconda dei prodotti e la colonna. </li><li> Integra le aree dei picchi del prodotto (s) e trasformare aree dei picchi prodotto nei corrispondenti concentrazioni del prodotto utilizzando l&#39;area dello standard di integrazione (corrispondente a 100 mM). Tracciare la concentrazione di ciascun prodotto ([P]) in funzione del tempo di reazione (t). Eseguire la regressione lineare dei punti di dati corrispondenti a meno del 10% di conversione. La velocità di reazione iniziale (V 0) è data dalla pendenza della retta secondo: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation1.jpg" /> Nota: Per una pentola relativi cinetica con più substrati, V 0 è la velocità iniziale di un particolare substrato sotto l&#39;influenza di altri substrati. </li><li> Per cinetiche substrato singoli, trama V 0 </sub&gt; / [E] contro le corrispondenti concentrazioni di substrato. Il / valore apparente k cat K M è data dalla pendenza della parte lineare del grafico secondo: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation2.jpg" /> [S] è la concentrazione di substrato e [E] la concentrazione di enzima utilizzato nella trasformazione. K cat / K M equivale alla costante catalitico sopra la costante di Michaelis. Ripetere l&#39;analisi per ciascuna temperatura e ogni variante enzima. </li><li> Per cinetiche singolo substrato, eseguire un&#39;analisi termodinamica secondo passaggio teoria dello stato 22 <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation3.jpg" /> b k è la costante di Boltzmann, h la costante di Planck, T la temperatura in Kelvin, e R la costante dei gas. Eseguire un&#39;analisi di regressione lineare della trama di ln ((k <sub&gt; cat / K M) / ((k b * T) / h))) rispetto al 1 / T. L&#39;entalpia di attivazione (Δ H ‡) è data dalla (-slope) * R e l&#39;entropia di attivazione (Δ S ‡) è data da (intercetta) * R. Nota: Analogamente, un&#39;analisi sotto saturando concentrazione del substrato può essere eseguita utilizzando k cat come tasso costante nell&#39;equazione 3. </li><li> Per uno-pot relativa cinetica con più substrati, ottenere il relativo apparente k cat / valori K M da 23: (K cat / K M) A / (k cat / K M) B = 0 V, A / V 0, B * [B] / [A] (4) per cui V 0, A si riferisce alla velocità iniziale di substrato A in concorrenza con substrato B. </li><li> Per uno-pentola relativo kinetics con più substrati, ottenere i parametri termodinamici relativi di attivazione per B, rispetto ad A come riferimento, con la regressione lineare: <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation5.jpg" /></li><li> Calcolare i parametri di attivazione assoluti per substrato B dal entalpia ed entropia di attivazione di riferimento composto A: <img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation6.jpg" /></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi più critiche per raggiungere dati termodinamici sperimentali ad alta qualità wild-type membrana enzimi e tunnel varianti sono: 1) generazione del modello di computer; 2) le proteine ​​purificate in modo omogeneo; 3) le scorte di substrato emulsionati; 4) il controllo della temperatura durante cinetiche; 5) estrazione di miscele di reazione usando standard interno. La generazione del modello di computer è notevolmente facilitata dall&#39;utilizzo di un software con interfaccia user-friendly che supporta una varietà di piattaforme. Quindi, questo protocollo si fonda sulla modellazione suite di YASARA 16 per rendere la nostra strategia accessibile anche a modellare non addetti ai lavori. Un modello di computer per l&#39;identificazione tunnel acqua deve idealmente essere basato su una struttura cristallina dell&#39;enzima di interesse 24. A questo scopo, la ricchezza di strutture cristalline disponibili nella banca dati di proteine ​​è molto vantaggioso. Nella nostra esperienza, un aspetto fondamentale per la preparazione di successo di temPiastre per l&#39;identificazione del tunnel è quello di mantenere le acque cristallografiche. E &#39;altrettanto importante utilizzare una casella di enzima solvatato durante l&#39;esecuzione di simulazioni di dinamica molecolare, che possono essere eseguiti su un normale computer. Il ciclasi triterpene da Alicyclobacillus acidocaldarius è stabile in acqua durante le simulazioni MD 3. Tuttavia, mantenere detergenti cristallografiche e / o utilizzando imita membrana cellulare sarebbe forse essere richiesto per gli enzimi potenzialmente instabili per consentire simulazioni MD estesi. E &#39;previsto che la struttura