Name: La produzione di DNA a doppia elica Ministrings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Impara a produrre DNA ministrings lineari covalentemente chiusi con un sistema semplice in un solo passaggio. Questo metodo efficiente migliora il trasferimento genico nelle cellule eucariotiche in meno di otto ore.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano i scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (NSERC) per il finanziamento di questo lavoro.

1. Preparazione di Media e Culture <ol><li> Per LB + Amp: Preparare 500 ml di Luria-Bertani brodo (LB) sterilizzati con autoclave a 121 ° C per 30 minuti. Supplemento con ampicillina fino ad ottenere una concentrazione finale di 100 ug / ml di ampicillina e conservare a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per TB + Amp: Preparare per le grandi (500 ml o superiore) volumi di Ministring produzione. Preparare 600 ml di sterile Terrific Broth (TB) sterilizzati in autoclave a 121 ° C per 30 min. Supplemento con ampicillina fino ad ottenere una concentrazione finale di 100 ug / ml di ampicillina e conservare a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per LB agar + Amp: Preparare sterili piastre di agar LB preparando LB + Amp integrata con 15 g / L di agar. Aliquota di circa 15 - 20 ml in piastre di Petri sterili e conservare a testa in giù a 4 ° C fino al momento. </li><li> Preparare un piatto striscia di W3NN [PDMS] da asetticamente striature W3NN [PDMS] celle su agar LB + Amp. Incubare la piastra di overnight a 30 ° C, fino singole colonie possono essere osservati. Non incubare W3NN di sopra di questa temperatura per evitare derepressing espressione protelomerase. </li><li> Trasferire asetticamente 5 ml di LB + Amp in una provetta sterile. Preparare una cultura durante la notte di W3NN [PDMS] inoculando questo volume con una singola colonia dalla piastra consecutive. Incubare la notte coltura a 30 ° C in un agitatore a 230-250 rpm. </li></ol> 2. fase di crescita <ol><li> Asetticamente trasferimento 10 ml di LB + Amp in una sterile 125 ml beuta e inoculare con 100 ml di una notte W3NN [PDMS] cultura nel preparato LB + Amp, facendo una diluizione 1: 100. <ol><li> Per i volumi superiori aggiungere 500 ml di cultura durante la notte in 50 ml di TB + Amp in un pallone da 250 ml Erlenmeyer, invece di LB + Amp. </li><li> In alternativa, utilizzare come secondo la cultura &quot;rappresentante&quot; al punto 2.2. </li></ol></li><li> Incubare in un incubatore agitazione a 30 ° C e 250 rpm fino alla culture raggiunge metà alla fase logaritmica tardiva, indicato da una densità ottica (OD) o l&#39;assorbanza: A 600 = 0,8. Dopo 1-2 ore, il mezzo dovrebbe cominciare ad apparire torbido a occhio nudo. <ol><li> Trasferire asetticamente 1 ml di cultura ad una provetta spettrofotometro pulito. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza luce utilizzando uno spettrofotometro UV-vis con la lunghezza d&#39;onda di 600 nm impostato. Usare 1 ml di media in cui le cellule sono state coltivate per impostare il vuoto (LB o TB). Facoltativamente, utilizzare la cultura rappresentante dal punto 2.1.3 per questo passo, invece. </li><li> Se la cultura non ha ancora raggiunto la OD del caso, tornare al shaker e verificare ancora una volta ogni mezz&#39;ora. Controllare il OD più frequentemente come la A 600 si avvicina a 0,8. </li></ol></li><li> Una volta che la cultura ha raggiunto la fase di log in ritardo, indicato con A 600 = 0,8, in modo asettico trasferire la cultura in provette da centrifuga 50 ml sterili. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione della coltura a 10.000 xg per 10 min. Controllare per un peLLET sul fondo della provetta. </li><li> Decantare il surnatante eliminato in un contenitore per rifiuti biologici appropriata. Non disturbare il pellet. </li><li> Ripetere i passaggi 2,4-2,5 fino a quando tutte le cellule sono state raccolte. </li><li> Risospendere il pellet in 100 ml LB + Amp. Aspirare con una micropipetta o utilizzare un vortex. Per una maggiore produzione Ministring, risospendere il pellet da una cultura Amp 50 ml TB + in 1 ml di fresca mezzi LB + Amp. </li></ol> 3. Ministring Produzione <ol><li> Asetticamente aggiungere 20 ml di LB + Amp in una beuta da 125 ml e di calore a 42 ° C. Per una maggiore produzione Ministring, preparare 500 ml di LB + Amp, preriscaldato a 42 ° C. </li><li> Trasferire la risospensione nel mezzo preriscaldato. </li><li> Incubare a 42 ° C e 250 rpm fino fase di log passato, indicato con A 600 = 1,0. Non lasciare 20 ml di coltura a 42 ° C oltre 1 ora. </li><li> Ridurre la temperatura a 37 ° C e lasciare la coltura di un addizionale 90 min. Per 500 ml, lasciare la cultura per un periodo di induzione supplementare di 90-120 min e non diminuire la temperatura. </li><li> Ridurre la temperatura a 30 ° C e lasciare cultura agitazione a 200 rpm per un ulteriore periodo di temperatura downshift di 2 ore. Per 500 ml, estendere la scalata di temperatura per 4 ore o durante la notte. </li></ol> 4. Ministrings raccolta <ol><li> Asetticamente trasferire la cultura in provette da centrifuga 50 ml sterili. Centrifugare a 10.000 xg per 10 min e controllare un pellet. </li><li> Decantare il surnatante in un contenitore per rifiuti biologici appropriata senza disturbare il pellet. Ripetere fino a quando tutte le cellule sono state raccolte. </li><li> Conservare il pellet per l&#39;estrazione plasmide con qualsiasi estrazione commerciale e kit per la rimozione delle endotossine o congelare il flash in azoto liquido e conservare a -80 ° C per l&#39;estrazione successiva. </li></ol>

