Name: Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Impara metodi di elaborazione del tessuto umano per la ricerca traslazionale sul cancro. Questa tecnica massimizza la qualità e la quantità dei dati estratti da campioni chirurgici limitati.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai contributi filantropici della John G. e Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0.727.033) e il Melanoma Research Alliance. Gli autori desiderano ringraziare l&#39;Università del Tissue Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Bank (ITB) di coordinare la distribuzione di tessuti e di raccolta e facilitare la ricerca traslazionale, così come il dottor Ignacio Wistuba, il dottor Victor Prieto, il Dipartimento MD Anderson Cancer Center di Patologia e il Programma di Tiro Melanoma Luna. Infine, gli autori desiderano ringraziare tutti i pazienti e le famiglie colpite da melanoma.

Dichiarazione Etica: Questo protocollo è approvato dalla University of Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Procurement campioni <ol><li> Raccogliere campioni di tessuto tumorale ricerca da surplus e relativo tessuto normale 10-12. Conservare i campioni sul ghiaccio bagnato per evitare autolisi. </li><li> Invia tutti i tessuti, dispositivi medici e corpi estranei rimossi durante una procedura chirurgica per il Dipartimento di Patologia all&#39;esame necessario per facilitare una diagnosi patologica. </li><li> Maniglia tessuto assegnato per la ricerca in conformità con la ricerca applicabili e le politiche bancarie dei tessuti e delle procedure. NOTA: collezione Biospecimen richiede un coordinamento delle patologi, patologi &#39;assistenti, histotechnologists e specialisti di approvvigionamento dei tessuti. </li></ol> 2. Patologia Quality Assurance (QA) <ol><li> Completare e verificare i dati dei pazienti come misura QA precoce e consultare un patologo a rivedere pa diagnosticorecord di degenza per (rapporti di patologia, scivoli di tessuto, ecc) e campioni di tessuto. Campioni di tessuto giudice caratteristiche morfologiche di interesse come la percentuale di tumori, necrosi, l&#39;interfaccia del tessuto tumorale, ecc Questo è in linea con le best practice biorepository 10-12. </li><li> A seguito di revisione iniziale, condurre revisioni periodiche dei dati biorepository e campioni di ricerca durante l&#39;intera durata del soggiorno dei biospecimen. </li><li> Risultati di link e annotazioni di istopatologici e altre indagini ai campioni e fornire questi dati ai ricercatori attraverso un sistema di software biorepository proprietario. NOTA: i processi QA assicurare l&#39;integrità di entrambi gli aspetti clinici e tecnici delle operazioni biorepository. </li><li> Eseguire i test genetici e molecolari per verificare e caratterizzare i campioni per uso clinico. </li><li> Raccogliere e analizzare i dati in base al feedback da parte dei ricercatori che hanno utilizzato i campioni per esperimenti di laboratorio. Tracciacampioni che utilizzano la tecnologia del codice a barre. Questo sistema di monitoraggio elettronico è anche sostenuto in best practice biorespository 10-12. </li></ol> 3. campioni / Tissue Processing <ol><li> Conservare sempre campioni di tessuto fresco in ghiaccio, e procedimenti più rapidamente possibile, al fine di limitare i cambiamenti indotti da estrazione del campione di tessuto dal suo ambiente naturale. Processo normale tumore abbinato e campioni di tessuto tumorale separatamente per evitare la contaminazione incrociata. NOTA: In base a protocolli di ricerca, elaborazione biospecimen può comportare la raccolta di esemplari in uno o più tipi di media. </li><li> Prima di iniziare il processo, preparare una piastra di Petri sterile cultura, un bisturi, così come un ago o pinze per la lavorazione del tessuto. Accertarsi che i tubi sono stati preparati, etichettati, e disposti al fine di limitare il tempo di trattamento del campione (Figura 2). </li><li> Tutte le informazioni pertinenti dei tessuti, come ad esempio