Name: Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati da cheratinociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte umane senza integrazione usando cheratinociti derivati da capelli e vettori episomali. Questo metodo evita rischi di mutagenesi per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Gli autori desiderano ringraziare Harene Ranjithakumaran e Stacey Jackson per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), dell'Università di Melbourne (R.C.B. Wong), di Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) e dell'Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Borsa di studio del Consiglio australiano della ricerca (A. Pébay, FT140100047), borsa di studio della Cranbourne Foundation (R.C.B. Wong); finanziamenti intramurali da parte del National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) e supporto operativo alle infrastrutture da parte del governo del Victoria.

La raccolta del campione di capelli umani da individui richiede l&#39;approvazione etica dal comitato etico della ricerca umana nelle istituzioni ospitanti e deve essere fatto in conformità con le linee guida istituzionali. 1. Isolamento dei cheratinociti da capelli a pizzico <ol><li> Disgelo matrice extracellulare soluzione (ECM) (cioè, Matrigel) su ghiaccio O / N. </li><li> Utilizzando puntali delle pipette pre-refrigerati, aggiungere 200 ml soluzione ECM per 12 ml di acqua refrigerata a medio DMEM / F12. Coat un 12-pozzetti con 1 ml di soluzione di ECM diluita in ciascun pozzetto. Incubare la piastra O / N rivestito a 37 ° C. Lavare la piastra ricoperta di pre-riscaldato DMEM / F12 medio prima dell&#39;uso. </li><li> Raccogliere i capelli umani primaria dalla testa del soggetto posizionando le dita vicino alla radice dei capelli e spennare i capelli in un movimento veloce e regolare. Controllare per confermare che ogni capelli raccolti contiene un follicolo pilifero intatta e determinare la fase di crescita delle Nazioni Unite capellider un microscopio da dissezione (Figura 1). <ol><li> Raccogliere 5-10 peli anagen da ogni individuo per estrarre cheratinociti. Processo pizzicato peli più presto possibile garantire la corretta derivazione dei cheratinociti. Nota: La Figura 1 illustra la morfologia di capelli in diverse fasi del ciclo di crescita. Capelli anagen è in fase di crescita, con uno strato esterno visibile dell&#39;epitelio circonda la lunghezza dei capelli, noto come ORS. D&#39;altra parte, i capelli telogen rappresenta capelli nella fase di riposo e non ha un ORS visibile, ma ha una chiara palla di cellule che ricoprono la radice dei capelli, noto come il rigonfiamento telogen. </li></ol></li><li> Porre i campioni di capelli in una capsula petri contenente 10 ml di antibiotico Mix per lavare per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzando forbici e pinze sterilizzate, tagliare eccessiva fusto del capello, lasciando un frammento di capelli con un follicolo pilifero intatto e dintorni 0,5-1 cm di fusto del capello. </li><li> Attentamente TRAnsfer frammento 1 capelli in ciascun pozzetto della piastra ECM rivestite con pinze. </li><li> Con una pipetta 1 ml, aggiungere circa 3 gocce di Knockout siero sostituzione (KSR) medio (~ 100-200 mL) ai campioni di capelli. Nota: Mantenere i frammenti di capelli a stretto contatto con la superficie della piastra per consentire l&#39;attaccamento e la successiva escrescenza cheratinociti. L&#39;aggiunta eccessiva della carta in questa fase può provoca i frammenti di capelli di galleggiare e diminuisce il rischio di attacco di capelli di successo. </li><li> Incubare i campioni di capelli in un incubatore a 37 ° con il 5% di CO 2 e consentire i follicoli dei capelli per fissare O / N. Il giorno dopo, aggiungere delicatamente altri 3 gocce di KSR media (~ 100-200 ml) per mantenere i campioni di capelli umidi. </li><li> Osservare i campioni di capelli ogni giorno per confermare che i follicoli dei capelli hanno attaccato con successo. Generalmente attaccamento dei follicoli dei capelli è evidente entro 1-3 giorni. Capelli spessi sono di solito più facili da montare rispetto a peli fini, come peli sottili hanno una maggioretendenza a galleggiare che ostacolano il processo di attaccamento. <ol><li> Una volta che i capelli sono attaccato alla piastra rivestita, aggiungere 500 ml di KSR mezzo al pozzo. Prestare particolare