<ol><li>Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+motifs+present+in+bacterial+DNA+rapidly+induce+lymphocytes+to+secrete+interleukin+6%2C+interleukin+12%2C+and+interferon+%CE%B3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).</li>
<li>Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+from+plasmid+DNA+gene+therapy+vectors+is+negatively+affected+by+CpG+dinucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides.</a> Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).</li>
<li>Darquet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle%3A+an+improved+DNA+molecule+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer.</a> Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).</li>
<li>Gracey Maniar, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle+DNA+vectors+achieve+sustained+expression+reflected+by+active+chromatin+and+transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level.</a> Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).</li>
<li>Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercoiled+minivector+DNA+resists+shear+forces+associated+with+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery.</a> Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).</li>
<li>Hacein-bey-abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li>
<li>Nafissi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+ministrings%3A+highly+safe+and+effective+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).</li>
<li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+minimal-size+vector+%28MIDGE%29+improves+transgene+expression+in+colon+carcinoma+cells+and+avoids+transfection+of+undesired+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA.</a> Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).</li>
<li>Wang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+micro-linear+vector+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+delivery+and+its+application+for+EBV+positive+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors.</a> PLoS One. 7 (10), (2012).</li>
<li>López-Fuertes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+with+linear+minimalistic+%28MIDGE%29+vectors+confers+protection+against+Leishmania+major+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice.</a> Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).</li>
<li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+size+MIDGE+vectors+improve+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo.</a> In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).</li>
<li>Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PY54%2C+a+linear+plasmid+prophage+of+Yersinia+enterocolitica+with+covalently+closed+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends.</a> Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).</li>
<li>Nafissi, N., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+in-vivo+linear+covalently+closed+DNA+vector+production+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system.</a> Microb Cell Fact. 11 (1), 154(2012).</li>
<li>Xu, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+transcriptional+regulatory+elements+for+constructing+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors.</a> Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).</li>
<li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+induced+by+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).</li>
<li>Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+linear+covalently+closed+deoxyribonucleic+acid+by+Q-anion+exchange+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography.</a> J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).</li>
<li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+amplification+in+Escherichia+coli+after+temperature+upshift+is+impaired+by+induction+of+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).</li>
<li>Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+one-step+heat-inducible+in+vivo+mini+DNA+vector+production+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system.</a> PLoS One. 9 (2), (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Descriviamo qui un sistema semplice per la produzione di ministrings LCC DNA utilizzando un calore inducibile protocollo one-step, che non richiede particolari attrezzature oltre a quello che viene utilizzato nella crescita batterica tipica e manipolazione. ministrings DNA sono stabili, cassette di espressione del DNA lineari senza torsione, prive di elementi genetici procarioti. Essi possono essere utilizzati al posto dei metodi convenzionali per trasferimento genico, espressione di geni reporter, nonché nelle valutazioni verso l&#39;efficienza di espressione del transgene in sistemi eucariotici. ministrings DNA combinano la biocompatibilità e l&#39;aumento dei benefici di efficienza trasfezione di vettori &quot;mini&quot; con il profilo di sicurezza superiore di vettori di DNA lineari. Il nostro robusto un&#39;unica fase nella piattaforma di produzione vivo rapidamente e facilmente produce ministrings DNA per qualsiasi applicazione trasferimento genico senza la necessità di più processi costosi in vitro. Ci sono diversi passaggi critici digarantire una produzione ottimale Ministring (figure 2 e 