Name: Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer de Evans Blue Dye-injectiemethode voor het analyseren van skeletspierintegriteit bij zebravislarven. Deze techniek helpt onderzoekers musculaire dystrofiemechanismen te bestuderen en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Trent Waugh bedanken voor zijn technische bijstand. We hebben ook erkennen de afdeling Kindergeneeskunde van het Hospital for Sick Children en Cure aangeboren Spierdystrofie (CMD) voor hun genereuze financiering voor dit project.

1. Bereiding van injectie Agar platen (Tijd: 45 min) <ol><li> Kook 2% tot 3% agarose in E3 media en laat de oplossing enigszins afkoelen op de bank. Opmerking: Het aantal injectie platen voorbereid bepaalt het aantal agarose vereist. Elke injectie plaat moet ongeveer 35 ml van de agar-oplossing. </li><li> Na het koken kan de agarose afkoelen tot de gewenste temperatuur bereikt (bv., 45 ° C) volgens de instructies van de fabrikant spuitgietmatrijs. </li><li> Giet ongeveer 35 ml van de agarose afgekoeld in een 100 mm schaal. </li><li> Plaats het ene uiteinde van de voorkeur injectie schimmel in de oplossing, dan leg rest van schimmel op agarose oplossing (dit zal bijdragen tot het verminderen van het optreden van luchtbellen). </li><li> Laat de agarose oplossing stollen, hetzij bij kamertemperatuur of 4 ° C gedurende ongeveer 30 min. </li><li> Gebruik een spatel om een ​​uiteinde van de mal te scheiden van de vaste agarose. Verwijder langzaam de rest van de m<html> oud. </li></ol> 2. Voorbereiding van Evans Blue Dye (EBD) Injection Mix (Tijd: 30 min) <ol><li> Maak een 1% voorraad EBD in 1X Ringer&#39;s oplossing (155 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2 mM Na 2 HPO 4, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, pH 7,2), die kan worden bewaard bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg een voorraadoplossing van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) -dextran MW 10.000 kDa bij 25 mg / ml in 1X Ringer&#39;s oplossing en bewaar bij -20 ° C </li><li> Bereid injectie mix door verdunning EBD tot 0,1% direct op voorraad oplossing van FITC-dextran voorraad (dat wil zeggen, voor een laatste werkvolume van 100 pl. Meng 10 ul van 1% EBD in 90 ul van FITC dextran voorraad). </li><li> Grondig vortex injectie mix (het moet groen worden) en uit direct licht te houden door wikkelen injectie mix buis in aluminiumfolie. </li></ol> 3. EBD Injectie Voorbereiding (Tijd: Ongeveer 30 min) ent &quot;&gt; Opmerking: protocol werkt het beste met de larven 3-7 dagen na de bevruchting (DPF). <ol><li> Pre-warm injectie plaat RT. </li><li> Opgericht injectie apparaat door het organiseren van micromanipulator op metalen plaat en staan ​​naast de microscoop wordt gebruikt voor injectie. Zet lucht gedreven micro-injectie controller. Opmerking: De geprefereerde injectiesysteem is afhankelijk van lab en niet resultaat van de analyse wijzigen. </li><li> Terug vullen injectienaald met ongeveer 2-4 pi EBD mix. </li><li> Kalibreren injectie volume tot ongeveer 5 nl van EBD mix. Opmerking: Injectievolume kalibratie zal afhangen van de kalibratie methode. Een zuiger aangedreven injectie kan direct worden ingesteld op een bepaald injectievolume dat gasdruk injectors het injectievolume gekalibreerde via volume bolus met behulp van een micrometer nodig. </li><li> Natte injectie plaat met 1X Ringer&#39;s oplossing en verwijder