attenzione quando si aggiunge il mezzo come campioni di capelli potrebbero non essere montato saldamente. Da questo punto, cambiare supporto ogni 2 giorni. Nota: escrescenze cheratinociti devono essere visibili dalla regione ORS del frammento capelli dopo 3-7 giorni (Figura 2A-B). Lasciare i cheratinociti a crescere fino a 14 giorni prima passaging le cellule come descritto nella sezione successiva. </li></ol></li></ol> 2. Manutenzione e Passaging dei cheratinociti <ol><li> Pre-coat un 6-pozzetti utilizzando il kit Coating Matrix. Aggiungere 680 pl di mezzo di diluizione dal kit a ciascun pozzetto, seguito da 6,8 ml di soluzione di rivestimento Matrix. Agitare la piastra per assicurare una distribuzione uniforme della soluzione di rivestimento Matrix sulla piastra. </li><li> Il lamierino rivestito per incubare per 30 minuti a RT. Rimuoverela soluzione di rivestimento Matrix prima placcatura dei cheratinociti. </li><li> Dissociarsi cheratinociti in una sospensione di cellule singole con 500 ml di 0,25% tripsina per pozzetto per 2-5 minuti a 37 ° C. Disattivare la tripsina con 500 ml di mezzo contenente siero (ad esempio, siero fetale bovino (FBS) medium) e raccogliere in una provetta sterile da 15 ml. Rimuovere il frammento capelli con pinze sterilizzate. </li><li> Determinare il numero di cellule raccolte utilizzando un emocitometro. </li><li> Centrifugare le cellule per 3 min a 200 x g. Lavare le cellule con PBS e centrifugazione ripetere. Aspirare il PBS e risospendere il pellet cellulare in fresco medio dei cheratinociti. </li><li> Piatto giù 4 × 10 4 cheratinociti in un pozzetto della piastra ECM rivestite in presenza di cheratinociti media. Mantenere cheratinociti in un incubatore a 37 ° con il 5% di CO 2 (Figura 2C). Modificare i media ogni giorno e di passaggio celle quando la cultura è ~ 80% confluenti, WHIch può richiedere circa 2-7 giorni a seconda del numero di passaggio e la proliferazione tasso dei cheratinociti. I cheratinociti derivati ​​dovrebbero essere estesi per generare scorte congelate sufficienti utilizzando metodi di crioconservazione lento congelamento standard di 16. Nota: Le condizioni di coltura descritte supportano l&#39;espansione della popolazione omogenea dei cheratinociti con la tipica morfologia ciottoli (Figura 2C). Di tanto in tanto, qualche cheratinociti differenziati, con grande e piatta morfologia e hanno perso potenziale replicativo, possono essere osservati in cultura. Caratterizzazione dei cheratinociti può essere eseguita mediante immunocolorazione utilizzando anticorpi contro citocheratina 14 come descritto in precedenza 17. Linee cellulari di cheratinociti Fondata dovrebbero essere testati per micoplasma dopo 1-3 passaggi utilizzando il kit disponibile in commercio. </li></ol> 3. Generazione di hiPSCs da cheratinociti Utilizzando episomiale Vettori <ol><li> Pre-coat un 6-pozzetti con0,1% di gelatina (2 ml / pozzetto). Consentire la gelatina per rivestire per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Per esperimento riprogrammazione, uso cheratinociti non oltre il passaggio 6. Dissociate cheratinociti in una sospensione di cellule singole con 1 ml di 0,25% tripsina per bene per 2-5 minuti a 37 ° C. Inattivare tripsina con 1 ml di supporti contenenti siero (ad esempio, FBS media) e raccogliere in una provetta da 15 ml. </li><li> Celle di centrifugazione per 3 min a 200 xg e risospendere le cellule in cheratinociti media. Piastra 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 cheratinociti per pozzetto in una piastra O / N gelatinizzato. </li><li> Il giorno successivo (giorno 0), controllare la piastra per garantire cellule sono il 50-60% confluenti. Nota: Se cheratinociti sono meno di ~ 50% confluenti potrebbero non crescono bene dopo la trasfezione. </li><li> Il giorno 0, effettuare trasfezione dei vettori episomiale riprogrammazione sui cheratinociti, utilizzando un rapporto di 8 microlitri trasfezione reagente 2 ug di DNA plasmidico totale.