Analisi di reclutamento delle cellule di tumore del polmone

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia tumorale sui meccanismi molecolari della metastasi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il reclutamento di cellule tumorali all'interno di un organo remoto può essere quantificato. Inizia usando un reagente di dissociazione cellulare non enzimatica per rimuovere il carcinoma polmonare lewis che esprime proteine fluorescenti, o LLC, dalle loro cellule di coltura secondo protocolli standard.

Trasferire la soluzione cellulare risultante in un tubo conico da 15 millilitri prima della centrifugazione e centrifugare lavare il pellet due volte in cinque millilitri di PBS per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare a poro di 40 micrometri e diluire la sospensione a una volta per 10 alle sei cellule per concentrazione di millilitro. Quindi caricare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 29 e iniettare 100 microlitri di cellule nella vena di coda di ogni topo maschio di otto-10 settimane, C57-Black-6.

All'endpoint sperimentale appropriato, utilizzare le forbici per rimuovere la pelle dalla superficie ventrale di ogni topo e tagliare le costole e il diaframma per esporre la cavità toracica. Utilizzare un ago per infusione alato calibro 25 e tubi per lavare 15 millilitri di PBS attraverso il ventricolo destro e rimuovere il cuore e il timo. Afferrando la trachea con le forcelle, tirare su, sezionando i tessuti connettivi intorno alla trachea, per raccogliere i polmoni.

Quindi lavare i polmoni in PBS e staccare un lobo per la visualizzazione delle cellule fluorescenti in situ al microscopio a fluorescenza. Per digerire il tessuto polmonare, prima dadi il lobo caudale con le forbici e posiziona i pezzi polmonari in una siringa da 10 millilitri. Chiudere la siringa con lo stantuffo e aspirare cinque millilitri di soluzione di digestione nella siringa, spostando lo stantuffo in entrata e in uscita dall'albero della siringa fino a quando il tessuto polmonare non viene diffuso in tutta la soluzione.

Erogare il liquame polmonare in un tubo da 50 millilitri e digerire il tessuto su uno shaker reciproco per 15 minuti a 37 gradi Celsius e 150 giri/min. Alla fine dell'incubazione, triturare il tessuto rimanente fino a quando le cellule polmonari non sono completamente disperse e restituire il tubo allo shaker per altri 30 minuti. Quindi filtrare le cellule attraverso un colino poro di 40 micrometri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Per analizzare le cellule polmonari isolate per citometria a flusso, rimescolare il pellet in due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per un minuto a temperatura ambiente e raccogliere le cellule per centrifugazione. Quindi centrifugare il pellet due volte in cinque millilitri di PBS fresco integrato con l'1% di albumina di siero bovino per lavaggio. Dopo la seconda centrifugazione, rimescolare il pellet in un millilitro di PBS fresco più BSA e filtrare le cellule attraverso un nuovo colino poro di 40 micrometri per la quantificazione delle cellule tumorali per citometria a flusso.

I polmoni presentano molte cellule GFP-LLC due ore dopo l'iniezione, con la stragrande maggioranza delle cellule che scompaiono dai polmoni entro 24 ore. Si noti che tutte le macchie fluorescenti rilevate all'interno del filtro rosso devono essere escluse dal conteggio delle celle. Per confermare il numero di GFP-LLC nei polmoni, uno dei lobi può essere utilizzato per l'analisi citometrica del flusso come dimostrato.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che una procedura di sezione congelata è un metodo più accurato per osservare la posizione esatta delle cellule tumorali.