overtollige uit putten. </li><li> Pre-treat larven met 0,04% ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat salt (tricaïne) verdund in 1X Ringer&#39;s oplossing larven vóór aanvang van de injectie immobiliseren. Opmerking: Zorgen larven zijn volledig immotile is belangrijk als een goede injectie is moeilijk met enige resterende beweging. </li><li> Plaats verdoofde larven in putjes van de injectie agar platen met een glazen pipet. Zorg ervoor dat de larven zijn volledig binnen de put en liggen op hun kant. Opmerking: Het aantal larven per goed is aan de experimentator. </li><li> Na larven worden in de putten, verwijderen overtollige Ringer-oplossing voor larven verkeer binnen de put te minimaliseren. Verlaat een resterende hoeveelheid oplossing, zodat de larven niet uitdrogen. </li></ol> 4. Pericardvocht Injectie van zebravis Larven met EBD (Tijd: Afhankelijk van het aantal larven injecteren, naar schatting 1-3 uur) <ol><li> Plaats de injectieplaat met de larven op een dissectie bereik waar de injectie zal worden uitgevoerd. </li><li> Plaats de injectie pipet met naaldhet EBD mix over een zebravis larven. </li><li> Re-positie van de injectie plaat door te draaien, zodat de injectienaald ligt in de buurt van het hart van de larven en ongeveer 45 ° ventraal van de anterior-posterior as. </li><li> Steek de injectienaald in het gemeenschappelijk hoofdader (CCV) in het gebied van de ader in het voorste deel van de dooier, waar de ader aanvankelijk draaien in de dorsaal (figuur 1). Opmerking: Een vergroting tot 40x kan nuttig zijn om duidelijk de CCV zijn. </li><li> Injecteren 5 nl van EBD mix en houden injectienaald in positie voor 5-8 sec onmiddellijk lekkage van EBD mix te minimaliseren. Opmerking: Een goede injectie zal kleurstof kleuring gezien in de hartkamers (Figuur 1) hebben. Als EBD mix niet wordt waargenomen in het hart, dan is het injecteren van een extra 5 nl van EBD mix kan voldoende zijn om kleurstofopname induceren. Alternatief kan het embryo worden weggegooid. Opmerking: In sommige situaties kan de hartslag stoppen. Indien dit occurs, blijven toezien op de larven van 20-40 sec. Kenmerkend het hart hervat kloppen de kleurstof door het vaatstelsel beweegt. </li><li> Gaan naar de volgende larven en herhaal. </li><li> Identificeer succes geïnjecteerde embryo&#39;s door het observeren van de aanwezigheid van FITC-dextran in het vaatstelsel onmiddellijk na injectie (Figuur 2). </li></ol> 5. Incubation en EBD Opname (Time: 4-6 uur) <ol><li> Nadat het gewenste aantal larven geïnjecteerd, terug geïnjecteerd larven 1X Ringer&#39;s oplossing zonder tricaïne in 100 mm schalen. </li><li> Houd gerechten gewikkeld in aluminiumfolie. Opmerking: Het houden geïnjecteerd larven in het donker verhoogt overlevingskansen en zorgt voor de grootste consistentie in de signaalsterkte. Wrapping in aluminiumfolie is vooral belangrijk voor de tijdsperiode dat de larven zich buiten de incubator. </li><li> Sta larven te incuberen bij 28,5 ° C gedurende 4-6 uur voldoende EBD opname te garanderen. </li></ol&gt; 6. Visualisatie van EBD in de spier (Tijd: Afhankelijk van het aantal larven injecteren en het type van microscopie, geschatte 0,5-3 uur) <ol><li> Voorafgaand aan beeldvorming verdoven de larven 0,04% tricaïne om verplaatsing te voorkomen. </li><li> Bekijk larven onder rode fluorescentie te bepalen of EBD opname plaatsvindt in de skeletspier (figuur 3). </li></ol>