<ol><li> Prendete 0,5 mg per ciascuno dei 4 plasmidi (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) e diluire in 100 ml di media Serum ridotta (per esempio, OPTI-MEM). Nota: Il plasmide pCXLE-eGFP è utilizzato per monitorare l&#39;efficienza di trasfezione di cheratinociti e non è necessaria per la riprogrammazione successo. </li><li> Aggiungere 8 ml di reagente di trasfezione di DNA diluito. Mescolare muovendo il tubo. Lasciare la miscela di reazione DNA riposare indisturbati a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Sostituire il supporto dei cheratinociti con terreno fresco. </li><li> Aggiungere delicatamente la miscela di reazione del DNA di coltura di cheratinociti e incubare a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 4 ore. Nota: non è consigliabile eseguire prolungata trasfezione O / N nei cheratinociti in quanto presentano bassa sopravvivenza dopo la trasfezione. </li><li> Dopo 4 ore dopo la trasfezione, sostituire il mezzo di cheratinociti con terreno fresco. </li></ol></li><li> Il giorno 1 (1 giorno post-transfection), cambiare il mezzo cheratinociti e verificare l&#39;efficienza di trasfezione stimando la percentuale di cellule positive eGFP sotto un microscopio a fluorescenza. Tipicamente&gt; 60-70% efficienza di trasfezione si osserva per cheratinociti primari che utilizzano questo protocollo. </li><li> Il giorno 2, ripetere trasfezione come descritto al punto 3.5. Due trasfezioni consecutivi sarebbero tipicamente raggiungere il&gt; 90% efficienza di trasfezione. Coltura di cheratinociti solito raggiunge la confluenza prima della fine del secondo trasfezione. <ol><li> Preparare un piatto 10 centimetri di topo alimentatore fibroblasti embrionali (MEF) per ogni reazione riprogrammazione. Preparare alimentatori MEF mitoticamente inattivati ​​come descritto in precedenza 18. </li><li> Pre-coat un piatto 10 centimetri con 5 ml di 0,1% di gelatina per almeno 20 min. Tavola 4 × 10 6 MEF mitoticamente inattivato per 10 cm piatto in FBS medio. Permettono alle cellule di stabilirsi e di allegare O / N in un incubatore a 37 ° con il 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Il giorno 3, harconferire cheratinociti con 0,25% tripsina come descritto al punto 3.2 e 3.3. Risospendere cheratinociti in KSR medio e piastra 90% dei cheratinociti da 1 bene di un 6-pozzetti in un piatto alimentatore MEF 10 centimetri con KSR media. </li><li> Dal 4 ° giorno in poi, cambia il mezzo KSR ogni giorno. <ol><li> In alternativa, dopo il giorno 18, sostituire terreno di coltura ogni due giorni. Nota: cheratinociti non-riprogrammato cesseranno di proliferare, mentre le colonie hiPSC con contorno definito che assomigliano cellule staminali embrionali umane (hESC) emergeranno dal giorno 14-21. </li></ol></li><li> Isolare colonie hiPSC da dissezione manuale dal giorno 21 in poi. Evitare colonie hiPSC che sono strettamente raggruppati insieme e solo raccolgono le colonie hiPSC che sono nettamente separati dagli altri. Nota: le colonie hiPSC possono essere presi in precedenza, ma la colonia con confini definiti potrebbero non essere evidente in precedenti momenti viste le ridotte dimensioni della colonia. Efficienze Riprogrammazione possono variare tra diffcheratinociti di erenti paziente, ed è influenzato anche da altri fattori, quali il numero di passaggio o il tasso di proliferazione dei cheratinociti. <ol><li> Per la dissezione manuale di colonie hiPSC, utilizzare un ago 26G per tagliare colonie hiPSC sotto un microscopio da dissezione. Tagliare una colonia hiPSC in piccoli pezzi intorno a 300-600 micron di lunghezza. Trasferire i pezzi da una colonia hiPSC in una nuova piastra alimentatore MEF (2,5 × 10 4 MEF / cm 2) per stabilire una linea clonale di hiPSCs. Inizialmente, la cultura ogni linea clonale hiPSC in un pozzetto di una piastra a 12 o coltura di organi e piatti, quindi espandere a 6 formato pozzetti. </li><li> Mantenere linee clonali stabilite di hiPSCs in KSR medio su alimentatori MEF. Una volta che la cultura raggiungere il 70 - 80% di confluenza con le colonie hiPSC ~ 1,5 millimetri di diametro, hiPSCs passaggio utilizzando metodi standard enzimatici passaging (Accutase, dispasi o Collagenase IV) secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Caratterizzare stabilito linea hiPSCs per confermare la pluripotenza e la loro capacità di differenziarsi in cellule rappresentante dei tre foglietti embrionali in vitro e / o in vivo 13,19. Inoltre, le linee hiPSC routine test stabilite per micoplasma utilizzando kit disponibili in commercio per garantire che siano privi di agenti patogeni. Ordinariamente monitorare la stabilità del genoma di linee hiPSC da cariotipo o numero di copie variazione basata su array (CNV) analisi. </li></ol>