cristallina minimizzato di obiettivi altamente impegnativi potrebbe fornire informazioni importanti meccanicistica utilizzando il protocollo, anche se questo non sarebbe cogliere aspetti dinamici dell&#39;organizzazione tunnel. Caver 19 nella modalità di base, con un singolo o un numero limitato di istantanee come input, può essere usato da persone non esperte su un laptop standard. Sulla base dell&#39;esperienza 3, gallerie con un raggio strozzatura (cioè, il raggionel punto più stretto) minore di 1 Å può essere molto rilevante per l&#39;acqua, specialmente se le molecole di acqua cristallografici risiedono nel tunnel predetto (Figura 1, metà sinistra). D&#39;altra parte, un raggio collo di bottiglia più grande potrebbe implicare un tunnel per il trasporto del substrato in e fuori del sito attivo 10. Lo script di Codice supplementare file 2 possono essere utilizzate dai non esperti per la visualizzazione di gallerie previste. Esperimenti futuri rivelerà se modelli omologia saranno sufficientemente alta risoluzione per consentire lo studio atomistico delle reti idriche e dinamiche. Far luce su come eseguire simulazioni di dinamica molecolare, con e senza un legante presente nel sito attivo, influenza il processo di identificazione tunnel sarebbe anche di importanza. Cinetica di proteine ​​di membrana possono costituire una sfida formidabile 25. Il protocollo qui si basa su un protocollo di estrazione semplice membranaper ottenere l&#39;enzima di membrana senza l&#39;uso di attrezzature costose, quali un&#39;ultracentrifuga. L&#39;uso di gel filtrazione come passo lucidatura finale rimuove le particelle potenziali di membrana residua e permette di definire un ambiente detersivo adatta 25. Un aspetto fondamentale per ottenere risultati cinetici riproducibili dal protocollo è di emulsionare soluzione substrato magazzino da ultrasuoni. Semplice vortex di substrati idrofobici diluiti nel tampone di reazione dà miscele omogenee substrato detergenti. Il pipettaggio di soluzioni substrato non emulsionate porta a concentrazioni non riproducibili (confermati da GC quantitativa), che impedisce la determinazione accurata dei tassi iniziali. Al contrario, il pipettaggio di soluzioni stock correttamente emulsionate dovrebbe tradursi in analisi di regressione lineare dei tassi iniziali con R 2 nell&#39;intervallo di 0,98-0,99. Un altro aspetto importante di substrati idrofobici è il substrato solubilità apparentee disponibilità di miscele substrato detergenti. In realtà, non è stato possibile saturare ciclasi triterpenici con il substrato squalene riferimento. Per questo motivo apparente k cat / valori K M vengono presentati nel presente documento che potrebbe contenere i contributi provenienti sia vincolante e la chimica. Tuttavia, è stato dimostrato che la chimica è limitante per k cat / K M per la cascata polycyclization condotto da ciclasi triterpeniche 3. E &#39;di grande importanza per verificare la temperatura reale all&#39;interno di un flacone di vetro reazione con un termometro esterno. Eppure, attacchi lineari possono essere più poveri per le varianti con costante essenziale apparente k cat / valori K M a diverse temperature. Questo è sottolineato per la variante S168F qui (Figura 2A) con una entalpia di attivazione vicino a zero (Figura 2B e 2C). Molto small cambiamenti di temperatura-dipendenti apparente k cat / K M, potrebbero indurre incertezza nella entropia di attivazione osservata Δ S ‡ (cioè, l&#39;intercetta nelle trame lineari in Figura 2B). In linea di principio, l&#39;entropia di attivazione osservata potrebbe anche essere influenzata da una diversa abbondanza di enzimi attivi per diverse varianti, che non sarebbero rilevati misurando la concentrazione proteica. Si prevede che gli errori sperimentali sono ridotti durante la miscelazione diversi substrati in una pentola. Questo perché tutti i diversi substrati interagiscono con la stessa quantità di enzima in queste circostanze (equazione 4). L&#39;uso di un solvente di estrazione spillo con uno standard interno è importante tenere conto delle differenze durante l&#39;estrazione e / o GC-iniezione. Teoria dello stato di transizione è stato utilizzato con successo in enzimologia 26. Questo importante quadro teorico è stato originariamente desvi- reazioni unimolecolari in fase gassosa. Tuttavia, è stato dimostrato che gli enzimi lavorano principalmente abbassando l&#39;attivazione classica barriera di energia 26. Il coefficiente di trasmissione presume