<ol><li>Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Duchenne+muscular+dystrophy+%28DMD%29+for+the+pediatricians+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pediatr+%28Phila%22%5BJournal%5D)">Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community.</a> Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).</li>
<li>Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+into+prominence%3A+the+zebrafish+as+a+valuable+tool+for+studying+human+myopathies+and+muscular+dystrophies%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies).</a> FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).</li>
<li>Lancet, , 381-845 (2013).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Campbell, K. P., Kahl, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+dystrophin+and+an+integral+membrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein.</a> Nature. 338, 259-262 (1989).</li>
<li>Cohn, R. D., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of muscular dystrophies.</a> Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).</li>
<li>Yoshida, M., Ozawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+complex+anchoring+dystrophin+to+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma.</a> J Biochem. 108, 748-752 (1990).</li>
<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).</li>
<li>Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dystrophic+muscle+fibers+in+mdx+mouse+by+vital+staining+with+Evans+blue%3A+evidence+of+apoptosis+in+dystrophin-deficient+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle.</a> J Biochem. 118, 959-964 (1995).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+muscle+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Modeling human muscle disease in zebrafish.</a> Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).</li>
<li>Cavanna, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+mapping+of+the+mouse+mdx+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus.</a> Genomics. 3, 337-341 (1988).</li>
<li>Bassett, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Horstick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stac3+is+a+component+of+the+excitation-contraction+coupling+machinery+and+mutated+in+Native+American+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy.</a> Nat Commun. 4, (1952).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Whitfield, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral.</a> , 123-241 (1996).</li>
<li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, (2013).</li>
<li>Waugh, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+prevents+dystrophic+changes+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.</li>
<li>Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryonic+and+larval+zebrafish+skeletal+myofibers+from+dissociated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations.</a> J Vis Exp. 50259, (2013).</li>
<li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. 50925, (2013).</li>
<li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo.+marker+of+myofibre+damage%3A+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+and+characterization+of+a+splicing+mutant+of+zebrafish+dystrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin.</a> Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Majczenko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Mutation+of+CCDC78+in+a+Unique+Congenital+Myopathy+with+Prominent+Internal+Nuclei+and+Atypical+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum%22%5BJournal%5D)">Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores.</a> Am J Hum. , (2012).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Evans+blue+dye+to+compare+limb+muscles+in+exercised+young+and+old+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice.</a> Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Zebravis zijn in opkomst als een krachtig instrument voor de studie van neuromusculaire ziekten 2,29. Tot op heden heeft de zebravis systeem is gebruikt om nieuwe spier ziekte veroorzaken mutaties 16,17,30 valideren, verhelderen roman pathomechanismen 18, en identificeren van potentiële nieuwe therapeutische medicijnen 12,24. Deze gezamenlijke inspanningen hebben het nut van de zebravis te modelleren menselijk neuromusculaire ziekten vastgesteld. Ondanks de vorderingen bij zebravissen en zoogdieren modellen zijn er beperkte behandelingsmogelijkheden voor patiënten binnen het brede spectrum van neuromusculaire aandoeningen. Daarom bestaat er een grote vraag naar de ontwikkeling van therapie voor deze groep verwoestende ziekten. Parallel deze vraag naar therapeutica is de overeenkomstige behoefte aan voortdurende experimentele innovatie en nauwkeurige analyse van nieuwe diermodellen en vermeende therapeutische strategieën te verifiëren. EBD analyse wordt vaak gebruikt in muismodellenstudie weefsel en cellulaire schade in de hersenen, het hart en de skeletspieren 27,31. Met name wordt EBD uitgebreid gebruikt in muismodellen van spierdystrofie verschillende subtypes van de ernst van spiermembraan instabiliteit tonen beschadigen 8. Het gebruik van EBD spier membraanschade onthullen een ondersteunend parameter vaststelling gelijkenissen van het diermodel voor menselijke ziektetoestand 9. De kracht van EBD in muizen heeft geleid verschillende laboratoria, inclusief onze eigen, te ontwikkelen en toe te passen EBD op zebravis modellen van neuromusculaire ziekten. Door de toepassing van EBD analyse wordt deze techniek actief uitgevoerd om zebravismodellen bevestigen aan de menselijke ziektetoestand 11,15,22,24,32. Larven met beschadigde spier membranen zal EBD opname en dus rode fluorescentie binnen spiervezels hebben. Fluorescentie waargenomen in de ruimte tussen de vezels, maar niet binnen de individuele spiervezels ook informatieve vezels loskomen van de basaalmembraan in t te bedragenhij afwezigheid van membraan schade, het verstrekken van nuttige diagnostische detail. EBD analyse heeft mogelijke toepassing buiten diermodel validatie. Inspanningen van ons lab hebben onlangs aangetoond dat EBD analyse is gunstig in het valideren van potentieel nieuwe therapeutische geneesmiddelen 24. Bepalen of potentiële therapeutische behandelingen te verminderen of af te schaffen EBD opname in neuromusculaire ziekten modellen kunnen relevante therapeutische werking 8 betekenen. Dit type analyse kan helpen bij het vaststellen van de mechanisme (n) van therapeutica en breidt de toepassing van EBD analyse. Zoals met vele technieken, heeft EBD analyse hebben een aantal kanttekeningen bij experimenteel ontwerp en de praktijk worden nageleefd. Zo kan het een uitdaging om de CCV identificeren vanwege de verdikking van het weefsel met de leeftijd. Bovendien is het gemakkelijk om larven in voorbereiding schade voor en tijdens de pericardiale injectie verminderen experimentele telt en het verhogen van de noodzaak om grote aantallen larven prep.Bovendien kan de fysieke schade aan de larven tijdens de behandeling en de injectie resulteren in valse positieven als beschadigde spieren kunnen opnemen EBD. Om sommige van deze obstakels te overwinnen, hebben we een co-injectie strategie beschreven in deze video artikel dat gemakkelijke en betrouwbare identificatie van larven succesvolle kleurstof infusie direct na injectie en voorafgaande aan verdere analyse. De FITC-dextran co-injectie controles voor een succesvolle injectie mogelijk bevestigd EBD in het vaatstelsel vóór de opname door de spiervezels. Dit kan vooral handig zijn als EBD fluorescentie wordt zeer diffuus in larven na enkele uren, zo niet verzameld in de spiervezels; als zodanig kan het moeilijk te detecteren. Bovendien ontbreekt het CCV en het injecteren EBD in het eigeel of lichaamsholte kan, na incubatie, leiden tot diffuse rode fluorescentie Soortgelijke embryo bedienen, doch met verminderde waarschijnlijkheid van opname door beschadigde spiervezels. Gezamenlijk zijn deze grotats suggereren EBD injectie vergt geduld en oefening om consistente en betrouwbare resultaten te bereiken. In al beschrijven we een praktische en eenvoudige methode om EBD analyses uitvoeren op zebravis larven. Tot op heden het gebruik van zebravis als modelsysteem, vooral als mens ziektemodel, is snel groeiende. Deze uitbreiding is deels te wijten aan de verdere ontwikkeling en aanpassing van de experimentele technieken die verbetering op de huidige voordelen van de zebravis systeem. De EBD injectietechniek geeft een extra en krachtige tool om het arsenaal van een onderzoeker voor de validatie en de studie van zebravis spierziekte modellen. De lopende uitvoering en aanpassing van deze techniek heeft de potentie om te ontdekken van nieuwe therapeutische strategieën en ziekteverwekkende mechanismen.