3). induzione di calore è la fase più critica per Ministring produzione. Completa mancanza di Ministring produzione è molto probabilmente a causa della mancanza di induzione di calore (le cellule conservate a 30 ° C), dove la repressione di espressione protelomerase impedisce la conversione del precursore plasmide per LCC Ministring. A seguito del protocollo di induzione di calore, si aspettano una efficienza di produzione di circa il 75%. induzione di calore è ottimale, mentre le cellule sono in fase di log. Anche se non vi è alcuna differenza statisticamente significativa nella Ministring PE quando si utilizzano le cellule in fase stazionaria ( &quot;Overgrown&quot;, figura 3), abbiamo fatto osservare quasi una diminuzione del 50% nel rendimento complessivo plasmide. I rendimenti dipenderanno dal protocollo di estrazione plasmide usato. Per la produzione ottimale Ministring, innescare induzione di calore mentre le cellule sono in fase di log. produzione Ministring Poor sarà molto probabilmente il risultato di cambio marcia temperatura prolungata o insufficient scalata della temperatura. Passaggio alla marcia superiore della temperatura prolungata è sconsigliato in quanto questo attiva il E. coli risposta allo shock termico 15, che possono inibire l&#39;attività protelomerase e interferire con la stabilità plasmide. Pertanto, i tempi della scalata di temperatura è un altro passo fondamentale per la produzione di Ministring efficiente. Senza tempo di incubazione supplementare a 30 ° C, Ministring efficienza di produzione è risultato essere molto poveri ( &quot;cancellazione anticipata&quot;, figura 3). Ciò può essere attribuito alla quantità di tempo richiesto per l&#39;espressione e l&#39;attività Tel. L&#39;originario profago codifica PY54 Tel protelomerase infetta normalmente Yersinia, che cresce in modo ottimale intorno a 28 ° C 12, indicando che 30 ° C può anche essere più ottimale per l&#39;attività Tel. Il sistema di produzione MINIVECTOR DNA utilizza una piattaforma in vivo per generare alta qualità batteriche minivectors DNA libero-sequenza. Le modifiche al protocollo PossoNCLUDE modifica i terreni di crescita per ottimizzare plasmid e produzione di proteine ​​al fine di promuovere la crescita delle cellule durante la fase di crescita (TB anziché LB), o aumentare MiniString produzione ed efficienza di conversione. Per i volumi più grandi della cultura (200 ml e maggiori), scalata di temperatura e di incubazione a 30 ° C può essere esteso durante la notte senza grave impatto negativo sulla Ministring PE. Abbiamo incluso modifiche nostro protocollo per 500 ml culture come un esempio. Purificazione di ministrings DNA può essere accelerato attraverso in vitro endonucleasi digestione della spina dorsale procariote. Ci sono un certo numero di siti bersaglio di endonucleasi (ad esempio, PI-SCEI, Pvul, SCAI) disponibile sul backbone procariotico del plasmide precursore, che può essere tagliato per esporre lineari estremità aperte, permettendo degradazione in vitro del backbone procariotico. Isolamento di ministrings da altre specie vettore può essere ottenuta anche attraverso la cromatografia a scambio anionico membrana 16. Una limitazione di corrente associata con il sistema produttivo vettoriale LCC DNA è la necessità di purificazione del DNA Ministring da altri prodotti LCC e CCC. Sebbene facilmente purificato utilizzando metodi di isolamento plasmide standard, la fase di isolamento può essere ancora uno svantaggio in un ambiente su larga scala. La separazione del Ministring può richiedere molto tempo utilizzando AGE se il Ministring e la spina dorsale procariote LCC sono troppo simili per dimensioni. In alternativa, l&#39;anione cromatografia a scambio membrana può fornire una migliore separazione dei ministrings da specie CCC vettore 16. Temperatura cambio marcia può essere un altro potenziale limitazione come alte temperature attivano anche la risposta di shock termico in E. coli, che influisce negativamente sulla proteina ricombinante produce 17 e di conseguenza ridurre i tassi di plasmide per Ministring conversione. Riportiamo altrove ottimizzazioni della piattaforma di produzione di aggirare e / o attenuare tali effetti di shock termico 18. Noisono inoltre attualmente ottimizzare i metodi per eliminare o ridurre la contaminazione LCC dorsale procarioti in vivo. l&#39;integrazione cromosomica del DNA Ministring LCC interrompe il cromosoma ospite e sottopone la cellula all&#39;apoptosi. Non solo questo ridurre i potenziali conseguenze negative di mutagenesi inserzionale quali oncogenesi e silenziamento di geni adiacenti, migliorando in tal modo la sua sicurezza; l&#39;effetto letale può anche servire come un metodo ideale per knock-in e studi sostituzione genica senza gli effetti collaterali associati e danni di integrazione. Vettori MiniString DNA può essere applicato verso il trasferimento e l&#39;espressione dei geni per le proteine ​​terapeutiche, RNA, anticorpi o antigeni in un determinato bersaglio in vivo o sostituire un allele funzionale malfunzionamento o non. La semplice calore inducibile in vivo sistema di produzione di uno stadio permette vettori MiniString DNA per produrre facilmente per applicazioni cliniche o industriali.

