Studiare la Stechiometria di Epidermal Growth Factor Receptor in cellule intatte con correlativa Microscopia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare la distribuzione e la stechiometria dei recettori del fattore di crescita epidermico o EGFR nella membrana plasmatica di cellule intatte e idratate mediante microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando cellule esprimenti EGFR, come le cos sette, su microchip dotati di una membrana sottile di nitruro di silicio spessa 50 nanometri, che si estende su un'area centrale a forma di finestra. Successivamente, le cellule vengono incubate con una versione biotinilata del fattore di crescita epidermico che si lega al recettore e ne modifica la conformazione, inducendo la dimerizzazione e l'attivazione.

Successivamente, le cellule vengono fissate per immobilizzare i recettori e incubate con punti quantici coniugati Hagen privati che si legano ai recettori attivati da EGF, quindi le cellule vengono sottoposte a imaging. Infine, una seconda fissazione con glutaraldeide crea legami incrociati tra l'abito privato nei punti quantici coniugati e il EGFR, stabilizzando il campione per la microscopia elettronica. I risultati mostrano una emissione di fluorescenza rossa mediante imaging con punti quantici fluorescenti e la distribuzione del EGFR, il suo stato stechiometrico o il raggruppamento tramite microscopia elettronica a trasmissione in scansione.

Questo metodo fornisce informazioni uniche sulla geometria e distribuzione dei recettori di membrana in cellule intatte e può essere utilizzato per ottenere informazioni sull'attivazione del recettore del fattore di crescita epidermico in cellule normali e tumorali. Può inoltre essere applicato allo studio di altri recettori di membrana, come i canali ionici. Per iniziare, operare sotto cappa chimica. Per i primi passaggi di preparazione delle microchip di membrana di nitruro di silicio e dopo l'immersione in acetone secondo il protocollo descritto, trasferire direttamente le microchip in un becher di etanolo e attendere due minuti; quindi rimuovere le chip dall'etanolo e posizionarle su un fazzoletto da camera bianca.

Una volta che i chip si sono asciugati, trasferirli su un vetrino precedentemente posizionato in una piastra di Petri. Quindi, coprire la piastra con il coperchio. Successivamente, inserire il vetrino con i microchip in un apparecchio per la pulizia al plasma.

Eseguire un programma standard di pulizia di cinque minuti per rendere idrofila la superficie della membrana in nitruro di silicio. Quindi, all'interno della cappa a flusso laminare, trasferire i microchip dal vetro. Farli scivolare su un fazzoletto da camera bianca prima di posizionarli in una pozzetta di una piastra a 24 pozzetti riempita con soluzione di poli-L-lisina o PLL e incubare per cinque minuti.

Quindi, trasferire uno alla volta i microchip in una seconda pozzetta contenente acqua di grado HPLC, prima di lavarli in una seconda pozzetta con acqua. Infine, posizionare singolarmente i microchip in pozzette riempite con DM di una piastra a 96 pozzette e collocare la piastra in un incubatore a anidride carbonica utilizzando una sottocoltura di cellule COS-7. Preparare una sospensione cellulare monodispersa con una concentrazione di circa cinque per dieci alla terza.

Quinta cellula per millilitro. Aggiungere una goccia di sospensione cellulare a ciascun microchip nella piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti con un microscopio invertito. Iniziare a esaminare le aree dei microchip per ottenere una densità approssimativa di 20-30 cellule COS-7 per finestra di 150 per 400 micrometri.

Una volta che le cellule si sono sufficientemente aderite, trasferire con attenzione i microchip con le cellule rivolte verso l'alto in nuove pozzette contenenti dm. Quando un numero sufficiente di cellule è rimasto aderito, trasferire i microchip con le cellule rivolte verso l'alto in nuove pozzette contenenti dmm privo di siero. Successivamente, incubare i microchip a 37 °C in un'incubatrice a biossido di carbonio per alcune ore fino alla notte successiva, in previsione dei passaggi seguenti.

Utilizzando una piastra a 96 pozzetti, riempire nuovamente i pozzetti con le soluzioni necessarie e utilizzare una colonna per ogni microchip. Lavare i microchip posizionandoli in un pozzetto con B-S-A-G-E-L-P-B-S fresco e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire i microchip in una soluzione di EGF biotinilato 300 nano molar e riposizionarli nell'incubatrice per tre minuti poiché le cellule inizieranno a internalizzare l'EGF marcato per EGFR.

Risciacquare rapidamente i microchip con PBS per tre volte. Quindi utilizzare un buffer di cate a 0,1 molarità o CB per risciacquare i campioni. Successivamente, trasferire i microchip in PFA al 3% e incubare per 10 minuti.