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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

Generazione di hiPSCs paziente-specifici offre un approccio unico per lo studio patogenesi nei tipi di cellule malate in vitro, e fornisce anche una piattaforma per lo screening di stupefacenti per identificare nuove molecole in grado di salvare i fenotipi di malattia. Questo approccio di modellazione malattia utilizzando hiPSCs ha dato risultati promettenti per una varietà di malattie, tra cui la sindrome del QT lungo, malattia di Huntington, il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica 22.</s...

La scoperta di umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) ha rivoluzionato il campo della medicina rigenerativa, che fornisce un metodo fattibile per la generazione di cellule staminali paziente-specifici 1-3. hiPSCs sono stati generati con successo da vari tipi di cellule somatiche, inclusi i fibroblasti, cellule ematopoietiche 4,5 6,7, cellule epiteliali renali di urina 8 e cheratinociti 9,10. Fino ad oggi, i fibroblasti della pelle e cellule ematopoietiche rappresentano le fonti di cellule più comunemente usati per la generazione iPSCs paziente-specifici. Probabilmente, questo è dovuto al fatto che le biopsie cutanee e raccolta del sangue sono procedure mediche di routine e grandi biobanche di sangue o di pelle campioni di pazienti sono stati stabiliti in molti paesi. A differenza di cellule del sangue e fibroblasti cutanei che richiedono metodi di estrazione invasivi, cheratinociti rappresentano un tipo di cellula facilmente accessibile per la generazione hiPSC. Keratinocytes sono cellule epiteliali ricchi di cheratina che formano la barriera epidermica esterno della pelle e si trovano anche in unghie e capelli 11. In particolare, cheratinociti possono essere trovati sulla guaina esterna della radice (ORS) dei follicoli piliferi, uno strato cellulare esterno che copriva il fusto del capello insieme con la guaina interna della radice (IRS) celle (12, figura 1). Come la raccolta dei capelli è una procedura semplice che non richiede l&#39;assistenza di personale medico, si prevede la possibilità per i pazienti di recuperare ed inviare i propri campioni di capelli ai laboratori, il che faciliterà enormemente la raccolta dei campioni dei pazienti per la generazione hiPSC. Cheratinociti epidermici hanno una maggiore efficienza riprogrammazione e cinetica riprogrammazione più veloci rispetto ai fibroblasti, aggiungendo i vantaggi di utilizzare cheratinociti come le cellule di partenza per hiPSC generazione 9,13. Inoltre, hiPSCs può essere generato anche utilizzando altre popolazioni di cellule all&#39;interno del follicolo pilifero,comprese le cellule della papilla dermica situate alla base del 14,15 follicolo pilifero. Precedenti rapporti di generazione IPSC utilizzando cellule dei capelli derivate utilizzano spesso metodi di riprogrammazione retrovirali o basati lentivirali-9,14,15. Tuttavia, questi metodi virali introducono integrazione genomica indesiderabile dei transgeni esteri durante la riprogrammazione. In confronto, l&#39;uso di vettori episomiale rappresenta un metodo di riprogrammazione fattibile, non virale per generare iPSCs senza integrazione 4. Abbiamo già messo a punto un metodo semplice, economico e non virale per riprogrammare efficientemente cheratinociti in hiPSCs utilizzando vettori episomiale 13. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la generazione di hiPSCs cheratinociti derivate, compresa la derivazione di cheratinociti da capelli strappato, espansione e manutenzione dei cheratinociti e successiva riprogrammazione per generare hiPSCs.

