Consegna di proteine, peptidi o cella-impermeabile piccole molecole in cellule vive mediante incubazione con il reagente Endosomolytic dfTAT

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di somministrare macromolecole in cellule vive utilizzando dimero, tat fluorescente o df tat, un reagente in grado di penetrare nelle cellule in modo molto efficiente senza danneggiarle. Ciò si ottiene generando e purificando prima l'agente di erogazione. Dfta come secondo passo.

Il dfta viene incubato con cellule per un'ora a 37 gradi Celsius in presenza del carico della macromolecola di interesse, il df tat induce l'assorbimento del carico all'interno delle vescicole endocitiche. Le vescicole maturano in endosomi precoci, raggiungendo infine lo stadio endosomico tardivo in cui DF tat è in grado di rilasciare il carico nello spazio citosolico delle cellule. Successivamente, le cellule vengono visualizzate mediante microscopia a fluorescenza per valutare l'efficienza di consegna della detta e del carico di interesse.

I risultati mostrano che DF TT può entrare nelle cellule con elevata efficienza e senza citotossicità osservabile. DF tat può rilasciare macromolecole di diverse dimensioni nello spazio citosolico delle cellule, come può essere osservato mediante microscopia a fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto agli attuali approcci di somministrazione solida è che il nostro agente di consegna ha un'elevata efficienza di consegna senza alcun impatto negativo osservabile sulla fisiologia cellulare. Inoltre, è facile da usare in quanto richiede solo una semplice fase di co-incubazione.

Per iniziare, la sintesi di FTA gonfia 500 milligrammi di R amide, resina MBHA e dimetilformammide o DMF in un recipiente SPPS standard da 50 millilitri per un'ora eseguire la reazione a temperatura ambiente utilizzando azoto gassoso sufficiente per far bollire la reazione. Sintetizzare l'FTA sulla resina MBHA dell'ammide della pista utilizzando 1,2 millimoli di ciascun amminoacido protetto FM elencato nel protocollo di testo per ciascuna reazione di accoppiamento degli amminoacidi. Aggiungere anche il punto 44 grammi di HBTU e il punto 51 millilitri di DIEA disciolto in DMF eseguire ogni reazione di accoppiamento amminoacidico per quattro ore dopo l'accoppiamento di quattro ore.

Lavare la resina con DMF ed eseguire la fase di protezione FD come descritto nel protocollo di testo. Ripetere fino a quando la catena peptidica lineare dell'FTA non viene sintetizzata. Successivamente, Cleve il gruppo protettivo MTT incubando la resina con 20 millilitri di una soluzione composta dall'1% di acido acetico tri fluor o TFA e dal 2% di tri isopropilcy o TIS in DCM per cinque minuti.

Poiché la rimozione del gruppo di protezione MTT comporterebbe la comparsa di un colore giallo. Ripetere l'operazione fino a quando non si osservano colori gialli durante il lavaggio della resina con DCM e DMF nel mezzo. Aggiungere una soluzione aggiuntiva con l'1% di TFA in DCM alla resina per garantire che non venga rimosso alcun MTT e che la soluzione rimanga limpida.

Successivamente, sciogliere T-M-R-H-B-T-u e DIEA in DMF e aggiungere questa miscela alla resina. Eseguire la reazione durante la notte utilizzando azoto secco per fornire agitazione dopo la protezione FMD e la coniugazione degli amminoacidi. Lavare la resina con DCM e lasciarla asciugare per la completa scissione del peptide dalla resina.

Aggiungere una soluzione contenente il 92,5% di TFA, il 2,5% di acqua, il 2,5% di TIS e il 2,5% di etano di tiolo alla resina peptidilica per tre ore a temperatura ambiente per ottenere una protezione profonda globale e la scissione della resina. Far precipitare i prodotti peptidici grezzi utilizzando etere etilico anidro freddo drenando la soluzione preparata in 40 millilitri di etere eyl. Centrifugare a quattro gradi Celsius e 4.000 g per 20-25 minuti.