L&#39;obiettivo è quello di produrre quantità scalabili di lineare covalente chiuso minivectors (LCC) DNA utilizzando un solo passaggio in vivo DNA sistema di produzione Ministring semplice e ad alto rendimento termico-inducibile. ministrings DNA forniscono una strategia sicura ed efficace non virale per fornire DNA. Essi combinano la sicurezza dei vettori LCC con l&#39;efficienza di minicircoli DNA, e offrono anche un&#39;alternativa più sicura per i vettori di virus di derivazione senza compromettere l&#39;efficienza di trasfezione. Affinché un sistema di consegna transgene successo, il vettore DNA deve entrare nella cellula host di destinazione ed esprimere il transgene codifica (s). Ci sono diverse barriere cellulari che devono essere superate nella pratica, soprattutto nei mammiferi. Per evitare la degradazione da nucleasi siero e rilevazione immune sistema reticolo-endoteliale, il vettore di DNA deve essere bio e compatibile immunitario con sistema di destinazione. DNA non protetto è rapidamente digerito da nucleasi plasmae la membrana plasmide è composto di barriere lipoproteine ​​dense così il vettore di DNA deve poter rapidamente attraversare la membrana plasmatica delle cellule bersaglio. Una volta nella cellula, vettori devono attraversare citoplasma e passare attraverso la membrana nucleare per inserire il nucleo di espressione del transgene. le tecniche di trasferimento dei geni non virali si concentrano sulla valorizzazione del tessuto-e cellule-targeting. Tuttavia, l&#39;uso di plasmidi convenzionali con queste tecniche riduce l&#39;efficienza di trasfezione per la presenza di sequenze batteriche immunogenici, che fa tacere rapidamente l&#39;espressione genica 1,2. plasmidi convenzionali tipicamente portano geni resistenti agli antibiotici per la manutenzione in sistemi procarioti. Tuttavia, questi possono produrre effetti potenzialmente negativi per ospiti umani oa conferire resistenza alla naturale flora host tramite effetti trasferimento genico orizzontale. Plasmidi convenzionali contengono anche dinucleotide CpG motivi 2, che può innescare una risposta immunostimolante indesiderata, potenzialmenteridurre o tacere espressione del transgene. Come si comprendono solo della cassetta di espressione eucariotica, minivectors DNA, come minicircoli DNA 3, sono una migliore alternativa per la consegna del gene in quanto presentano migliorate biodisponibilità extracellulare e intracellulare e una migliore espressione genica causa delle loro dimensioni ridotte e l&#39;assenza di elementi procariote immunostimolante 4. Le dimensioni ridotte tariffe vettore migliori rispetto alla resistenza alle forze di taglio associate alla somministrazione in vivo di un sito di destinazione 5. Il numero di copie superiore del vettore per unità di massa richiede meno reagente di trasfezione, diminuendo così la tossicità. Tuttavia, nel caso di integrazione vettore casuale in un cromosoma ospite, circolarmente covalentemente chiuso vettori (CCC), inclusi sia minicircoli DNA e plasmidi convenzionali, conferire continuità molecolare e quindi può portare a mutagenesi inserzionale, che può avere conseguenze devastanti <sup&gt; 6. Comparativamente, l&#39;integrazione di un vettore di DNA lineare interrompe il cromosoma e avvia percorsi di morte cellulare, eliminando così la cellula mutante dalla popolazione di cellule proliferanti e prevenire mutagenesi inserzionale 7. Minimalista espressione genica immunologicamente definito (MIDGE) Vettori 8 e vettori micro-lineare 9 (MiLV) sono vettori LCC DNA sviluppati in vitro. Vettori Midge hanno mostrato fino ad un 17-fold migliorato l&#39;espressione del transgene in vivo rispetto al DNA plasmide convenzionale vettori 11, e hanno dimostrato risultati promettenti in vaccino 10 e il cancro 8 terapia genica. Inoltre, a causa della struttura senza torsione del MINIVECTOR LCC, meno reagente di trasfezione è necessaria rispetto alla controparte CCC supercoiled, riducendo così la tossicità 7. Le nostre avanzate vettori LCC DNA, ministrings DNA, hanno dimostrato l&#39;efficienza espressione superiore e bioavailabilità 7. Inoltre, ministrings DNA sono prodotti su un vivo sistema di produzione di uno stadio di calore-inducibile in, un espediente e conveniente alternativa al Midge e MiLV LCC vettori, che richiedono più passaggi in vitro. Il sistema di produzione Ministring DNA da dimostrare è un semplice processo di calore-inducibile eseguiti in vivo, il che rende sia conveniente e facilmente scalabile. Questo sistema sfrutta la Yersinia enterocolitica batteriofago Tel / PAL PY54-derivato sistema ricombinazione 12 protelomerase per separare il minimo cassetta di espressione eucariotica dalla spina dorsale plasmide procariote. Abbiamo progettato Escherichia coli (W3NN) per esprimere Tel protelomerase sotto il controllo del calore-inducibile batteriofago λ promotore, cI [Ts] 857 13. Al espressione, Tel protelomerase agisce sui siti di destinazione PAL presenti all&#39;interno di &quot;Super Sequence&quot; (SS) siti situati sul plasmide precursoreper produrre prodotti LCC, da cui il Ministring DNA può essere purificato (Figura 1). I siti SS sul plasmide DNA Ministring precursore codificare anche siti bersaglio per altre ricombinasi tra cui Cre ricombinasi (LOX), TELN protelomerase (telRL) e Flp ricombinasi (FRT), facilitando in tal modo la produzione di LCC isogenico e minivectors CCC da un plasmide precursore. Inoltre, ogni sito SS è affiancato su entrambi i lati da SV40 enhancer sequenze (SV40e), che servono a migliorare la traslocazione nucleare 14. Abbiamo dimostrato altrove che successiva aggiunta di SV40e conferisce progressivamente corrispondente aumento di efficienza di trasfezione 7. Il plasmide precursore (pDNA MiniString o PDMS) contiene un polylinker (Figura 1) per facilitare l&#39;inserimento di qualsiasi gene di interesse desiderato in fusione trascrizionale con il reporter fluorescente verde (GFP). La tecnologia MINIVECTOR DNA puòessere utilizzata al posto di metodi convenzionali per trasferimento genico, espressione di geni reporter, e le valutazioni verso l&#39;efficienza di espressione del transgene in sistemi eucariotici. ministrings DNA combinano la biocompatibilità e l&#39;aumento dei benefici di efficienza trasfezione di vettori &quot;mini&quot; con il profilo di sicurezza superiore di vettori di DNA lineari. La nostra solida piattaforma di produzione di uno stadio rapidamente e facilmente produce ministrings DNA per qualsiasi applicazione trasferimento genico e offre un profilo di sicurezza più elevato.