essere uno qui potrebbe influenzare l&#39;entalpia di attivazione misurata e / o di entropia. Il contributo di tunneling, e altri effetti non classici come riattraversare dello stato di transizione, possono contribuire circa 1000 volte alla catalisi 26 corrispondente a circa 4 kcal / mol di energia. Si può notare che l&#39;entropia di attivazione visualizzato dal wild-type enzima (16 kcal / mol a 328 K, Figura 2C) è molto più grande di tali effetti non classici causati da un coefficiente di trasmissione non uniforme. L&#39;impatto del coefficiente di trasmissione dovrebbe diminuire quando si confrontano parametri termodinamici di attivazione per tipo e tunnel varianti selvatiche mediante il protocollo. L&#39;energia libera di Gibbs di attivazione (Δ G ‡) è composed sia di un entalpico (Δ H ‡) e un entropico (- T * Δ S ‡) termine. Riorganizzazione solvente in enzimi durante la catalisi può influenzare entrambi i parametri. Il presente protocollo è prevista per facilitare lo studio di questi fenomeni con l&#39;assemblaggio di una serie di strumenti di rilevanti e utente amichevole in silico strumenti di calcolo con il necessario quadro sperimentale biofisico. Il metodo prevede di essere utile per studiare una pletora di processi enzimatici, tra catalisi da enzimi di membrana.

L&#39;acqua costituisce una pietra miliare per la chimica della vita 1. Modelli acqua e solvatazione di siti attivi enzimatici influenzano sia l&#39;entalpia e l&#39;entropia di legame 1,2 e catalisi 3 in un modo altamente complesso si estende oltre l&#39;effetto idrofobico 2,3 ligando. NMR 4, calorimetria 2 e modellistica molecolare di proteine ​​solvatate sono stati utilizzati per far luce sul ruolo delle molecole d&#39;acqua esplicite nel fornire una forza trainante per ligando associazione 5-8, la specificità e l&#39;attività 2,9,10. Qui presentiamo una metodologia unica per la valutazione sperimentale dell&#39;impatto termodinamico di spostamento solvente su catalisi enzimatica (Figura 1). La nostra strategia combinata si basa sull&#39;utilizzo di simulazioni al computer di concerto con l&#39;ingegneria enzimatica e analisi termodinamica (Figura 1). Questo permette di far luce ulteriore sull&#39;impatto delle dinamiche del solvente su catalisi, che attualmente è poco conosciuta. Stabilizzare interazioni entalpici, forniti da legami idrogeno-mediata acqua in enzimi solvatato siti attivi, possono essere compensati con sanzioni entropiche 1. Tali costi entropiche sono associati con la diminuzione dei gradi di libertà visualizzati da molecole di acqua confinate entro cavità proteiche, rispetto all&#39;acqua in bulk 5. Il rilascio di molecole d&#39;acqua ordinato può quindi fornire un volano entropica per associazione ligando 1 e catalisi 3. Un aspetto fondamentale della dinamica solvente è lo spostamento delle molecole d&#39;acqua tra l&#39;interno delle proteine ​​e del solvente esterni 4. I cambiamenti di accompagnamento in energia di attivazione, entalpia e l&#39;entropia 11 sono state comprese a livello molecolare. Ostruendo tunnel singoli responsabili del trasporto di acqua in enzimi, l&#39;importanza delle dinamiche del solvente e il suo contributo alla attivazioneenergia può essere valutata (Figura 1). Inoltre, effettuando esperimenti cinetici one-pot a diverse temperature, i relativi parametri termodinamici di attivazione di diversi substrati possono essere estratti da un numero ridotto di esperimenti (figura 1, a destra). Il nostro metodo interdisciplinare è validato per di membrana complessi enzimi triterpene ciclasi che generano terpeni policiclici di grande importanza per la vita 12. Il protocollo consente il recupero di elevate quantità di proteine ​​di membrana (10-20 mg / L) utilizzando una centrifuga standard. Sebbene enzimi evoluti in acqua, il ruolo del solvente nel promuovere la catalisi è generalmente trascurato. Oltre alla dinamica delle proteine ​​13,14 che forma pre-organizzato siti attivi con complementarità elettrostatica per lo stato di transizione 15, dinamica dell&#39;acqua potrebbero essere di grande importanza per la catalisi enzimatica efficiente. Forgiando diverse tecniche interdisciplinari, il nostroobiettivo è quello di facilitare lo altamente complesso studio delle dinamiche d&#39;acqua e termodinamica. Rendere questi strumenti più accessibili alla comunità scientifica porterà allo sviluppo di nuove strategie in ingegneria enzima e progettazione di proteine ​​per le attività alterati e specificità.

