Analisi di reclutamento delle cellule di tumore del polmone
26 febbraio 2019
Questo manoscritto descrive un metodo per quantificare l'accumulo di cellule del tumore nei polmoni in un modello animale della metastasi del tumore.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia tumorale sui meccanismi molecolari della metastasi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il reclutamento di cellule tumorali all'interno di un organo remoto può essere quantificato. Inizia usando un reagente di dissociazione cellulare non enzimatica per rimuovere il carcinoma polmonare lewis che esprime proteine fluorescenti, o LLC, dalle loro cellule di coltura secondo protocolli standard.
Trasferire la soluzione cellulare risultante in un tubo conico da 15 millilitri prima della centrifugazione e centrifugare lavare il pellet due volte in cinque millilitri di PBS per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare a poro di 40 micrometri e diluire la sospensione a una volta per 10 alle sei cellule per concentrazione di millilitro. Quindi caricare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 29 e iniettare 100 microlitri di cellule nella vena di coda di ogni topo maschio di otto-10 settimane, C57-Black-6.
All'endpoint sperimentale appropriato, utilizzare le forbici per rimuovere la pelle dalla superficie ventrale di ogni topo e tagliare le costole e il diaframma per esporre la cavità toracica. Utilizzare un ago per infusione alato calibro 25 e tubi per lavare 15 millilitri di PBS attraverso il ventricolo destro e rimuovere il cuore e il timo. Afferrando la trachea con le forcelle, tirare su, sezionando i tessuti connettivi intorno alla trachea, per raccogliere i polmoni.
Quindi lavare i polmoni in PBS e staccare un lobo per la visualizzazione delle cellule fluorescenti in situ al microscopio a fluorescenza. Per digerire il tessuto polmonare, prima dadi il lobo caudale con le forbici e posiziona i pezzi polmonari in una siringa da 10 millilitri. Chiudere la siringa con lo stantuffo e aspirare cinque millilitri di soluzione di digestione nella siringa, spostando lo stantuffo in entrata e in uscita dall'albero della siringa fino a quando il tessuto polmonare non viene diffuso in tutta la soluzione.
Erogare il liquame polmonare in un tubo da 50 millilitri e digerire il tessuto su uno shaker reciproco per 15 minuti a 37 gradi Celsius e 150 giri/min. Alla fine dell'incubazione, triturare il tessuto rimanente fino a quando le cellule polmonari non sono completamente disperse e restituire il tubo allo shaker per altri 30 minuti. Quindi filtrare le cellule attraverso un colino poro di 40 micrometri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.
Per analizzare le cellule polmonari isolate per citometria a flusso, rimescolare il pellet in due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per un minuto a temperatura ambiente e raccogliere le cellule per centrifugazione. Quindi centrifugare il pellet due volte in cinque millilitri di PBS fresco integrato con l'1% di albumina di siero bovino per lavaggio. Dopo la seconda centrifugazione, rimescolare il pellet in un millilitro di PBS fresco più BSA e filtrare le cellule attraverso un nuovo colino poro di 40 micrometri per la quantificazione delle cellule tumorali per citometria a flusso.
I polmoni presentano molte cellule GFP-LLC due ore dopo l'iniezione, con la stragrande maggioranza delle cellule che scompaiono dai polmoni entro 24 ore. Si noti che tutte le macchie fluorescenti rilevate all'interno del filtro rosso devono essere escluse dal conteggio delle celle. Per confermare il numero di GFP-LLC nei polmoni, uno dei lobi può essere utilizzato per l'analisi citometrica del flusso come dimostrato.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che una procedura di sezione congelata è un metodo più accurato per osservare la posizione esatta delle cellule tumorali.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive un metodo per quantificare l'accumulo di cellule tumorali nei polmoni in un modello animale di metastasi tumorale. Questa tecnica consente la quantificazione del reclutamento di cellule tumorali in un organo distante, fornendo informazioni sui meccanismi molecolari alla base della metastasi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncoologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Comprendere la metastasi tumorale è fondamentale per la ricerca sul cancro.
- La quantificazione dell'accumulo di cellule tumorali può rivelare importanti informazioni biologiche.