<table><tbody><tr><td>E. coli W3NN</td><td>Ceppo Mediphage</td><td></td><td>per l'elaborazione di somministrazione: Nafissi & Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td> Plasmide genitore di <td>Mediphage</td><td></td><td>per il trattamento di somministrazione: noto anche come pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Terreni di coltura disidratati: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Brodo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar disidratato</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di Milipore Ultrapura</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Modello: Guanti chirurgici con sistema di purificazione dell'acqua Mili-Q Advantage A10</td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Piastre di Petri con coperchio trasparente con cresta rialzata (100&nbsp; x&nbsp; 15&nbsp; Fisher</td> <td>Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Provette</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Cuvetta</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Provette Falcon&</td><td>nbsp; BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr> <tr><td>provette da centrifuga sterili da 50 ml</td><td>&nbsp; FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche monouso in polistirene Falcon 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche monouso in polistirene Falcon 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (100-1.000&nbsp; &mu; l)</td><td>Micropipettatore FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>(20-200&nbsp; &mu; l)</td>Puntali per pipette sterili <td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>(100-1.250&nbsp; &mu; l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette sterili (1-200&nbsp; &mu; l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Bruciatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per incubatrice</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Pallone sterile per Erlenmeyer (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pallone sterile di Erlenmeyer (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pallone sterile di Erlenmeyer (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Modello: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Floor Centrifuge</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Modello: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Modello: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA da 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

