Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando cheratinociti derivati dai capelli. Ciò si ottiene isolando prima i capelli da un donatore. Il secondo passo è quello di placcare i peli per facilitare la crescita dei cheratinociti.

Successivamente, i cheratinociti vengono mantenuti ed espansi in vitro. Il passo finale consiste nel riprogrammare i cheratinociti in cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo utilizzando un metodo di riprogrammazione episomiale. In definitiva, le cellule IPS umane possono essere isolate e caratterizzate utilizzando l'immunoistochimica per mostrare l'espressione di marcatori pluripotenti.

Il vantaggio complessivo di questo metodo rispetto ai metodi esistenti come il metodo retrovirale o lentivirale, è che utilizzando il fattore episomiale, evitiamo il transgene indesiderato. L'integrazione nel genoma nelle cellule staminali che vengono generate Inizia scongelando una fiala di soluzione di matrice extracellulare su ghiaccio durante la notte. La mattina successiva, utilizzare i puntali delle pipette pre-raffreddati per aggiungere 200 microlitri di soluzione a 12 millilitri di terreno DM F 12 raffreddato.

Aggiungere un millilitro della soluzione diluita di matrice extracellulare a ciascun pozzetto di un 12. Piastra a pozzetti e incuba la piastra per una notte a 37 gradi Celsius per rivestire i pozzetti con la matrice. Successivamente, raccogli i capelli umani primari dalla testa del donatore posizionando le dita vicino alla radice dei capelli e strappando i capelli con un movimento rapido e fluido.

Controlla per confermare che ogni capello raccolto contenga un follicolo pilifero intatto. Posizionare il follicolo sotto un microscopio da dissezione e determinare la fase di crescita di ciascun capello. Raccogli da cinque a 10 peli di antigene da ogni individuo per estrarre il ghiaccio cheratinoso.

La fase antigenica, a differenza della fase T, contiene più strati di epitelio. Mettere i campioni di capelli in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di una miscela antibiotica per cinque minuti, quindi lavarli in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, afferra i capelli con una pinza sterile e usa un paio di forbici sterili per tagliare il fusto del capello in eccesso, lasciando un frammento di capello con un follicolo pilifero intatto e circa 0,5-un centimetro di fusto del capello.

Trasferire con cura un frammento di capelli in ciascun pozzetto della piastra rivestita di matrice extracellulare. Usando la pinza sterile posso pepare circa 100-200 microlitri di siero sostitutivo. A metà nel senso della goccia per ogni pozzetto contenente campioni di capelli.

Quindi posizionare la piastra nell'incubatrice e lasciare che i follicoli si attacchino per una notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica il giorno successivo. Aggiungere delicatamente altri 100-200 microlitri di siero sostitutivo, a media goccia, per mantenere umidi i campioni di capelli. Controlla i campioni di capelli ogni giorno per confermare che i follicoli piliferi si siano attaccati correttamente alla piastra.

Una volta attaccato, aggiungere delicatamente altri 500 microlitri di terreno al pozzetto. Cambia i file multimediali ogni due giorni. Preco un piatto a sei pareti con collagene.

Digitare uno utilizzando un pretrattamento come un kit di matrice di rivestimento a 680 microlitri del mezzo di diluizione dal kit a ciascun pozzetto seguito da 6,8 microlitri della soluzione della matrice di rivestimento. Agitare delicatamente la piastra per garantire un rivestimento uniforme. Lasciare incubare la piastra rivestita per 30 minuti a temperatura ambiente prima di placcare i cheratinociti.

Rimuovere la soluzione di rivestimento, dissociare i cheratinociti in coltura in una sospensione a singola cellula aggiungendo 500 microlitri di tripsina allo 0,25% per pozzetto e incubare le piastre per due-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate dalla piastra, inattivare la tripsina con 500 microlitri di siero contenente terreno e raccogliere le cellule in una provetta sterile da 15 millilitri. Rimuovere il frammento di capelli utilizzando una pinza sterilizzata, pellettare le cellule e poi risus.