<table><tbody><tr><td>YASARA</td><td>YASARA Biosciences</td><td>http://www.yasara.org/</td> <td>Programma di modellazione e simulazione molecolare&nbsp;</td></tr><tr><td>PARACARICE&nbsp;</td><td>CaverSoft</td><td>http://caver.cz/</td> <td>Tool per l'analisi dei tunnel nelle proteine, licenza gratuita per uso accademico</td></tr><tr><td>Bradford Ultra</td><td>Expedeon</td><td>BFU1L, BFU05L</td><td>Quantificazione delle proteine in soluzioni contenenti fino all'1% di detergente</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Potter-Elvehjem</td><td>VWR</td><td>432-0205, 432-0217</td><td>Omogeneizzazione di pellet cellulare congelato</td></tr><tr><td>Compresse cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>4693159001</td> Unità filtranti centrifughe <td>inibitore della proteasi</td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td>Unità filtranti centrifughe per la concentrazione di proteine, MWCO 10 kDa</td></tr><tr><td>Thermomixer&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer per l'incubazione dei campioni</td></tr></tbody></table>

svelare entropico velocità di accelerazione indotta da solventi dynamics a membrana enzimi

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

La catalisi enzimatica si è evoluta in un ambiente acquoso. L'influenza della dinamica dei solventi sulla catalisi è, tuttavia, attualmente poco conosciuta e solitamente trascurata. Lo studio della dinamica dell'acqua negli enzimi e delle conseguenze termodinamiche associate è molto complesso e ha coinvolto simulazioni al computer, esperimenti di risonanza magnetica nucleare (NMR) e calorimetria. I tunnel d'acqua che collegano il sito attivo con il solvente circostante sono fondamentali per lo spostamento e la dinamica del solvente. Il protocollo qui contenuto consente l'ingegnerizzazione di questi motivi per il trasporto dell'acqua, che influisce sulla specificità, l'attività e la termodinamica. Fornendo un quadro biofisico fondato sulla teoria e sugli esperimenti, il metodo qui presentato può essere utilizzato da ricercatori senza precedenti competenze nella modellazione al computer o nella chimica biofisica. Il metodo farà progredire la nostra comprensione della catalisi enzimatica a livello molecolare misurando i cambiamenti entalpici ed entropici associati alla catalisi da varianti enzimatiche con tunnel d'acqua ostruiti. Il protocollo può essere utilizzato per lo studio di enzimi legati alla membrana e di altri sistemi complessi. Ciò migliorerà la nostra comprensione dell'importanza della riorganizzazione dei solventi nella catalisi e fornirà nuove strategie catalitiche nella progettazione e nell'ingegneria delle proteine.