la produzione di dna a doppia elica ministrings

Production of Double-stranded DNA Ministrings

Abbiamo costruito lineari covalente chiusi minivectors (LCC) del DNA come un non-virale gene-delivery vettore alternativo prodotto tramite una semplice piattaforma in vivo. Ministrings DNA possiedono un profilo di sicurezza intensificata e anche fornire in modo efficiente il carico del DNA di cellule bersaglio. vettori di DNA convenzionali portano sequenze procariote indesiderati, tra cui geni di resistenza agli antibiotici, motivi CpG, e le origini di replicazione batteriche, che possono portare alla stimolazione della risposta immunitaria dell&#39;ospite. La biodisponibilità di vettori di DNA convenzionali è anche compromessa a causa della loro dimensione molecolare maggiore. La loro natura circolare può anche impartire l&#39;integrazione cromosomica, che porta alla mutagenesi inserzionale. sequenze batteriche sono asportati dal minivectors DNA, lasciando solo il gene di interesse (GOI) e necessari elementi di espressione eucariotiche. I nostri minivectors LCC DNA, o ministrings DNA, sono privi di sequenze batteriche immunogeniche; migliorando quindi esimobiodisponibilità EIR ed espressione GOI. Nel caso di vettori integranti nel cromosoma, il Ministring LCC DNA lethally perturbare cromosoma ospite, eliminando così il mutante potenzialmente pericolosa dalla popolazione di cellule proliferanti. Di conseguenza, ministrings DNA offrono i vantaggi di DNA &#39;minicircolo&#39;, eliminando il rischio di eventi di integrazione vettore indesiderati. In confronto ai plasmidi convenzionali e le loro controparti in modo covalente chiusi isogenici circolari (CCC), ministrings DNA dimostrano biodisponibilità superiore, l&#39;efficienza di trasfezione, e la cinetica citoplasmatici - che quindi richiedono minori quantità di tensioattivi cationici per un&#39;efficace trasfezione di cellule bersaglio. Abbiamo costruito un solo passaggio inducibile sistema vivo per la produzione di ministrings DNA in Escherichia coli che è semplice da utilizzare, rapida e scalabile.

Dopo l&#39;estrazione del DNA, il plasmide precursore residuo, LCC spina dorsale procariote, e il Ministring DNA sarà recuperato. resa plasmide complesso e la purezza possono essere valutati utilizzando uno spettrofotometro. Purezza è stimato utilizzando il rapporto tra l&#39;assorbanza a 260 nm e 280 nm (A260 / A280), dove un rapporto di 1.9-2.0 è ottimale. Tutti i prodotti LCC e CCC possono essere separati mediante elettroforesi su gel di agarosio (AGE) (Figura 2). AGE visualizza i risultati di Ministring produzione dopo l&#39;induzione di calore, prima di Ministring purificazione. Una valutazione qualitativa della produzione MiniString può essere effettuato in questa fase confrontando intensità della banda del Ministring (2.4 kb) al plasmide genitore (5,6 kb) (Figura 2). Ministring DNA può essere recuperato mediante protocolli di estrazione gel plasmide standard di seguito l&#39;età. La figura 3 riassume Ministring efficienze produttive in varie condizioni che possono verificarsi durante il trasportoing fuori del protocollo. Ministring efficienza di produzione è stato determinato sulla base di intensità della banda del DNA utilizzando il programma di analisi del produttore. Qualsiasi programma di densitometria simile può essere utilizzato per analizzare i risultati di età. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Panoramica di Ministring produzione (A) Il vettore principale contiene un polylinker in fusione trascrizionale con un gene reporter, incorniciato da due siti SS. La spina dorsale codifica di beta-lattamasi per la resistenza ampicillina e contiene anche diversi siti di taglio uniche per la spina dorsale per la digestione in vitro. (B) Panoramica del protocollo principale. Procedura 2) fase di crescita e 3) Ministring Produzione sono rappresentati in un diagramma di fornire uno schema generale delle fasi coinvolte, evidenziando la semplicità del protocollo. Induzione (C) Ministring. Induzione di calore inattiva il repressore sensibile alla temperatura, consentendo l&#39;espressione tel seguita da attività di Tel sui siti delle SS nei plasmidi genitore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Figura 2: Ministring produzione dopo deviazioni dal protocollo. 1: Controllo, 2: non indotte, 3: Coperto di vegetazione, 4: Overinduced, 5: rimozione precoce. Ministring DNA è di circa 2,4 kb, LCC spina dorsale è di 3 kb, e pNN9 plasmide genitore è di 5,6 kb. intensità della banda delle bande MiniString e LCC backbone cadere con deviazioni dal protocollo, indicando in basso rendimento Ministring. Da sinistra a destra: 1 kb scaletta dal New England Biolabs; Controllo, seguendo il protocollo; Non indotte, nessun cambio marcia di temperatura; Coperto di vegetazione, temperatura di cambio marcia During fase stazionaria; Overinduced, passaggio alla marcia superiore di temperatura esteso; rimozione precoce, senza scalata temperatura. I plasmidi sono stati estratti utilizzando il kit di Omega-Biotek EZNA plasmidi Mini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Figura 3:. Effetti di deviazioni dal protocollo sulla Ministring efficienza produttiva (PE) I risultati sono la media di 3 prove. PE stimato in base a intensità della banda relativa misurata utilizzando AlphaImager HP dopo l&#39;età. Le deviazioni si verificano le seguenti operazioni: controllo, a seguito del protocollo; Non indotte, nessun cambio marcia la temperatura al punto 2; Coperto di vegetazione, cambio marcia temperatura ha cominciato durante la fase stazionaria al punto 1.6; Overinduced, cambio marcia temperatura esteso al punto 2.3; rimozione precoce, le cellule rimosso ed estrattosenza scalata temperatura alla fase 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Il minivettore di DNA lineare covalentemente chiuso (LCC) è un vettore di consegna genica non virale che offre un'elevata efficienza di trasfezione ed è rilevante per qualsiasi applicazione di consegna del DNA. Il sistema di produzione è semplice, rapido e scalabile in vivo. Il seguente protocollo fornisce istruzioni visive passo dopo passo per la produzione di somministrazioni di DNA.