Spierontwikkelingsstoornissen vormen een groep van veelvoorkomende en heterogene menselijke spierziekten met specifieke histopathologische kenmerken1,2. Symptomen die typisch geassocieerd worden met deze verwoestende groep ziekten omvatten spierzwakte, spierdegeneratie, verlies van mobiliteit en vroegtijdige sterfte1,3. De primaire pathomechanismen van spierdystrofieën zijn het verlies van eiwitten die het sarcolemma stabiliseren, transmembraancomplexen verankeren en celsignalering over de membraan bemiddelen4-6. Bijvoorbeeld, volledig verlies van het eiwit dystrofine, een primair skelet-eiwit van het dystrofine-glycoproteïne complex, resulteert in destabilisatie van het spiermembraan bij Duchenne spierdystrofie7. Omdat de meeste spierdystrofieën het resultaat zijn van mutaties in eiwitten die deelnemen aan de verbinding tussen de extracellulaire matrix en het sarcolemmale cytoskelet, is een gemeenschappelijke waarneming op cellulair niveau het verlies van sarcolemmale integriteit8,9. Dit begrip van de primaire pathomechanismen geassocieerd met spierdystrofieën is het resultaat van talloze jaren van onderzoek met behulp van diermodellen2,10-15. Ondanks de vooruitgang op het gebied, zijn er nog steeds beperkte therapeutische opties voor de behandeling of het beheer van de verschillende subtypen van dystrofie. Deze beperking van levensvatbare therapieën is te wijten aan verschillende belangrijke factoren: 1) de moeilijkheid van gentherapiestrategieën, 2) een hoge frequentie van de-novo gevallen van de ziekte en het bijbehorende gebrek aan vertaalbare diermodellen, en 3) het ontbreken van rigoureuze strategieën om de fysiologische gevolgen van vermeende therapeutische middelen te testen met duidelijke en reproduceerbare uitkomstmaten.
Om enkele van deze beperkingen te overwinnen, maken talrijke laboratoria, waaronder de onze, gebruik van zebravissen als een systeem om humane neuromusculaire ziekten te modelleren en te bestuderen2. Tot op heden zijn zebravissen een waardevol hulpmiddel gebleken in ziekteonderzoek. Het zebravismodel is gebruikt om nieuwe, menselijke ziekteveroorzakende mutaties te identificeren en te valideren16,17, niet-gekarakteriseerde ziekteveroorzakende mechanismen te verduidelijken17,18, en nieuwe therapeutische strategieën te identificeren12,19. Deze vooruitgang is gedeeltelijk gemaakt door de canonieke sterke punten van het zebravissysteem, zoals hun optische helderheid, gemak van genetische manipulatie en het vermogen om in grote aantallen te kweken20. Zebravissen zijn bovendien geschikt gebleken voor grootschalige geneesmiddelscreens21, een waardevolle methode voor de identificatie van nieuwe therapeutischa22-24. Wat betreft spierziekteonderzoek, worden deze sterke punten aangevuld door het vermogen om enkele zebravisskeletspiervezels via dissociatie te isoleren25 en door het vermogen om myofiber organisatie in vivo te onderzoeken met behulp van het optische fenomeen genaamd birefferentie26, die gezamenlijk snelle bepaling van macroscopische spierintegriteit mogelijk maken. Ongeacht deze beschikbare nuttigheden, is er voortdurende ontwikkeling van tools vereist om het onderzoek te bevorderen.
Wij, en anderen, hebben een protocol voor EBD-injectie en analyse in het zebravismodel aangepast. EBD is een vitaal, celpermeatief kleurmiddel dat wordt opgenomen door beschadigde, degenererende of apoptotische cellen en vervolgens onder fluorescentie wordt gevisualiseerd27. Tot nu toe is EBD-analyse uitgebreid gebruikt om spiermembraanintegriteit te analyseren in muismodellen van skeletspier- en hartziekten8,9,27. Echter, in zoogdierpreparaten vereist verzameld spierweefsel typisch arbeidsintensieve sectie of dissectie voorafgaand aan analyse. In zebravissen is directe analyse mogelijk in hoge aantallen met behulp van levende en intacte dieren. In dit videoartikel zullen we de methodologie demonstreren om EBD-injectie en analyse uit te voeren in levende zebravislarven, met representatieve beelden van EBD-opname in de zebravis dystrofie-mutante lijn sapje15,28. Verder presenteren we een co-injectiestrategie die een verhoogde kwantificering van EBD-preparaten mogelijk maakt.