<table><tbody><tr><td>Mix di antibiotici:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ng/ml di amfotericina antimicotica B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20ml</td><td>La miscela di antibiotici è composta da PBS.</td></tr><tr><td>1X Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR) medio:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Il terreno KSR viene filtrato utilizzando Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) prima dell'uso. Il bFGF viene aggiunto fresco al terreno prima dell'uso.</td></tr><tr><td>20% di sostituzione del siero knockout (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 con glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1&volte; MEM aminoacido non essenziale</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0,5 volte; Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0,1 mM &beta;-mercaptoetanolo</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; bFGF (10 ng/ml, aggiunto fresco)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>Terreno per cheratinociti:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; EpiLife con 60&nbsp; &micro; M</td><td>Calcio Invitrogeno</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1&volte; Integratore per la crescita dei cheratinociti umani (HKGS)</td><td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS) medio:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Il terreno FBS viene filtrato utilizzando Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) prima dell'uso.</td></tr><tr><td>10% siero fetale bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0,5x Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Matrice</td> extracellulare (ECM) <td></td> Invitrogen 25200-056<td></td></tr>: <tr><td></td> Matrigel Corning&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>354234</td><td>Aliquot Matrigel stock e stoccaggio a -80&deg; C seguenti costruttori' . La concentrazione madre di Matrigel varia leggermente da lotto a lotto (~9mg/ml). Si consiglia di utilizzare 200&micro; l Matrigel per il rivestimento di una piastra a 12 pozzetti (~150&micro; g/pozzo).&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit matrice di rivestimento&nbsp;</td><td>Plasmidi Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Si noti che pCXLE-eGFP viene utilizzato solo per il monitoraggio dell'efficienza di trasfezione e non è necessario per la riprogrammazione.</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-eGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina (da pelle suina)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Preparare lo 0,1% di gelatina in acqua distillata. Autoclave prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Terreno sierico ridotto: OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr>L'alimentatore <td></td><td></td> di<td>fibroblasti embrionali di topo (MEF)</td><td>MEF può essere inattivato dal trattamento con mitomicina C o dall'irradiazione come descritto in precedenza 16.</td></tr><tr><td>Ago 26G</td><td>Terumo</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti (trattamento con coltura tissutale)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 12 pozzetti (trattamento con coltura tissutale)</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>piastra da 10 cm (trattamento con coltura tissutale)</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>Utilizzo a 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Utilizzare a 1 mg/ml</td></tr><tr><td>di anticorpo TRA-160</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>Utilizzare a 5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>OCT4 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>Utilizzare a 5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>NANOG anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF1997</td><td>Utilizzo a 10 &; micro; g/ml</td></tr><tr><td>Kit di rilevamento MycoAlert</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di cellule staminali integrazione-libero umano pluripotenti indotte utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