L&#39;importanza della dinamica dell&#39;acqua in enzimatica polycyclization catalisi è implicato da analisi in silico e la successiva visualizzazione di gallerie rilevati (utilizzando lo script nel Codice supplementare File 2). In seguito la sezione 3 del protocollo, S168 si trova ad essere un residuo amminoacido &quot;hot spot&quot; che allinea una delle gallerie della triterpene ciclasi enzima Alicyclobacillus acidocaldarius (Figura 1, al centro a sinistra). Introducendo la mutazione S168F in silico, il tunnel è ostruita come visto mediante ispezione visiva (Figura 1, in basso a sinistra). La velocità di reazione per la formazione di prodotti policiclici visualizzati dall&#39;enzima triterpenici cyclase è molto sensibile alla temperatura (Figura 2A). Seguendo il protocollo (sezione 4-7), si è constatato che l&#39;apparente k cat / K <sub&gt; M visualizzato da wild-type enzimatico per la formazione di prodotti pentaciclici aumenta fiftyfold quando la temperatura è aumentata di 25 ° C (Figura 2A). Blocco individuali gallerie introducendo una mutazione puntiforme ha un effetto significativo sui assoluta apparente k cat / valori K M determinati sperimentalmente, nonché sulla loro dipendenza dalla temperatura (Figura 2A). Dai parametri cinetici determinate sperimentalmente, trame termodinamiche lineari sono generate dall&#39;equazione 3 e seguendo sezione 6-7 del protocollo per cinetiche substrato singoli (Figura 2B). I grandi cambiamenti di entropia di attivazione ed entalpia osservati per varianti ospitanti tunnel bloccati implica un ruolo chiave dinamica dell&#39;acqua nel promuovere cascata polycyclization (Figura 2C, calcoli basati sulla Figura 2B). Inoltre, Varianti con tunnel di acqua alterate mostrano una energia libera di Gibbs alterato di attivazione (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡, figura 2B-C). Per esempio, a 303 K variante tunnel S168F visualizza una energia libera di Gibbs di attivazione di 14 kcal / mol rispetto al 16 kcal / mol per il wild-type enzima. A seguito del protocollo nella sezione 7, equazione 4 consente per il calcolo dei cat / valori apparente K K M per supporti aggiuntivi da esperimenti di cinetica uno-pentola (Figura 3A). Inoltre, una trama termodinamica lineare (figura 3B) può essere costruito mediante l&#39;esecuzione del saggio concorso a diverse temperature (equazione 5). In analogia con la cinetica singolo substrato, l&#39;entalpia ed entropia relativa attivazione per supporti aggiuntivi rispetto ad un composto di riferimento sono readily accessibile dal intercetta e pendenza lineare si adatta ai dati sperimentali. I valori assoluti dei parametri termodinamici di attivazione possono essere valutati dalla aggiunta aritmetica utilizzando dati termodinamici associati con il composto di riferimento (equazione 6). Utilizzando il protocollo qui, hanno generato risultati mostrano chiaramente che la membrana enzima varianti con tunnel di acqua bloccate mostrano fondamentalmente diversi parametri termodinamici di attivazione per i substrati di diverse dimensioni (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> Figura sintesi 1. Protocollo:. In modellazione al computer silico di concerto con progettazione di proteine ​​sperimentale e analisi termodinamica permette una migliore comprensione dell&#39;influenza delle dinamiche del solvente sulla catalisi enzimatica <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate</a>qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> Figura 2. parametri termodinamici di attivazione di wild-type e tunnel varianti dal cinetica unico substrato. (A) k apparente cat / valori K M ottenuti dai dati sperimentali e utilizzando le equazioni 1 e 2. (B) analisi termodinamico utilizzando la teoria dello stato di transizione e in forma lineare dei dati sperimentali all&#39;equazione 3. (C) parametri termodinamici di attivazione calcolati dai grafici in (B). Il substrato squalene già piegati è mostrato con legami formati / rotto come linee tratteggiate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3. parametri termodinamici di attivazione di wild-type e tunnel varianti per diversi substrati. (A) k relativa cat / valori K M ottenuti da un pot-cinetiche, utilizzando l&#39;equazione 4. (B) Trame termodinamiche dei dati cinetici a diverso temperature utilizzando la formula 5. (C) parametri termodinamici assoluti di attivazione calcolati dall&#39;equazione 6 e utilizzando la squalene substrato in figura 2 come riferimento. Obbligazioni formato / rotti nei substrati sono mostrati come linee tratteggiate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Canali per il trasporto di molecole d&#39;acqua in enzimi influenzano sito solvatazione attiva e catalisi. Qui vi presentiamo un protocollo per la progettazione di questi motivi catalitici aggiuntivi sulla base di modelli al computer in silico e sperimentazione. Ciò permetterà di migliorare la nostra comprensione della influenza delle dinamiche del solvente sulla catalisi enzimatica.