Sospenderli in una piastra media di crescita per cheratinociti freschi 40, 000 cheratinociti in un pozzetto della piastra rivestita di collagene in presenza di terreno per cheratinociti. Cambiare il terreno ogni giorno e far passare le cellule quando la coltura è circa l'80% confluente V codificare una piastra a sei pareti con gelatina aggiungendo due millilitri di una soluzione di gelatina allo 0,1% in ciascuna, lasciare bene che la gelatina si ricoprisse per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, dissociare i cheratinociti che sono di passaggio sei o inferiori in una sospensione di una singola cellula aggiungendo un millilitro di 0,25% di tryin per pozzetto e incubando le cellule per due o cinque minuti.

A 37 gradi Celsius, inattivare la tripsina con un millilitro di terreno contenente siero e raccogliere le cellule in una provetta da 15 millilitri. Pellettare le cellule e risospenderle in terreno cheratinocitario. Quindi piastrate da 100.000 a 150.000 cheratinociti per pozzetto in una piastra gelatinizzata a sei pozzetti e incubateli per una notte del giorno successivo, giorno zero, controllate la piastra per assicurarvi che le cellule siano confluenti al 50-60%.

Eseguire una trasfezione dei vettori di riprogrammazione episomiale sui cheratinociti utilizzando un rapporto di otto microlitri di reagente di trasfezione per due microgrammi di DNA plasmatico totale come descritto nel protocollo di testo allegato. Il giorno successivo, primo giorno, cambiare il terreno dei cheratinociti e verificare l'efficienza della trasfezione stimando la percentuale di cellule positive alla proteina fluorescente verde al microscopio a fluorescenza. Per il secondo giorno è prevista un'efficienza di trasfezione compresa tra il 60 e il 70%.

Ripetere la trasfezione per aumentare l'efficienza della trasfezione a più del 90%, quindi precodificare una piastra da 10 centimetri con cinque millilitri di gelatina allo 0,1% per almeno 20 minuti. Piastra 4 milioni di cellule feeder inattivate mitoticamente per piatto da 10 centimetri in terreno FBS come descritto in Conrad Al all e lascia che le cellule si depositino e si attacchino durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica il terzo giorno. Raccogliere i cheratinociti trasfettati come mostrato in precedenza e risospenderli in una piastra media KSR.

Il 90% dei cheratinociti da uno dei pozzetti in un piatto di 10 centimetri preparato con cellule di alimentazione e coprirli con KSR. Medium Isolare colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane mediante dissezione manuale dal giorno 21 in poi. Evita le colonie strettamente raggruppate e scegli solo colonie chiaramente separate dalle altre.

Per la dissezione manuale, utilizzare un ago calibro 26 per tagliare le colonie in piccoli pezzi di circa 300-600 micrometri di lunghezza sotto un microscopio da dissezione. Trasferisci i pezzi da una colonia in una nuova piastra di alimentazione MEF per stabilire una linea clonale di cellule staminali pluripotenti indotte umane. Una volta che la coltura raggiunge il 70-80% di fluenza con colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane di circa 1,5 millimetri di diametro, le cellule utilizzano metodi di imballaggio enzimatico standard come Accutane, sasi o collagenasi.

Quattro, secondo le istruzioni del produttore. Quando si segue questo protocollo, le escrescenze di ripetizione possono essere osservate già tre giorni dopo l'attaccamento dei capelli e continueranno a proliferare. I cheratinociti mostrati qui sono stati fatti passare su una nuova piastra e queste cellule possono essere mantenute per più passaggi.

Questa immagine mostra una tipica colonia di cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate da cheratinociti. Dopo 32 giorni di riprogrammazione, può verificarsi una certa differenziazione al centro della colonia di cellule staminali pluripotenti indotte umane. Una volta prelevate manualmente, le cellule derivate mostrano tipicamente un elevato rapporto nucleo/citoplasma e un confine di colonia definito.

Esprimono anche un numero di marcatori pluripotenti come OCT four nag e TRA one 60. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre i cheratinociti dai capelli e riprogrammarli in cellule staminali indotte dall'uomo.