I recenti progressi nella riprogrammazione ci permettono di trasformare le cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). La modellazione della malattia utilizzando hiPSC paziente-specifiche consente lo studio del meccanismo alla base della patogenesi, fornendo anche una piattaforma per lo sviluppo di screening farmacologico in vitro e terapia genica per migliorare le opzioni di trattamento. Il potenziale promettente delle hiPSC per la medicina rigenerativa è evidente anche dal numero crescente di pubblicazioni (>7000) sulle iPSC negli ultimi anni. Vari tipi di cellule provenienti da lignaggi distinti sono stati utilizzati con successo per la generazione di hiPSC, inclusi fibroblasti cutanei, cellule ematopoietiche e cheratinociti epidermici. Mentre le biopsie cutanee e la raccolta del sangue vengono eseguite di routine in molti laboratori come fonte di cellule somatiche per la generazione di hiPSC, la raccolta e la successiva derivazione dei cheratinociti dei capelli sono meno comunemente utilizzate. I cheratinociti derivati dai capelli rappresentano un approccio non invasivo per ottenere campioni di cellule dai pazienti. Qui descriviamo un metodo semplice e non invasivo per la derivazione di cheratinociti da capelli strappati. Forniamo anche istruzioni per il mantenimento dei cheratinociti e la successiva riprogrammazione per generare hiPSC senza integrazione utilizzando vettori episomiali.

I capelli passa attraverso 3 diverse fasi del ciclo di sviluppo: anagen (fase di crescita), catagen (la fase di regressione) e telogen (fase di riposo) il 20,21. Il follicolo pilifero anagen contiene più strati di epitelio; questi strati comprendono i ORS, IRS e il fusto del capello (Figura 1). Capelli Anagen alla fine subisce la transizione alla fase catagen, che è caratterizzato da apoptosi delle ORS e alla conclusione della differenziazione fusto del capello. Infine, la transizione capelli...

Questo manoscritto fornisce una procedura passo-passo per la derivazione e il mantenimento di cheratinociti umani da capelli strappati e la successiva generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) prive di integrazione da vettori episomiali.