<table><tbody><tr><td>Fluoresceïne isothiocyanate-dextran MW 10.000</td><td>Sigma</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Evan's Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri-schaal</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875712</td><td>Injectievormbasis</td></tr><tr><td>Dunwandige glazen capillaire buisjes</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Voor injectienaald</td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Injectievorm</td></tr><tr><td>Micro-injectievorm</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>Injectievorm</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>Ringer's oplossing</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td>Ringer's oplossing</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Ringer's oplossing</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monohydraat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Ringer's oplossing</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Ringer's oplossing</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Ringer's oplossing</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>C1061</td><td>Ringer's oplossing</td></tr></tbody></table>

analyse van de zebravis larven skeletspieren integriteit met evans blue dye

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Het zebravismodel is een opkomend systeem voor de studie van neuromusculaire aandoeningen. Bij de studie van neuromusculaire ziekten is de integriteit van het spiermembraan een kritische ziektebepalende factor. Tot op heden vertonen talrijke neuromusculaire aandoeningen degenererende spiervezels met abnormale membraanintegriteit; dit wordt het meest vaak waargenomen bij spierdystrofieën. Evans Blue Dye (EBD) is een vitaal, celpermeabel kleurmiddel dat snel wordt opgenomen in degenererende, beschadigde of apoptotische cellen; in tegenstelling hiermee wordt het niet opgenomen door cellen met een intact membraan. EBD-injectie wordt vaak gebruikt om de spierintegriteit te bepalen in muizenmodellen van neuromusculaire ziekten. Echter, dergelijke EBD-experimenten vereisen spierdissectie en/of -sectieerwerk vóór analyse. In tegenstelling hiermee wordt EBD-opname in zebravissen gevisualiseerd in levende, intacte preparaten. Hier demonstreren we een eenvoudige en duidelijke methodologie voor het uitvoeren van EBD-injecties en -analyse in levende zebravissen. Bovendien demonstreren we een co-injectiestrategie om de efficiëntie van EBD-analyse te verhogen. Over het algemeen biedt dit videoartikel een overzicht om EBD-injectie en -karakterisering uit te voeren in zebravismodellen van neuromusculaire ziekten.