Ripetere questo passaggio per consentire il lavaggio del precipitato con etere etilico anidro reus freddo. Sospendere i precipitati in acqua e liofilizzare, quindi risospendere i prodotti ottenuti in prova di ACEDONITE TFA acquosa allo 0,1%. Eseguite cromatografie liquide ad alte prestazioni o analisi HPLC con una colonna analitica C 18.

Per analizzare ogni peptide, utilizzare una portata di un millilitro al minuto e la rilevazione a 214 nanometri e 550 nanometri. Successivamente, eseguire l'HPLC semi-preparativa su una colonna C 18 per la purificazione dei peptidi. Utilizza una portata di quattro millilitri al minuto e un rilevamento a 214 nanometri e 550 nanometri per tutte le corse.

Utilizzare gradienti lineari prima di eseguire la reazione di ossidazione. Confermare la corretta identità dei peptidi da MALDI secondo il protocollo del produttore. Sciogliere l'FTA in soluzione salina tamponata con fosfato aerato.

Assicurati che il pH sia compreso tra 7,0 e 7,5. Dopo l'aggiunta del peptide, mutare la reazione durante la notte per consentirgli di reagire fino al completamento. Purificare il prodotto utilizzando HPLC in fase inversa e analizzare mediante spettrometria di massa come prima: liofilizzare il DF puro tat e sospendere in 200 microlitri di acqua per misurare la concentrazione.

Per prima cosa, Resus sospendere un'aliquota del DF tat purificato in 149 microlitri di soluzione di TCEP da 50 millimolari, lasciare che il campione reagisca per circa 20 minuti. In questa fase, il DF tat viene ridotto alla sua controparte monomerica F tat per eliminare l'estinzione dell'assorbanza che si verifica a causa della stretta vicinanza del quarto piano TMR e del DF tat. Aggiungi tutte le soluzioni a un CVE al quarzo e misura l'assorbanza a 556 nanometri.

Usando la legge della birra. Determinare la concentrazione della soluzione. Ciò corrisponde alla concentrazione di FTA.

Dividi la concentrazione di FTA per due per ottenere la concentrazione di dfta. Far crescere le cellule in un terreno appropriato fino all'80-90% di fluenza in un'atmosfera umidificata a 37 gradi Celsius contenente il 5% di CO2, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS e una volta con NRL 15. Incubare le cellule con cinque micromolari df tat con o senza carico, come la proteina fluorescente verde potenziata e mantenerle a 37 gradi Celsius per un'ora per indurre perdite endosomiali dopo l'incubazione.

Lavare le cellule tre volte con eparina in terreno L 15 per rimuovere il DF tat legato alla membrana plasmatica delle cellule. Come immagine finale, le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza visualizzano DF tat utilizzando una proteina fluorescente rossa o un filtro RFP per valutare la differenza tra F TAT e D ftt. Le cellule heela vengono incubate con ciascun peptide per determinare la differenza nella loro localizzazione cellulare.

Come illustrato di seguito, l'FTA si localizza in una distribuzione punteggiata. Questa distribuzione è coerente con il peptide che rimane intrappolato all'interno degli endosomi. Al contrario, il segnale fluorescente di dfta mostra una distribuzione omogenea in tutto il citosol e nel nucleo.

La distribuzione citosolica di DF tat è osservata in un certo numero di linee cellulari diverse. Le immagini 20 x mostrano che una percentuale molto alta in un piatto mostra una distribuzione citosolica di DF tat senza tossicità cellulare, come visto dalla colorazione nucleare no cyt blue per determinare se la perdita endosomiale mediata da dfta rilascia grandi proteine nel citosol delle cellule. L'EGFP è stato utilizzato per rilevare la consegna di proteine correttamente ripiegate.

L'EGFP ha mostrato una distribuzione citosolica e nucleare fluorescente verde, simile a quella osservata per la DF tat in oltre il 90% delle cellule senza tossicità osservabile Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le cellule non devono essere eccessivamente confluenti. Inoltre, le celle devono essere lavate accuratamente per rimuovere l'FPS prima di aggiungere df tap.