Svelare entropico velocità di accelerazione indotta da solventi Dynamics a membrana Enzimi

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

L'obiettivo generale di questo protocollo interdisciplinare è migliorare la nostra comprensione fondamentale dell'impatto della dinamica del solvente sulla catalisi enzimatica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande chiave nel campo della biocatalisi, ad esempio in che modo la riorganizzazione del solvente influisce sulla dinamica e sulla catalisi enzimatica.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'ingegnerizzazione di tunnel o percorsi di trasporto dell'acqua, che influenzano specificità, attività e termodinamica. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi interdisciplinari sono difficili da apprendere in quanto collegano diverse sottodiscipline della scienza. Per iniziare, scaricare una struttura PDB della proteina di interesse dal Protein Databank.Preparare la struttura rimuovendo le subunità in eccesso e quindi aggiungendo atomi di idrogeno mancanti e un solvente esplicito, utilizzando l'esperimento di neutralizzazione della cellula e di previsione del pKa in YASARA. Per le triterpene ciclasi legate alla membrana, dimensioni adatte della scatola d'acqua sono 91 x 67 x 77 Angstrom. Regolare manualmente lo stato di protonazione degli aminoacidi cataliticamente attivi.Minimizzare la struttura mediante il comando di minimizzazione energetica, utilizzando la serie di campi di forza AMBER. Utilizzare l'approccio particle mesh ewald per tenere conto delle interazioni elettrostatiche a lungo raggio. Impostare il cutoff per le interazioni di van der Waals secondo le impostazioni standard.Dopo il ricottimo simulato e la dinamica molecolare, riparare le istantanee della simulazione eliminando tutte le molecole d'acqua e i substrati eventuali del ligando, utilizzando il comando modifica, elimina, residuo. Sovrapporre ciascuna istantanea individualmente sulla struttura PDB originale mediante il comando sovrapponi oggetto, in modo che tutte le strutture condividano la stessa posizione spaziale. Salvare ciascuna istantanea preparata in questo modo come un nuovo file PDB, utilizzando il comando file, salva con nome, PDB.Utilizzare le snapshot preparate come input per il software CAVER 3.0. Visualizzare i tunnel generati da CAVER 3.0 in un programma software di grafica molecolare, utilizzando la macro riportata nel protocollo testuale. Identificare i tunnel con il punteggio più alto in base all'ID riportato nell'intestazione del file di testo riepilogativo in output, generato dal software CAVER 3.0.Utilizzando il modello ottenuto, identificare mediante ispezione visiva gli amminoacidi che rivestono i tunnel con il punteggio più alto e che presentano un gruppo laterale di piccole dimensioni orientato verso l'interno del canale. Individuare singole sostituzioni di amminoacidi che blocchino il tunnel mediante un aumento dell'ingombro sterico, utilizzando il comando di scambio del residuo. Verificare che il tunnel sia ostruito sia mediante ispezione visiva, sia ripetendo l'intero protocollo finora descritto.Qui, il triptofano introdotto è mostrato in magenta, mentre la serina sostituita è riportata a scopo comparativo. Preparare un tampone di fosfato di potassio, un tampone di risospensione, un tampone con detergente e un tampone di reazione come indicato nel protocollo testuale. Per le squalene-epene ciclasi, o per altri enzimi legati alle membrane con un ottimo a pH più basso, utilizzare un tampone di risospensione contenente citrato.Pesare un pellet di cellule congelate in un becher di vetro. Ri-sospendere le cellule nel buffer di risospensione, utilizzando un omogeneizzatore per ottenere una concentrazione finale di 0,3 grammi di cellule/millilitro. Successivamente, lisare le cellule risospese mediante sonificazione ad ultrasuoni con un'ampiezza dell'80% e un impulso di un secondo acceso e un secondo spento.Utilizzare tre cicli ripetuti di 50 secondi ciascuno. Aggiungere il buffer con detergente fino