Valutazione della perigenitale Sensibilità e prostatica Mast attivazione delle cellule in un modello murino di Neonatale separazione materna

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare l'impatto dello stress precoce sul sistema urogenitale misurando la sensibilità meccanica perigenitale e l'attivazione dei mastociti all'interno della prostata in topi maschi C 57 black six sottoposti a separazione materna neonatale. Ciò si ottiene eseguendo prima la separazione materna neonatale su cucciolate di cuccioli di sei topi neri C 57 per indurre stress precoce per 20 giorni consecutivi. Il secondo passo consiste nel misurare la sensibilità meccanica perigenitale mediante l'applicazione di una serie di monofilamenti di Von Fre alla regione perigenitale.

Successivamente, la colorazione con blu di toluidina acidificata viene eseguita sulle sezioni del criostato della prostata del topo. Al fine di quantificare l'attivazione dei mastociti. I risultati mostrano che la separazione materna neonatale aumenta la sensibilità meccanica perigenitale e l'attivazione dei mastociti protesici sulla base delle nostre analisi comportamentali e istologiche.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la prostatite autoimmune sperimentale, è che incorpora l'esposizione allo stress durante lo sviluppo precoce, che precipita la sintomatologia più tardi nella vita, in modo simile a quanto osservato nei pazienti con prostatite cronica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del dolore pelvico cronico, come l'impatto dello stress precoce sul comportamento, e fornire prove istologiche di stati di dolore alterati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla prostatite cronica, può essere applicato anche ad altre sindromi dolorose funzionali come la cistite interstiziale, la sindrome della vescica dolorosa, la vulvodinia, la fibromialgia o l'emicrania.

Può anche essere applicato ad altre comorbilità psicologiche comuni come ansia e depressione Il giorno dopo la nascita, rimuovere la madre dalla gabbia di casa e metterla in un contenitore secondario pulito. Strofina una manciata di biancheria da letto tra le mani guantate pulite per mantenere l'odore della gabbia domestica, quindi trasferisci una profondità di uno o due centimetri della lettiera della gabbia domestica in un altoparlante di vetro da due litri pulito e adeguatamente etichettato. Inoltre, a circa la metà di qualsiasi materiale aggiuntivo per la lettiera di arricchimento presente nella gabbia domestica, come nidi o carta stropicciata, all'altoparlante di vetro successivo, posiziona tutti i cuccioli di una singola cucciolata nel becher preparato e posiziona immediatamente il becher a 33 gradi Celsius e 50% di umidità per 180 minuti.

Durante il periodo di incubazione separato, rimuovere la madre dal contenitore secondario e rimetterla nella gabbia di casa. Riporta la gabbia domestica nella sua posizione di alloggio appropriata all'interno del vivaio. Al termine del periodo di separazione, recupera la gabbia di casa e rimuovi la diga, mettendola in un contenitore secondario pulito.

Quindi rimuovi il becher dall'incubatrice e lascia cadere una manciata di lettiera tra le mani guantate pulite per mantenere l'odore della gabbia domestica mentre maneggi i cuccioli. Sposta delicatamente i cuccioli individualmente dal becher alla gabbia di casa e rimetti l'arricchimento e la lettiera rimasti nel becher nella gabbia di casa. Una volta che tutti i cuccioli sono stati restituiti, spostare la madre dal contenitore secondario alla gabbia di casa e riportarla nella posizione di alloggio appropriata all'interno del vivaio.

Ripetere l'intera procedura per ogni cucciolata sottoposta a separazione materna neonatale ogni giorno fino al 21° giorno postnatale. Quindi svezzare i cuccioli e ospitarli nelle stesse condizioni dei topi di controllo per tutta la durata dell'esperimento. Preparare l'area di prova posizionando un sottocuscinetto assorbente sotto un tavolo rialzato in rete metallica alto 55 centimetri

Il tavolo dovrebbe fornire spazio sufficiente per consentire all'investigatore di avvicinarsi dal lato inferiore senza spaventare i topi. Posiziona fino a 12 topi di otto settimane singolarmente sotto camere di plastica perforate trasparenti sopra il tavolo in rete metallica. Posiziona un oggetto pesante sopra le camere per evitare che i topi scappino.

Tenere la base di un monofilamento a tre punte da 22 grammi von frame ed esporre il monofilamento retratto. Posizionare la sonda in modo che il monofilamento sia orientato verticalmente. Quando il topo è vigile, immobile e il suo peso corporeo è distribuito uniformemente tra le zampe posteriori.