- L'uso di modelli animali è comune nello studio della progressione del cancro.
- Le cellule che esprimono proteine fluorescenti facilitano il tracciamento e la quantificazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per quantificare l'accumulo di cellule tumorali nei polmoni.
- Studiare il reclutamento di cellule tumorali in un modello di metastasi.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della metastasi.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un reagente di dissociazione cellulare non enzimatico.
- Centrifugazione e lavaggio dei pellet cellulari in PBS.
- Filtrazione delle cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri.
- Iniezione della sospensione cellulare diluita nella vena della coda dei topi.
Risultati principali
- Il metodo consente una quantificazione efficace dell'accumulo di cellule tumorali.
- Ha dimostrato la fattibilità del tracciamento delle cellule tumorali in vivo.
- Ha fornito informazioni sulle dinamiche del reclutamento delle cellule tumorali.
- Ha contribuito alla comprensione dei processi metastatici.
Conclusioni
- Questo metodo è uno strumento prezioso per lo studio della biologia tumorale.
- Migliora la capacità di indagare la metastasi in modelli animali.
- Studi futuri possono basarsi su questa tecnica per esplorare bersagli terapeutici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio consente una valutazione quantitativa del reclutamento delle cellule tumorali in organi distanti, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella scoperta di farmaci mirati alla metastasi. Evitando le fasi di invasione del tumore primario, si concentra sulle interazioni stromali e sugli eventi di extravasazione critici per la validazione preclinica dei bersagli. Il metodo fornisce un output riproducibile e scalabile per la valutazione di composti anti-metastatici in vivo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche riguardo ai contributi dello stroma alla metastasi in organi distanti.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale delle target quantificando l'accumulo di cellule tumorali nei polmoni dopo l'iniezione.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio misurando gli effetti del composto sulla dinamica di reclutamento delle cellule tumorali.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce output standardizzati e quantitativi mediante citometria a flusso per campagne di screening di composti.
- Riproducibilità: Utilizza concentrazioni cellulari definite e volumi di iniezione per garantire una modellizzazione consistente della metastasi.
- Scalabilità: Compatibile con l'elaborazione in multi-well e con l'analisi ad alto contenuto per la riduzione del rischio del bersaglio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella le micrometastasi polmonari per studiare i meccanismi di colonizzazione organo-specifica.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte alla validazione preclinica di agenti anti-metastatici.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce indicazioni per criteri di prosegui/non prosegui basati sulla riduzione del numero di cellule tumorali marcate.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Posizioni all'interno del percorso della scoperta, dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'ottimizzazione del composto promettente, che consentono la valutazione quantitativa di composti modulatori della metastasi.
- Biologia della scoperta: Supporta l'analisi meccanicistica delle interazioni tra tumore e stroma nelle nicchie metastatiche.
- Screening: Fornisce letture quantitative basate sulla fluorescenza per la validazione dei risultati nei saggi di metastasi.
- Analisi: Genera dati numerabili sulle cellule tumorali mediante citometria a flusso per l'analisi dose-risposta e statistica.
- Ricerca traslazionale: Si integra con le strategie di biomarcatori monitorando la disseminazione di cellule marcate in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio di meccanismi di metastasi trasversali ai progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di metastasi attraverso il reclutamento quantificabile specifico per organo.
- Valore operativo: Standardizza la somministrazione delle cellule tumorali e la lavorazione dei tessuti per confronti riproducibili tra laboratori.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati ai farmaci mirati alla metastasi.
- Impatto sul portafoglio: Facilita decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate su dati preclinici di soppressione della metastasi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di iniezione endovenosa nella coda del topo e di dissociazione dei tessuti.
- Dipende da strumentazione per citometria a flusso e da controlli di compensazione della fluorescenza.
- Necessita di protocolli standardizzati per la preparazione delle cellule tra diversi gruppi di ricerca.
- Richiede l'ottimizzazione della dose cellulare per evitare segnali confondenti derivanti da un'eccessiva accumulazione polmonare.
- Limitato alla quantificazione dell'accumulo polmonare; non rileva l'invasione del tumore primario né la successiva crescita metastatica.
