Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

L'obiettivo generale dell'iniezione della vena cardiaca comune con il colorante blu di Evans e la destrina Fitzy è osservare l'integrità della membrana del muscolo scheletrico in zebrafish vivi, al fine di contribuire alla caratterizzazione dei meccanismi patogenetici associati a diverse sottotipi di distrofia muscolare. L'iniezione del colorante blu di Evans può aiutare a svelare i meccanismi biologici che contribuiscono alla patologia della malattia durante la caratterizzazione di modelli animali di distrofia muscolare; inoltre, può contribuire alla comprensione dei potenziali meccanismi terapeutici per il trattamento della malattia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere eseguita e analizzata utilizzando zebrafish vivi.

Inoltre, l'iniezione concomitante di Fitz Dextrin rappresenta un controllo di qualità per un'iniezione eseguita con successo, migliorando rigore e quantificazione. Le implicazioni di questa tecnica riguardano l'utilità nella validazione di modelli di zebrafish per le malattie muscolari. Contribuiscono inoltre a chiarire come determinate mutazioni portino a fenotipi di malattie muscolari, come la distrofia muscolare, aspetto fondamentale per individuare trattamenti e cure.

Per preparare le piastre per iniezione con agar, far bollire dal 2 al 3% di aros nel mezzo E tre e lasciare raffreddare leggermente la soluzione sul banco. Versare circa 35 millilitri di agar raffreddato in ogni piastra da 100 millimetri. Successivamente, inserire un'estremità del modello di iniezione prescelto nella soluzione prima di appoggiare il resto del modello sulla soluzione di agar.

Lasciare solidificare la soluzione di agar a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius per circa 30 minuti. Quindi utilizzare una spatola per staccare un'estremità dello stampo dall'agar solido ed estrarre lentamente il resto dello stampo. Preparare una soluzione madre al 1% di colorante Evans Blue (EBD) in soluzione di Ringer 1x.

Quindi preparare una soluzione madre di Fitzy Dextrin in soluzione fisiologica 1x e conservarla a meno 20 gradi Celsius. Per preparare la miscela per iniezione, diluire l'EBD allo 0,1% direttamente nella soluzione madre di Fitz Dextrin, vortexare accuratamente la miscela per iniezione e proteggerla dalla luce diretta avvolgendo il tubo con carta d'alluminio prima dell'iniezione. Predisporre la piastra per iniezione preriscaldandola a temperatura ambiente.

Posizionare il micromanipolatore su una piastra di metallo e accanto al microscopio per iniezioni. Accendere il controllore per microiniezioni a pressione d'aria. Quindi, con circa due-quattro microlitri della miscela di EBD, riempire posteriormente l'ago di iniezione.

Successivamente, calibrare il volume di iniezione con circa cinque nanolitri di miscela EBD. Quindi utilizzare una soluzione ringer 1x per bagnare la piastra di iniezione ed eliminare l'eccesso di soluzione dai pozzetti. Pretreatare le larve con trica 0,04% diluita in soluzione ringer 1x per immobilizzare completamente le larve prima dell'iniezione con una pipetta di vetro. Posizionare le larve anestetizzate nei pozzetti delle piastre di iniezione ad auger, assicurandosi che le larve siano completamente all'interno dei pozzetti e distese su un fianco.

Rimuovere la soluzione trica in eccesso per ridurre al minimo il movimento delle larve all'interno della pozzetta, ma lasciarne una quantità sufficiente a prevenire la disidratazione. Posizionare la piastra di iniezione contenente le larve su un microscopio stereoscopico e sistemare l'ago della pipetta di iniezione contenente l'EBD. Mescolare sopra una larva di zebrafish vicino al cuore e a circa 45 gradi rispetto all'asse antero-posteriore.

Inserire l'ago di iniezione nella vena cardinale comune o CCV nella porzione anteriore del tuorlo, dove la vena inizia a piegare in direzione dorsale. Successivamente, iniettare cinque nanolitri della miscela EBD e mantenere l'ago di iniezione in posizione per cinque-otto secondi. Per ridurre al minimo la fuoriuscita immediata della miscela EBD, una buona iniezione mostrerà il colorante nelle camere cardiache ed eventualmente potrà essere ripetuta.

Se EB DMX non è visibile nel cuore immediatamente dopo un'iniezione riuscita, l'embrione accumulerà Fitz Dextrin nel sistema vascolare come mostrato qui. Dopo aver effettuato le iniezioni nel numero desiderato di larve, riposizionare le larve in soluzione di ringer 1x senza trica in piatti da 100 millimetri per aumentare la percentuale di sopravvivenza e mantenere l'intensità del segnale. Mantenere i piatti avvolti in foglio di alluminio.

Incubare le larve a 28,5 gradi Celsius per quattro-sei ore per garantire un efficiente assorbimento dell'EBD. Per visualizzare l'EBD nel muscolo, utilizzare trica allo 0,04% per anestetizzare le larve prima di osservarle in fluorescenza rossa. L'EBD è stato iniettato nella CCV di mutanti Sapia homogeneous e nei relativi fratelli di tipo selvatico a 3 DPF; iniezioni che hanno riempito le camere cardiache come mostrato qui, sono state successivamente analizzate per verificare un'efficace perfusione del colorante, visualizzando il dextrano fitzio nella vascolarizzazione in fluorescenza verde.

Dopo un periodo di incubazione di quattro ore, l'assorbimento di EBD è stato esaminato a livello del somite, come mostrato in questa figura. I soggetti di tipo selvatico hanno mostrato assenza di fluorescenza da EBD all'interno di qualsiasi fibra muscolare visibile, mentre i mutanti omozigoti sapia hanno mostrato assorbimento di EBD, indicativo di un danno alla membrana muscolare. Una volta acquisita padronanza nell'iniezione del colorante Evans blu nella vena cardiaca comune del pesce zebra, la procedura sui larve può essere completata in 30-60 minuti, a seconda del numero di larve da iniettare.

Inoltre, i risultati sperimentali possono essere ottenuti in un singolo giorno per garantire competenza. È importante ricordare di mirare con attenzione alla vena cardiaca al fine di produrre risultati costanti e interpretabili. Questa operazione può risultare difficile e richiederà probabilmente pratica seguendo questa procedura.

Possono essere eseguiti altri metodi, come schermate chimiche e genetiche, al fine di determinare i meccanismi molecolari responsabili del danno alla membrana associato alle distrofie muscolari. Questi esperimenti possono contribuire a stabilire nuove strategie terapeutiche per le malattie muscolari dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio delle malattie muscolari per esplorare l'integrità della membrana in modelli di zebrafish della distrofia muscolare.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una comprensione approfondita del metodo per iniettare il colorante blu di Evans nella vena cardiaca comune delle larve di pesce zebra. Si dovrebbe inoltre comprendere come identificare le fibre muscolari con danni alla membrana in seguito alla presenza del colorante blu di Evans all'interno delle fibre.