a una concentrazione finale di 0,2% di detergente. Eseguire l'equilibrazione, mediante mescolamento capovolto, a quattro gradi Celsius per un'ora.Recuperare la frazione di proteine di membrana, salvando il soprannatante dopo una singola centrifugazione a 39.000 gs per 50 minuti a quattro gradi Celsius. Preparare una soluzione madre fresca di substrato a cinque millimoli in tampone di reazione. Ottenere un'emulsione omogenea mediante ultrasonificazione al 30% di ampiezza per due-cinque minuti.Successivamente, portare un ThermoMixer alla temperatura di reazione desiderata. Verificare la temperatura all'interno di un vial di vetro contenente acqua mediante un termometro esterno. Per la cinetica con singolo substrato, diluire il substrato emulsionato in almeno cinque vial di vetro, fino alla stessa concentrazione finale di substrato.Preincubare le provette di vetro nel ThermoMixer per 10 minuti. Avviare la reazione aggiungendo l'enzima. Un volume totale di reazione di un millilitro è adatto.Utilizzare una velocità di agitazione di almeno 1200 giri/min. Arrestare le reazioni in diversi punti temporali aggiungendo 500 microlitri di acetato di etile, arricchito con 100 micromolare di decanolo come standard di integrazione. Estrarre le miscele di reazione mediante vortex e agitando manualmente i vial di vetro vigorosamente per un minuto.Quindi, centrifugare i vial di vetro a 9.600 gs in una centrifuga da banco per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo strato superiore in un tubo vuoto. Aggiungere ulteriori 500 microlitri di solvente di estrazione nei tubi di reazione e ripetere la procedura di estrazione.Asciugare le miscele di reazione estratte con solfato di sodio. Vortexare per cinque secondi e lasciare riposare i tubi per 10 minuti. Eseguire un'ultima centrifugazione a 9.600 ×g per un minuto a temperatura ambiente, utilizzando una centrifuga da banco.Successivamente, trasferire i campioni estratti in vial per cromatografia a gas, o GC. Ripetere la procedura per ciascuna variante enzimatica di interesse, utilizzando almeno quattro diverse concentrazioni iniziali del substrato per la cinetica a singolo substrato e quattro diverse temperature sia per la cinetica a singolo substrato che per quella competitiva. Dopo aver eseguito l'analisi GC, come descritto nel protocollo testuale, integrare le aree dei picchi dei prodotti e convertire le aree dei picchi dei prodotti nelle corrispondenti concentrazioni dei prodotti, utilizzando l'area del campione standard di integrazione.Tracciare la concentrazione di ciascun prodotto in funzione del tempo di reazione. Eseguire una regressione lineare dei punti dati corrispondenti a una conversione inferiore al 10%. La velocità iniziale della reazione è data dal coefficiente angolare della retta interpolata.Per la cinetica relativa in un unico recipiente, con più substrati, ottenere i valori apparenti relativi di K-cat su Km, utilizzando l'equazione elencata nel protocollo del testo, seguendo la reazione di ciclizzazione nel tempo. Viene mostrata l'influenza della riorganizzazione del solvente sulla dipendenza dalla temperatura dei valori apparenti di K-cat su Km. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi dell'analisi termodinamica mediante la teoria dello stato di transizione e dell'adattamento lineare dei dati sperimentali all'equazione della teoria dello stato di transizione per la cinetica a singolo substrato.L'impatto della dinamica del solvente sui parametri termodinamici di attivazione, ottenuti dall'analisi termodinamica sperimentale, è notevole. Varianti enzimatiche con canali per l'acqua compromessi mostrano specificità di substrato fondamentalmente diverse, causate da complessi cambiamenti nelle entropie e entalpie relative di attivazione, come mostrato in questo studio. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biocatalisi per esplorare il ruolo dell'acqua nel guidare la dinamica enzimatica e la catalisi, un aspetto attualmente poco compreso.

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