Dopo aver sciacquato una volta con CB e tre volte con PBS, trasferire le chip in G-L-Y-P-B-S e incubare per due minuti. Successivamente, sciacquare due volte con PBS. Ora, posizionare le microchip in S-T-R-Q-D 10 NANOMOLARE per 10 minuti prima di sciacquare quattro volte con B-S-A-P-B-S.

Quindi immergere un microchip in una piastra da 35 millimetri con fondo in vetro riempita in precedenza con B-S-A-P-B-S a temperatura ambiente per osservare le cellule mediante microscopia DIC e microscopia a fluorescenza. Utilizzare un obiettivo a immersione d'aria 40 x per ottenere immagini di riepilogo delle cellule marcate con QD 6 55. Usare un cubetto filtro che eccita i punti quantici tra 340 e 380 nanometri con emissione superiore a 420 nanometri.

Minimizzare l'intensità della luce per evitare una luce troppo intensa che potrebbe danneggiare il campione. Impostare il tempo di esposizione almeno a 300 millisecondi in modo che i segnali di tutti i punti quantici vengano acquisiti; regolare l'intensità della luce e l'amplificazione per ottenere immagini luminose senza rumore visibile nell'immagine, riducendo al minimo l'intensità della luce. Dopo l'acquisizione, riposizionare il microchip in una piastra a 96 pozzetti contenente B-S-A-P-B-S.

Risciacquare una volta in cb, quindi trasferire in una soluzione di glutaraldeide al 2% e incubare per altri 10 minuti. Lavare e utilizzare B-S-A-P-B-S per lavare il microchip tre volte, quindi conservarlo in pozzetti di una nuova piastra a 96 pozzetti riempiti in anticipo con B-S-A-P-B-S, uno per ogni microchip. Riempire una fila di quattro pozzetti con acqua di grado HPLC.

Dopo aver configurato l'ESEM secondo il protocollo descritto nel testo, carichi un campione nel portacampioni STEM ESEM pre-COOL estraendo la piastra 96 WAT dal contenitore refrigerato e posizionandola vicino al portacampioni ESEM aperto. Posizioni un fazzoletto da laboratorio pulito accanto ad essa. Sciacqui rapidamente un microchip immergendolo quattro volte in un pozzetto riempito con acqua di grado HPLC, per un secondo ogni volta.

Asciugare brevemente il retro del microchip sulla carta da filtro e posizionarlo sulla piastra pre-raffreddata con tre microlitri di acqua pura per HPLC raffreddata. Inumidire la superficie del campione e fissarlo sulla piastra. Quindi aggiungere altre tre gocce d'acqua da tre microlitri sulla piastra vicino al campione e chiudere la camera del campione.

Dopo aver identificato una cellula di interesse, secondo il protocollo descritto registrare un'immagine panoramica in microscopia elettronica a scansione (STEM) della cellula, spostarsi in una regione periferica della cellula in cui è visibile il bordo cellulare e ingrandire fino a un’ingrandimento di 50.000 X. Registrare immagini che mostrano i singoli punti quantici (qds) utilizzando tempi di permanenza del pixel compresi tra 20 e 30 microsecondi. Qui vengono mostrati punti quantici QD 655 marcati per EGFR legato alla membrana in cellule COS sette integre e completamente idratate. L'immagine in contrasto di interferenza differenziale (DIC) illustra la topografia della membrana cellulare e l'immagine di fluorescenza corrispondente mostra la distribuzione di EGFR su tutta la superficie della cellula dopo tre minuti di incubazione con EGF biotinilato.

Queste immagini ESEM STEM a basso ingrandimento rivelano strutture fini come i filopodi che si estendono dalla cellula verso le cellule adiacenti e alcune strutture all'interno delle regioni cellulari più sottili. Le regioni cellulari centrali più spesse, inclusa la nucleo, appaiono bianche perché la trasmissione attraverso il campione non è possibile per gli elettroni con l'energia utilizzata. Alta risoluzione.

Le immagini ESEM STEM delle regioni periferiche più sottili mostrano etichette QD su una piega della membrana che attraversa diagonalmente l'immagine. Questa struttura membranosa presenta una densità di EGFR maggiore rispetto alle regioni circostanti in diversi punti, con due etichette in prossimità. Due esempi con distanze di 20 e 24 nanometri sono indicati con delle freccette.

Queste coppie di etichette sono interpretate come appartenenti a EGFR. L'immagine è stata registrata in una regione con una densità di EGFR e un segnale fluorescente più bassi. Tuttavia, anche in questo caso l'EGFR è stato riscontrato in forma dimera e sono state osservate due agglomerati di 10 o 11 EGFR.

Una volta padroneggiata, la preparazione del campione può essere completata entro due ore, molto più velocemente rispetto alle tecniche comunemente utilizzate per la microscopia elettronica. L'imaging successivo in STEM in modalità essem può fornire fino a 100 immagini ad alta risoluzione entro mezza giornata.