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando cheratinociti derivati da capelli. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto dei capelli da un donatore. Il secondo passaggio consiste nel piastrare i capelli per favorire la migrazione dei cheratinociti.Successivamente, i cheratinociti vengono mantenuti ed espansi in vitro. L'ultimo passaggio consiste nel riprogrammare i cheratinociti in cellule staminali pluripotenti indotte umane mediante un metodo di riprogrammazione episomale. Infine, le cellule staminali pluripotenti indotte umane possono essere isolate e caratterizzate mediante immunohistochimica per dimostrare l'espressione di marcatori della pluripotenza.Il vantaggio complessivo di questo metodo rispetto ai metodi esistenti, come quelli retrovirali o lentivirali, è che, utilizzando fattori episomiali, si evita l'inserimento di transgeni indesiderati nel genoma delle cellule staminali generate. Iniziare scongelando una provetta di soluzione di matrice extracellulare sul ghiaccio durante la notte. La mattina seguente, utilizzare punte di pipetta pre-raffreddate per aggiungere 200 microlitri della soluzione a 12 millilitri di mezzo DMEM/F12 freddo.Aggiungere un millilitro della soluzione di matrice extracellulare diluita in ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius per rivestire i pozzetti con la matrice. Successivamente, raccogliere peli umani primari dalla testa del donatore posizionando le dita vicino alla radice del pelo ed estrarre il pelo con un movimento rapido e uniforme.Verificare che ogni capello raccolto contenga un follicolo pilifero integro. Posizionare il follicolo sotto un microscopio stereoscopico e determinare la fase di crescita di ciascun capello. Raccogliere da cinque a dieci capelli antigenici da ogni individuo per estrarre la cheratina.La fase dell'antigene, a differenza della fase T, contiene più strati di epitelio. Posizionare i campioni di capello in una piastra di Petri contenente 10 millilitri di una miscela antibiotica per cinque minuti, quindi lavarli in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, afferrare il capello con pinzette sterili e utilizzare un paio di forbici sterili per tagliare la parte eccedente dello stelo del capello, lasciando un frammento di capello con un follicolo pilifero integro e circa da 0,5 a 1 centimetro di stelo del capello.Trasferire con attenzione un frammento di capello in ciascun pozzetto della piastra rivestita con matrice extracellulare. Utilizzando pinzette sterili, aggiungere goccia a goccia circa da 100 a 200 microlitri di sostituto sierico nel mezzo in ciascun pozzetto contenente i campioni di capello.Quindi posizionare la piastra nell'incubatore e lasciare che i follicoli si attacchino durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, aggiungere delicatamente altre da 100 a 200 microlitri di sostituto del siero, goccia a goccia nel mezzo, per mantenere i campioni di capelli umidi. Controllare i campioni di capelli quotidianamente per verificare che i follicoli piliferi si siano attaccati correttamente alla piastra.Dopo l'attaccamento, aggiungere delicatamente ulteriori 500 microlitri di mezzo nel pozzetto. Cambiare il mezzo ogni due giorni. Rivestire una piastra a sei pozzetti con collagene.Digitare uno utilizzando un pretrattamento come un kit di matrice di rivestimento, aggiungendo 680 microlitri del mezzo di diluizione del kit in ogni pozzetto, seguiti da 6,8 microlitri della soluzione di matrice di rivestimento. Agitare delicatamente la piastra per assicurare un rivestimento uniforme. Lasciare incubare la piastra rivestita per 30 minuti a temperatura ambiente prima della semina dei cheratinociti.Rimuovere la soluzione di rivestimento, dissociare i cheratinociti in coltura in una sospensione di singole cellule aggiungendo 500 microlitri di tripsina al 0,25% per pozzetto e incubare le piastre da due a cinque minuti a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate dalla piastra, inattivare la tripsina con 500 microlitri di mezzo contenente siero e raccogliere le cellule in un tubo sterile da 15 millilitri. Rimuovere il frammento di capello utilizzando pinzette sterili, centrifugare le cellule e quindi risospendere.Sospendili in un mezzo di crescita per cheratinociti fresco; piastra 40.000 cheratinociti in un pozzetto di una piastra rivestita con collagene in presenza di mezzo per cheratinociti. Cambia il mezzo ogni giorno e passaggia le cellule quando la coltura raggiunge una confluenza di circa l'80%. Rivesti una piastra a sei pozzetti con gelatina aggiungendo due millilitri di una soluzione di gelatina allo 0,1% in ciascun pozzetto, lasciando la gelatina aderire per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, dissocia i cheratinociti al sesto passaggio o inferiori in una sospensione di singole cellule aggiungendo un millilitro di tripsina allo 0,25% per pozzetto e incubando le cellule per due-cinque minuti.A 37 gradi Celsius, inattivare la tripsina con un millilitro di mezzo contenente siero e raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare le cellule e risospendere in mezzo per cheratinociti. Successivamente, seminare da 100.000 a 150.000 cheratinociti per pozzetto in una piastra a sei pozzetti gelatinizzata e incubare durante la notte. Il giorno successivo, giorno zero, esaminare la piastra per verificare che le cellule siano confluenti al 50-60%.Eseguire una trasfezione dei vettori di riprogrammazione episomiali sui cheratinociti utilizzando un rapporto di otto microlitri di reagente di trasfezione per due microgrammi di DNA plasmidico totale, come descritto nel protocollo testuale allegato. Il giorno successivo, giorno uno, sostituire il mezzo dei cheratinociti e verificare l'efficienza di trasfezione stimando la percentuale di cellule positive alla proteina verde fluorescente mediante microscopio a fluorescenza. Ci si aspetta un'efficienza di trasfezione del 60-70% al giorno due.Ripetere la trasfezione per aumentare l'efficienza di trasfezione a oltre il 90%. Pre-incubare una piastra da 10 centimetri con cinque millilitri di gelatina allo 0,1% per almeno 20 minuti. Pianificare 4 milioni di cellule feeder inattivate mitoticamente per ogni piastra da 10 centimetri in mezzo FBS come descritto in Conrad Al et al. e lasciare che le cellule si depositino e aderiscano durante la notte in un incubatore a 37 °C con 5% di anidride carbonica al terzo giorno. Raccogliere i cheratinociti trasfettati come mostrato in precedenza e risospendere in mezzo KSR.Trasferire il 90% dei cheratinociti da uno dei pozzetti in una piastra da 10 centimetri preparata con cellule sentinella e ricoprirli con KSR. Isolare le colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane mediante dissezione manuale a partire dal giorno 21. Evitare le colonie strettamente raggruppate e selezionare solo quelle chiaramente separate dalle altre.Per la dissezione manuale, utilizzare un ago da 26 gauge per tagliare le colonie in piccoli frammenti di circa 300-600 micrometri di lunghezza al microscopio stereoscopico. Trasferire i frammenti da una colonia a una nuova piastra con fibroblasti embrionali di topo (MEF) come supporto per stabilire una linea clonale di cellule staminali pluripotenti indotte umane. Una volta che la coltura raggiunge una confluenza del 70-80% con colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane di circa 1,5 millimetri di diametro, passare le cellule utilizzando metodi enzimatici standard di subcoltura come Accutase, dispasi o collagenasi.Quattro, secondo le istruzioni del produttore. Seguendo questo protocollo, si possono osservare ricrescite già a partire da tre giorni dopo l'attaccamento del pelo, e queste continueranno a proliferare. I cheratinociti mostrati qui sono stati trasferiti in una nuova piastra e queste cellule possono essere mantenute per più passaggi.Questa immagine mostra una tipica colonia di cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate da cheratinociti. Dopo 32 giorni di riprogrammazione, può verificarsi una certa differenziazione al centro della colonia di cellule staminali pluripotenti indotte umane. Una volta selezionate manualmente, le cellule derivate mostrano tipicamente un elevato rapporto nucleo-citoplasma e un confine della colonia ben definito.Esprimono inoltre una serie di marcatori di pluripotenza come OCT4, Nanog e TRA-1-60. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre cheratinociti dai capelli e riprogrammarli in cellule staminali pluripotenti indotte umane.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Dimostriamo il protocollo per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule somatiche umane utilizzando lentivirus-mediata consegna dei fattori umani Oct4, Sox2, Nanog, e Lin28. Pluripotenza è stata confermata dalla morfologia e la presenza di staminali embrionali (ES) cellulo-specifici marcatori.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti umani Riprogrammare con il Stemgent Lentivirus umani TF Set

