Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

L'obiettivo generale dell'iniezione di vena cardinale comune di Evans Blue Dye e Fitzy Dextrin è osservare l'integrità della membrana muscolare scheletrica nel pesce zebra vivo per aiutare a caratterizzare i meccanismi che causano la malattia correlati a vari sottotipi di distrofia muscolare. L'iniezione di colorante blu di Evan può aiutare a scoprire i meccanismi biologici che contribuiscono alla patologia della malattia quando si caratterizzano i modelli animali sulla distrofia muscolare, può anche contribuire alla nostra comprensione dei potenziali meccanismi terapeutici per il trattamento della malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita e analizzata utilizzando pesce zebra vivo.

Inoltre, la coiniezione di Fitz Dextrin dimostra un controllo di qualità per un'iniezione di successo, che migliora il rigore e la quantificazione. Le implicazioni di questa tecnica riguardano l'utilità nella validazione di modelli di zebrafish di malattia muscolare. Migliorano anche la comprensione di come alcune mutazioni portano a fenotipi di malattie muscolari, come la distrofia muscolare, che è fondamentale per trovare trattamenti e cure.

Per preparare le piastre di iniezione di agar, far bollire da due a 3% di aros in E tre medium e lasciare raffreddare leggermente la soluzione sul banco. Versare circa 35 millilitri di agro raffreddati in ogni piatto da 100 millimetri. Quindi posizionare un'estremità di uno stampo a iniezione preferito nella soluzione prima di posare il resto dello stampo sulla soluzione agro.

Lasciare solidificare la soluzione agro a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius per circa 30 minuti. Quindi utilizzare una spatola per separare un'estremità dello stampo dagli agro solidi e rimuovere lentamente il resto dello stampo. Produci una scorta dell'1% di Evan's Blue Dye o EBD in una soluzione x ringer.

Quindi preparare una soluzione madre di Fitzy Dextrin in una soluzione x ringer e conservare a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Per fare una miscela per iniezione, diluire EBD allo 0,1% direttamente nella soluzione madre Fitz Dextrin agitare accuratamente la miscela per iniezione e tenerla al riparo dalla luce diretta utilizzando un foglio di alluminio per avvolgere il tubo prima dell'iniezione. Preriscaldare la piastra di iniezione a temperatura ambiente.

Disporre il micromanipolatore su una piastra metallica e posizionarsi accanto al microscopio per iniezioni. Accendere il controller di microiniezione pneumatica. Quindi, con circa due-quattro microlitri di miscela EBD, riempire nuovamente l'ago per iniezione.

Successivamente, calibrare il volume di iniezione con circa cinque nanolitri di miscela EBD. Quindi utilizzare una soluzione x ringer per bagnare la piastra di iniezione e rimuovere la soluzione in eccesso dai pozzetti, pretrattare le larve con trica allo 0,04% diluito in una soluzione x ringer per immobilizzare completamente le larve prima dell'iniezione con una pipetta di vetro. Posizionare le larve anestetizzate nei pozzetti delle piastre di iniezione della coclea, assicurandosi che le larve siano completamente nei pozzetti sdraiati su un lato.

Rimuovere la soluzione di trica in eccesso per ridurre al minimo il movimento delle larve all'interno del pozzo, ma lasciarne abbastanza per prevenire la disidratazione. Posizionare la piastra per l'iniezione delle larve su un cannocchiale da dissezione e posizionare l'ago per pipetta per iniezione contenente l'EBD. Mescolare sopra le larve di un pesce zebra vicino al cuore e a circa 45 gradi dall'asse anteriore posteriore.

Inserire l'ago per iniezione nella vena cardinale comune o CCV vicino alla porzione anteriore del tuorlo dove la vena gira inizialmente in direzione dorsale. Quindi, iniettare cinque nanolitri di miscela EBD e mantenere l'ago per iniezione in posizione per cinque-otto secondi. Per ridurre al minimo la perdita immediata della miscela EBD, una buona iniezione mostrerà colorante nelle camere cardiache e può essere ripetuta.

Se l'EB DMX non viene visto nel cuore immediatamente dopo un'iniezione riuscita, l'embrione accumulerà la destrina di Fitz nel sistema vascolare come mostrato qui. Dopo che il numero desiderato di larve è stato iniettato, riportare le larve in una soluzione x ringer senza trica in piastre da 100 millimetri per aumentare il tasso di sopravvivenza e mantenere la potenza del segnale. Conservare i piatti avvolti in un foglio di alluminio.

Incubare le larve a 28,5 gradi Celsius per quattro-sei ore per garantire un assorbimento efficiente dell'EBD. Per visualizzare l'EBD nel muscolo, utilizzare 0,04% trica per anestetizzare le larve prima di visualizzare le larve sotto fluorescenza rossa. L'EBD è stato iniettato nel CCV di mutanti omogenei Sapia e fratelli wild type con iniezioni di PF 3D che hanno riempito le camere cardiache come mostrato qui, sono stati quindi analizzati per il successo della perfusione del die visualizzando la destrina fitzy nel sistema vascolare sotto fluorescenza verde.

Dopo un periodo di incubazione di quattro ore, l'assorbimento di EBD è stato esaminato a livello di acaro, come mostrato in questa figura. I fratelli wild type non hanno mostrato fluorescenza EBD all'interno di alcuna fibra muscolare visibile, mentre i mutanti omozigoti sapia hanno mostrato una captazione di EBD che indica un danno alla membrana muscolare. Una volta che l'iniezione del colorante blu di Evans nella vena cardinale comune del pesce zebra, le larve possono essere completate entro 30-60 minuti a seconda del numero di larve iniettate.

Inoltre, i risultati sperimentali possono essere ottenuti in un solo giorno per garantire la competenza. È importante ricordare di mirare attentamente alla vena cardinale per produrre risultati coerenti e interpretabili. Questo può essere impegnativo e probabilmente richiederà pratica Seguendo questa procedura.

Altri metodi possono essere eseguiti come screening chimici e genetici al fine di determinare i meccanismi molecolari responsabili del danno di membrana associato alle distrofie muscolari. Questi esperimenti possono aiutare a stabilire nuove strategie terapeutiche per la malattia muscolare dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sulle malattie muscolari per esplorare l'integrità della membrana nei modelli di distrofia muscolare di zebrafish.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una conoscenza approfondita di come iniettare il colorante blu di Evan nella vena cardinale comune delle larve di pesce zebra. Dovresti anche capire come identificare le fibre muscolari con danni alla membrana dovuti alla presenza del colorante blu di Evan all'interno delle fibre.