La produzione di DNA a doppia elica Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare minivettori di DNA lineari e covalentemente chiusi, sicuri, o ministringhe di DNA, utilizzando un sistema di produzione semplice, in un unico passaggio. Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei vettori di DNA e del trasferimento genico. In particolare, come produrre in modo efficiente vettori per il trasferimento genico più sicuri e più efficaci, denominati ministringhe di DNA.Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un approccio semplice ed efficiente, in un unico passaggio e in vivo, per la produzione di ministring di DNA. Per preparare i mezzi, dopo aver ottenuto 500 millilitri di LB, 600 millilitri di TB e agar LB per le piastre, sterilizzare in autoclave a 121 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo il raffreddamento, integrare ciascun mezzo con ampicillina, alla concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro.Conservare il terreno liquido a quattro gradi Celsius. Quindi, versare da 15 a 20 millilitri di agar LB aggiunto di amp in piastre di Petri sterili e, dopo il raffreddamento, conservare capovolte a quattro gradi Celsius. Seminare per striscio le cellule W3NN PDMS su agar LB aggiunto di ampicillina e incubare la piastra a 30 gradi Celsius per tutta la notte fino a quando si possono osservare colonie singole.Quindi, partendo da una singola colonia della piastra di semina, preparare una coltura notturna di W3NN PDMS inoculando cinque millilitri di LB aggiunto di ampicillina. Incubare la coltura a 30 gradi Celsius e da 230 a 250 giri al minuto per tutta la notte. In un matraccio Erlenmeyer da 125 millilitri, inoculare 10 millilitri di LB aggiunto di ampicillina con 100 microlitri della coltura notturna di W3NN PDMS, ottenendo una diluizione 1 su 100.Incubare la coltura a 30 gradi Celsius e 250 giri al minuto fino a quando non appare torbida ad occhio nudo e raggiunge la fase logaritmica media o avanzata. Successivamente, trasferire 1 millilitro di coltura in una cuvetta pulita. Poi, utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis con una lunghezza d'onda di 600 nanometri e il mezzo impiegato per la crescita delle cellule, impostare il bianco prima di misurare l'assorbanza della luce della coltura.Se la coltura non ha ancora raggiunto il DO appropriato, riporla nell'agitatore e verificare nuovamente ogni mezz'ora. Una volta che la coltura ha raggiunto la fase esponenziale media, trasferirla in provette da centrifuga sterili da 50 millilitri. Pellettare le cellule centrifugando a 10.000 ×g per 10 minuti.Decantare il soprannatante limpido in un contenitore appropriato per rifiuti biologici, e utilizzare 100 microlitri di LB più amp per risospendere il pellet mediante pipettaggio su e gi&ugrave; o vortex. Per indurre la produzione di ministring, aggiungere 20 millilitri di LB più amp in un matraccio Erlenmeyer da 125 millilitri e riscaldare a 42 gradi Celsius. Trasferire il pellet risospeso nel mezzo preriscaldato e incubare a 42 gradi Celsius e 250 giri al minuto oltre la fase logaritmica, oppure per non più di un'ora nel caso di 20 millilitri.Ridurre la temperatura a 37 gradi Celsius e lasciare la coltura per ulteriori 90 minuti. Successivamente, ridurre ulteriormente la temperatura a 30 gradi Celsius e lasciare la coltura in agitazione a 200 rpm per due ore. Per raccogliere le ministringhe, trasferire la coltura in provette da centrifuga sterili da 50 millilitri.Quindi centrifugare a 10.000 × g per 10 minuti ed esaminare la presenza di un pellet. Infine, decantare il sopranatante ed utilizzare un kit commerciale di estrazione e rimozione degli endotossine per isolare il plasmide. Dopo l'estrazione del DNA, il plasmide precursore residuo, il vettore procariotico LCC e la ministring di DNA verranno recuperati e potranno essere separati mediante elettroforesi su gel di agarosio, come mostrato qui.Prima della purificazione del ministring, a questo stadio è possibile effettuare una valutazione qualitativa della produzione del ministring confrontando l'intensità della banda del ministring con quella del plasmide parentale. Questa figura riassume le efficienze di produzione del ministring probabili in diverse condizioni durante l'esecuzione del protocollo. L'efficienza di produzione del ministring è stata determinata in base all'intensità della banda del DNA.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata interamente in meno di otto ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rispettare i corretti cambiamenti di temperatura. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come l'elettroforesi su gel di agarosio o la digestione con endonucleasi possono essere eseguiti al fine di isolare ministringhe o verificare l'efficienza di produzione.Questa tecnica può migliorare notevolmente il trasferimento genico nelle cellule eucariotiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come massimizzare la produzione di ministring di DNA utilizzando la nostra piattaforma produttiva. Non dimenticare che, quando si lavora con bromuro di etidio, gli illuminatori a UV possono essere estremamente pericolosi e si dovrebbe indossare sempre un'adeguata dotazione di sicurezza in laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine ​​del sistema di replica batteriofago.