Il protocollo seguente fornisce istruzioni per l'adattamento umano staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di alimentazione priva di cultura con completo alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut medio (KSR-FF). Una volta adattato, istruzioni per la manutenzione costante sono anche previste.

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per cryopreserving cellule umane iPS nel medio KnockOut crioconservazione SR ed il recupero di queste cellule in completo alimentatore KnockOut gratuito SR (KSR-FF), medio o alimentatore a base di medie SR KnockOut.

Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media

Questo articolo presenta un protocollo robusto per l'isolamento e la coltura di cellule staminali neurali cresta di follicoli dei capelli umani.

L&#39;isolamento e la coltura di cellule staminali neurali Crest di follicoli dei capelli umani

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

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Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la generazione efficiente di iPSC prive di integrazione da cellule del sangue periferico adulto umano. Con l'uso di quattro vettori episomiali basati su oriP/EBNA per esprimere i fattori di riprogrammazione, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 e SOX2, è possibile ottenere migliaia di colonie di iPSC da 1 mL di sangue periferico.

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.

Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521

Vi proponiamo un protocollo che Mostra come differenziare i cheratinociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e fibroblasti e generare un organoid pelle 3D, utilizzando questi cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo contiene un ulteriore passaggio di generazione di un modello di topi umanizzati. La tecnica presentata qui miglioreranno ricerca dermatologica.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

Presentiamo qui un protocollo per la differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti indotte in ogni derivato di somite (Miotomo, sclerotomo, dermatome e syndetome) in condizioni chimicamente definite, che ha applicazioni nella modellazione di malattia futura e terapie basate su cellule in chirurgia ortopedica.

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Questo protocollo delinea un metodo per la produzione di organoidi cutanei contenenti follicoli piliferi da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura planare e fisiologicamente rilevante di interfaccia aria-liquido per replicare l'architettura e la funzione della pelle.

Generazione di organoidi cutanei a pelo planari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido

Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte umane senza integrazione usando cheratinociti derivati da capelli e vettori episomali. Questo metodo evita rischi di mutagenesi per applicazioni in medicina rigenerativa.

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

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