De EBD injectie mengsel werd geïnjecteerd in het CCV van Sapje ​​homozygote mutanten en wild-type broers en zussen op 3 dpf. Injecties de hartkamers (Figuur 1B) gevuld werden vervolgens geanalyseerd op een succesvolle injectie visualiseren FITC-dextran in het vaatstelsel onder groene fluorescentie (figuur 2). Na een 4 uur incubatietijd werd EBD opname onderzocht op het somiet niveau met behulp van fluorescentie microscopie. Wild-type broers vertoonden geen EBD fluorescentie binnen zichtbare spiervezels (figuur 3A), terwijl de Sapje ​​homozygote mutanten vertoonden EBD opname, aangeeft schade aan de spier membraan 15 (figuur 3B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> Figuur 1. Injecteren EBD injectie mix in de gemeenschappelijke kardinaal ader (CCV) van een zebravis embryo. (A) geïnjecteerde embryo. Pijl geeft ideale locatie voor CCV injectie. (B) De succesvolle injectie in de CCV. De kleurstof gaat de hartkamers (pijl) en begint door het vaatstelsel te verpompen. (C) Een mislukte CCV injectie zal resulteren in sommige of alle van de kleurstof het invoeren van de dooierzak van het embryo (pijl). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> Figuur 2. Embryo&#39;s kunnen worden gesorteerd voor een succesvolle injectie observeren FITC-dextran distributie onder groene fluorescentie gehele vaatstelsel direct na injectie en voorafgaande aan EBD opname.Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> Figuur 3: EBD zal worden genomen door vezels met beschadigde membranen (A) Wildtype broers toont geen EBD fluorescentie in spiervezels.. (B) Sapje ​​homozygote mutant met EBD fluorescentie binnen meerdere spiervezels (pijlen). Alle larven werden geïnjecteerd met EBD injectie mix en na 4 uur incubatie periode bij 3 dpf geanalyseerd. Broers en zussen en mutanten zijn gesorteerd op spiervezels detachement voorafgaand aan CCV injectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

In deze studie beschrijven we een eenvoudige methode om Evans Blue Dye (EBD) analyse uit te voeren op zebravislarven. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van de integriteit van skeletspieren en de afbakening van zebravismodellen van spierdystrofie, en is een waardevolle methode voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische behandelingen.