Applicalo sul lato sinistro o destro dello scroto, evitando la linea mediana fino a quando non si osserva una leggera flessione nel filamento. Tenere il monofilamento in posizione per 10 secondi o fino a quando l'animale non mostra una risposta positiva come uno scatto rapido o un salto o un comportamento di leccamento o morso diretto verso il monofilamento. Se un topo non si muove né mostra alcuna risposta positiva durante l'applicazione del monofilamento di dieci secondi, registrare un test di risposta negativa su tutti i topi che utilizzano filamenti della stessa dimensione, quindi passare al successivo monofilamento appropriato.

Continua a testare ogni mouse utilizzando il monofilamento successivo più grande o più piccolo, a seconda dei casi, per altre quattro applicazioni. Dopo che è stata osservata la prima risposta positiva, sezionare e quindi sezionare la criosezione, fissare il tessuto prostatico da topi di nove settimane in sezioni criogeniche spesse sette micron. Successivamente, preparare una soluzione madre di blu di toluidina all'1% aggiungendo un grammo di blu di toluidina O a 100 millilitri di etanolo al 70% e agitare la miscela fino a quando non entra in soluzione.

Conservare la soluzione madre a temperatura ambiente per un massimo di tre settimane. In un altro bicchiere, aggiungere un grammo di cloruro di sodio a 100 millilitri di acqua posta sopra una piastra di agitazione. Regolare il pH della soluzione salina utilizzando acido cloridrico a 12 molari fino a raggiungere un intervallo di pH compreso tra 0,5 e 1,0.

Quindi preparare una soluzione di lavoro blu di toina acidificata allo 0,25% combinando otto millilitri della soluzione madre di blu di Udine e 32 millilitri della soluzione acida di cloruro di sodio all'1%. Tubarlo su e giù per garantire l'incorporazione totale della soluzione madre di blu odine e mescolare Utilizzando un vortice, preparare la soluzione di lavoro fresca per ogni lotto di vetrini. Lavare le sezioni di tessuto immergendo singolarmente i vetrini per circa un secondo in una provetta conica da 50 millilitri contenente un volume sufficiente di PBS per immergere completamente il tessuto.

Lasciare asciugare i vetrini all'aria su un tovagliolo di carta. Successivamente, posizionare i vetrini in un barattolo di vetro contenente una quantità sufficiente di soluzione di lavoro blu di toluidina allo 0,25% per garantire che le sezioni di tessuto siano completamente sommerse. Incubare i vetrini per 10-15 minuti su una piattaforma a dondolo impostata a 15 giri/min.

Quindi immergere i vetrini nel PBS per circa un secondo per lavare via l'eccesso di blu e posizionare i vetrini in una scatola di vetrini in modo che i vetrini siano sui lati. Per consentire il drenaggio. Asciugare i vetrini in forno a 37 gradi Celsius per un minimo di due ore o durante la notte a temperatura ambiente.

Una volta asciutti, immergere i vetrini in etanolo al 95% per circa un secondo, quindi lasciare asciugare completamente la sezione. Ripeti questa procedura da una a 10 volte fino a quando il tessuto non si asciuga più blu che viola. Successivamente, immergere i vetrini in etanolo al 100% per circa un secondo e lasciare asciugare completamente la sezione.

Ripeti questa procedura da una a 10 volte fino a quando il tessuto non diventa blu scuro o medio ma non viola. Infine, fissare la macchia incubando i vetrini in xilene al 100% per tre minuti. Lasciarli asciugare e poi coprire, infilare i vetrini con glicerolo PPS o un mezzo di montaggio permanente a base di xilene.

Scolare il terreno in eccesso e conservare i vetrini completati a temperatura ambiente. Quando sono stati testati con una serie graduata di monofilamenti Von Frame, separazione materna neonatale di otto settimane, i topi hanno mostrato allodinia meccanica perigenitale rispetto alle controparti naïve. Ciò è evidenziato da una significativa riduzione della soglia di astinenza meccanica che ha suscitato una risposta comportamentale positiva.

Ulteriori prove di prostatite cronica sindrome del dolore pelvico cronico possono essere viste istologicamente mostrate qui sono sezioni criostatiche dei tessuti prostatici che sono state colorate con blu acidificato o toluidina per osservare i granuli di triptasi alloggiati all'interno dei mastociti. Una percentuale significativamente più alta di mastociti degranulati è stata osservata nelle sezioni della prostata di topi neonati separati . Rispetto ai topi ingenui Durante l'esecuzione della separazione materna neonatale, è importante ricordare di mantenere l'odore della gabbia domestica per evitare il rigetto dei cuccioli da parte della madre Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come i test in campo aperto o la preferenza per i liquidi a due scelte, possono essere utilizzati per valutare le prove comportamentali per i disturbi dell'umore in comorbilità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la sensibilità meccanica perigenitale e l'attivazione dei mastociti prostatici come prove comportamentali e istologiche di prostatite cronica e topi dopo la separazione materna neonatale.