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

Questo lavoro fornisce un metodo per la realizzazione di piattaforme microfluidici basati su gocciolina e l'applicazione di microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione di PCR di microsfere. Il metodo di microsfere-PCR permette di ottenere single-stranded DNA ampliconi senza separare DNA double-stranded.

Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded

Questo documento descrive un protocollo dettagliato per l'utilizzo di sonde di tensione basate sul DNA per visualizzare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie. Questo approccio può mappare le forze recettoriali &gt;4.7pN in tempo reale e può integrare le forze nel tempo.

Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie

Il protocollo fornisce istruzioni per modificare l'RNA con dimetilsolfato per esperimenti di profilazione mutazionale. Include il sondaggio in vitro e in vivo con due metodi alternativi di preparazione della libreria.

Sondare la struttura dell'RNA con profilo mutazionale del dimetilsolfato con sequenziamento in vitro e nelle cellule

L'arricchimento e il sequenziamento del DNA nascente associato alle proteine (eSPAN) sono stati sviluppati per rilevare l'abbondanza relativa di una proteina associata alla cromatina su due filamenti di DNA replicanti, rivelando così una comprensione molecolare della replicazione della cromatina e dei suoi processi accoppiati. Questo protocollo descrive le procedure eSPAN nelle cellule staminali embrionali (ES) di lievito e topi.

Analisi specifica dei filamenti di proteine in replicazione di filamenti di DNA tramite arricchimento e sequenziamento del metodo del DNA nascente associato a proteine

Questo protocollo dimostra l'esecuzione di un saggio a singola molecola per la visualizzazione dal vivo dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG. Descrive (1) la preparazione di un substrato di DNA, (2) la purificazione dell'elicasi CMG di Drosophila melanogaster marcata in fluorescenza, (3) la preparazione di una cella a flusso microfluidico per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e (4) il saggio di svolgimento del DNA a singola molecola.

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Questo video è una dimostrazione tecnico del protocollo di ibridazione per intero genoma piastrelle CGH array di percorso, che analizza l'intero genoma umano utilizzando solo 25-100 ng di DNA che può essere isolato da una varietà di fonti, tra cui materiale d'archivio formalina fisso.

Dimostrazione tecnica di ibridazione Whole Genome Array Comparative Genomic

Questo video dimostra il protocollo di immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP). MeDIP è una procedura di due giorni che estrae selettivamente i frammenti di DNA metilato da un campione di DNA genomico utilizzando anticorpi con specificità per 5-metilcitosina (anti-5 MC).

Immunoprecipitazione DNA metilato

Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.

Lentivirus Produzione

Impara a produrre DNA ministrings lineari covalentemente chiusi con un sistema semplice in un solo passaggio. Questo metodo efficiente migliora il trasferimento genico nelle cellule eucariotiche in meno di otto ore.

La produzione di DNA a doppia elica Ministrings

Esplora altri video