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Het algemene doel van de injectie van Evans Blue-kleurstof en Fitzy-dextrine in de gemeenschappelijke cardinale ader is het observeren van de integriteit van het skeletspiercelmembraan in levende zebravis om te helpen bij het karakteriseren van ziekteveroorzakende mechanismen die gerelateerd zijn aan verschillende subtypes van spierdystrofie. De injectie van Evans Blue-kleurstof kan helpen bij het blootleggen van biologische mechanismen die bijdragen aan de pathologie van de ziekte bij het karakteriseren van diermodellen voor spierdystrofie; het kan daarnaast bijdragen aan ons begrip van potentiële therapeutische mechanismen voor de behandeling van de ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden uitgevoerd en geanalyseerd met behulp van levende zebravis.Daarnaast dient de co-injectie van Fitz Dextrin als kwaliteitscontrole voor een succesvolle injectie, wat de striktheid en kwantificering verbetert. De implicaties van deze techniek hebben betrekking op het nut bij de validatie van zebravismodellen voor spierziekten. Ze dragen ook bij aan het begrip van hoe bepaalde mutaties leiden tot fenotypen van spierziekten, zoals musculaire dystrofie, wat cruciaal is voor het vinden van behandelingen en genezingen.Om agar-injectieplaten te bereiden, kookt u 2 tot 3% agar in E3-medium en laat u de oplossing op de werkbank licht afkoelen. Giet ongeveer 35 milliliter van de afgekoelde agar in elke schaal van 100 millimeter. Plaats vervolgens één uiteinde van een gewenste injectiemal in de oplossing voordat u de rest van de mal op de agar-oplossing legt.Laat de agrose-oplossing ongeveer 30 minuten stollen, bij kamertemperatuur of bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een spatel om één uiteinde van de mal van de gestolde agrose te scheiden en verwijder langzaam de rest van de mal. Maak een 1% voorraadoplossing van Evan's Blue Dye of EBD in een 1x Ringer-oplossing.Bereid vervolgens een voorraadoplossing van Fitzy Dextrin in een 1x Ringer-oplossing en bewaar deze bij -20 °C. Om het injectiemengsel te maken, wordt EBD verdund tot 0,1% direct in de Fitz Dextrin-voorraadoplossing; vortex het injectiemengsel grondig en houd het uit direct licht door de buis met aluminiumfolie te omwikkelen vóór het injecteren. Voorwarm de injectieplaat tot kamertemperatuur.Plaats de micromanipulator op een metalen plaat en zet deze naast de injectiemicroscoop. Zet de luchtgestuurde micro-injectiecontroller aan. Vul vervolgens de injectienaald via de achterzijde met ongeveer 2 tot 4 µL EBD-mix.Kalibreer vervolgens het injectievolume met ongeveer vijf nanoliter EBD-mix. Gebruik daarna een 1x ringer-oplossing om de injectieplaat te bevochtigen en verwijder overtollige vloeistof uit de putjes. Behandel de larven voor met 0,04% trica, gedilueerd in een 1x ringer-oplossing, om de larven volledig te immobiliseren voordat ze met een glazen pipet worden geïnjecteerd. Plaats de geanestheseerde larven in de putjes van de auger-injectieplaten, waarbij u erop let dat de larven volledig in de putjes liggen op hun zij.Verwijder het overtollige trica-oplossing om de beweging van de larven in het putje te minimaliseren, maar laat voldoende over om uitdroging te voorkomen. Plaats de injectieplaat met larven onder een dissectiemicroscoop en positioneer de injectiepipet naald die de EBD bevat. Meng over een zebravislarve nabij het hart en ongeveer 45 graden ten opzichte van de anterieur-posterieure as.Steek de injectienaald in de vena cardinalis communis of CCV nabij het anterieure deel van de dooier, waar de ader aanvankelijk in dorsale richting buigt. Injecteer vervolgens vijf nanoliters EBD-mengsel en houd de injectienaald vijf tot acht seconden op positie. Om onmiddellijke lekkage van het EBD-mengsel te minimaliseren, moet bij een goede injectie kleurstof in de hartkamers zichtbaar zijn; indien dit niet het geval is, kan de procedure worden herhaald.Als EB DMX onmiddellijk na een succesvolle injectie niet in het hart wordt waargenomen, zal het embryo Fitz Dextrin in de vaten ophopen, zoals hier wordt getoond. Nadat het gewenste aantal larven is geïnjecteerd, worden de larven teruggebracht naar een 1x ringer-oplossing zonder trica in 100 millimeter petrischalen om de overlevingskans te verhogen en de signaalsterkte te behouden. Houd de schalen in aluminiumfolie gewikkeld.Incubeer de larven bij 28,5 °C gedurende vier tot zes uur om een efficiënte EBD-opname te waarborgen. Om EBD in de spieren te visualiseren, gebruik 0,04% trica om de larven te anesthetiseren alvorens de larven onder rode fluorescentie te bekijken. EBD werd geïnjecteerd in de CCV van Sapia-homogene mutanten en wild-type broeders/zussen bij 3D PF; injecties die de hartkamers vulden zoals hier getoond, werden vervolgens geanalyseerd op een succesvolle kleurperfusie door fitzy-dextrine in de vaten onder groene fluorescentie te visualiseren.Na een incubatieperiode van vier uur werd de EBD-opname op somietniveau onderzocht, zoals getoond in deze figuur. Siblings van het wilde type vertoonden geen EBD-fluorescentie binnen enige zichtbare spiervezels, terwijl de sapia-homozygote mutanten EBD-opname vertoonden, wat wees op schade aan het spiercelmembraan. Zodra men bekwaam is in het injecteren van Evans blue-kleurstof in de vena cardinalis communis van zebravislarven, kan dit proces binnen 30 tot 60 minuten worden voltooid, afhankelijk van het aantal larven dat wordt geïnjecteerd.Bovendien kunnen experimentele resultaten in één dag worden behaald om de bekwaamheid te waarborgen. Het is belangrijk om eraan te denken nauwkeurig op de vena cardinalis te mikken om consistente en interpreteerbare resultaten te verkrijgen. Dit kan uitdagend zijn en zal waarschijnlijk oefening vereisen bij het volgen van deze procedure.Andere methoden kunnen worden uitgevoerd, zoals chemische en genetische screens, om de moleculaire mechanismen te bepalen die verantwoordelijk zijn voor de membraanschade geassocieerd met spierdystrofieën. Deze experimenten kunnen helpen bij het vaststellen van nieuwe therapeutische strategieën voor spierziekten na de ontwikkeling ervan. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in het veld van spierziektenonderzoek om de membraanintegriteit te onderzoeken in zebravismodellen van spierdystrofie.Na het bekijken van deze video zou u een grondige kennis moeten hebben van het injecteren van Evans-blauwkleurstof in de gemeenschappelijke cardinale ader van zebravislarven. U zou ook moeten begrijpen hoe u spiervezels met membraanschade kunt identificeren aan de aanwezigheid van Evans-blauwkleurstof binnen de vezels.

analysis-zebrafish-larvae-skeletal-muscle-integrity-with-evans-blue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

Krachtmetingen kunnen worden om veranderingen in spierfunctie gevolg van ontwikkeling, verwonding, ziekte, behandeling of chemische toxiciteit tonen. In deze video, tonen we een methode om kracht te meten tijdens een maximale contractie van de zebravis larven romp spieren.

Force Measurement Tijdens Inkrimping naar Muscle Function beoordelen in zebravis Larven

De zebravis is nu een gevestigde en krachtige tool voor het modelleren van musculaire dystrofieën, aangeboren myopathieën en gerelateerde neuromusculaire ziekten. Tweekleurigheid en door aanraking veroorzaakt ontsnappingsgedrag zijn twee veelvoorkomende niet-invasieve tests die worden gebruikt om de mate van musculaire desorganisatie en bewegingsbeperking van zebravisembryo's tijdens de vroege ontwikkeling te bepalen.

Analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birisfringence- en touch-evoke escape response-assays

Skeletspieren is essentieel voor de motoriek en is het lichaam 'belangrijkste eiwit store. Muscle gezondheid metingen binnen C. elegans beschreven. Prospectieve veranderingen in de spier structuur en functie worden beoordeeld met behulp van gelokaliseerde GFP en kationische kleurstoffen.

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen C. elegans

Zebravissen zijn een uitstekend model om spierfunctie en ziekte te bestuderen. Tijdens de vroege embryogenese beginnen zebravissen met regelmatige spiercontracties die een ritmisch zwemgedrag produceren, dat verandert wanneer de spier wordt verstoord. Hier beschrijven we een door aanraking veroorzaakte reactie en een locatiemeting om zwemprestaties te onderzoeken als maatstaf voor spierfunctie.

Met behulp van Touch-opgeroepen Response en Locomotion Testen om Muscle Prestaties en functie in zebravis Assess

Finite Element Analysis is een veelgebruikt hulpmiddel om de mechanische prestaties van structuren onder belasting te onderzoeken. Hier passen we het toe op het modelleren van de biomechanica van de bek van de zebravis.

Het bouwen van Finite Element modellen te onderzoeken zebravis Jaw biomechanica

Het doel van dit protocol is te wijzigen van de doordringendheid van dodelijke skelet mutant fenotypen in zebrafish door selectief fokken. Dodelijke mutanten naar volwassenheid kunnen niet worden gekweekt en zelf gefokt, dus dit protocol beschrijft een methode voor het bijhouden en selecteren doordringendheid door meerdere generaties nakomelingen testen.

Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

Hier hebben we alizarine rode kleuring gebruikt om aan te tonen dat blootstelling aan loodacetaat een botmassaverandering veroorzaakt bij zebravislarven. Deze kleuringsmethode kan worden aangepast aan het onderzoek naar botverlies bij verlies van zebravislarven veroorzaakt door andere gevaarlijke toxische stoffen.

Alizarine rode kleuring gebruiken om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Dit protocol beschrijft een cryoinjury-model om diepgaande schade aan verschillende caudale myomeren bij volwassen zebravissen te induceren. Deze methode biedt een nieuwe benadering voor het bestuderen van skeletspierregeneratie na ernstig verlies van weefsel bij gewervelde dieren van niet-zoogdieren.

Een cryoletselmodel voor het bestuderen van skeletspierregeneratie van de caudale steel bij volwassen zebravissen

Leer de Evans Blue Dye-injectiemethode voor het analyseren van skeletspierintegriteit bij zebravislarven. Deze techniek helpt onderzoekers musculaire dystrofiemechanismen te bestuderen en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen.

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

Meer video's verkennen