il nome del paziente, il numero, il trattamento, la data dichirurgia, e altre informazioni pertinenti come può essere adatto per lo studio, dovrebbero essere resi facilmente accessibili in un database del tessuto istituzionale. Informazioni per il paziente limitata dovrebbe essere tenuto in laboratorio in formato cartaceo o foglio di calcolo. NOTA:. Raccogliere solo le informazioni biospecimen pertinenti alla natura del cioè ricerca, la ricerca di base biomedica, la ricerca clinica, la ricerca traslazionale, ecc Per informazioni malattia-specifica, il personale biorepository dovrebbe raccogliere dati ritenuti necessari per la letteratura e le organizzazioni che governano a assicurare una corretta diagnosi e la ricerca di significato. Questo include ma non si limita ai gradi tumorali e cancro informazioni stadiazione. </li><li> Piano tutti gli esperimenti successivi desiderati in anticipo, per decidere la dimensione delle sezioni di tessuto necessari per ogni tipo di analisi, così come la posizione di escissioni. Idealmente, anche se impossibile, tutte le analisi devono essere rappresentativi di tutta la sezione di tessuto al fine di tenere conto di heterogenei tessutoty e il limite di polarizzazione delle analisi a valle. Disporre tutti gli elementi richiesti in anticipo come illustrato nella Figura 2. </li><li> Posizionare il campione di tessuto del piatto di coltura di Petri aperta, piatto contro la superficie. NOTA: Consenti solo personale autorizzato biorepository per gestire i campioni individuati e per consultare i dati sanitari identificati. Gli investigatori dovrebbero accedere solo quelle identificazione del paziente, come consentito dalle consensi informati firmati e come regolato dalla IRB. Tutti i campioni devono essere adeguatamente etichettati e dovrebbero comprendere come minimo, un numero di identificazione dei tessuti e tessuti tipo unico. Non includere qualsiasi PHI nelle etichette, in conformità alla normativa HIPAA. </li><li> Controllare il campione da tutti gli angoli, per ottenere una migliore comprensione della struttura e dimensioni. Pin il campione al fondo del piatto con l&#39;ago, e procedere alla bisettrice del tessuto lungo il suo asse maggiore e migliore rappresentante. </li><li> Tagliare un piccolo pezzo di tessuto e metterlo in una sterile 1,5 ml micrtubo ocentrifuge contenente 1 ml di soluzione-RNA stabilizzante. Questo esempio può essere collocato sul ghiaccio per il resto del processo e conservata a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. NOTA: Quando si lavora con l&#39;RNA, guanti deve sempre essere indossato, e puntali con filtro RNasi-free dovrebbe essere usato per limitare le possibilità di degradazione e la contaminazione di RNA. </li><li> Disporre una cassetta biopsia aperta e pre-marcato nel coperchio del piatto cultura Petri. Tagliare una fettina di tessuto di spessore non superiore a 5 mm 3 e trasferirlo alla cassetta. Mettere la cassetta nel 10% neutra tamponata formalina (NBF) per un minimo di 72 ore. Trasferire la cassetta in etanolo al 70% per l&#39;archiviazione a lungo termine prima di paraffina-embedding. NOTA: Labeling di cassette deve essere effettuata a matita o con marcatori raccomandati come uso di xilene durante la lavorazione si altrimenti cancellerà etichette. </li><li> Tagliare un pezzo di tessuto e metterlo in uno stampo di tessuto. Coprire la sezione di tessuto in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto, e congelare immediatamentea -20 ° C per criosezionamento. Questa sezione di tessuto può essere conservato a -20 ° C fino al momento criosezionamento. </li><li> Tagliare uno o più pezzi di tessuto e di trasferirli in un tubo da 50 ml contenente tampone MACS (1x tampone fosfato salino (PBS), siero fetale bovino 0,5% (FBS), 2 l&#39;acido etilendiamminotetracetico mm (EDTA)) per la successiva citometria a flusso di analisi . Per la citometria a flusso, i campioni più grandi possono essere preferibile in quanto le cellule potrebbero essere persi durante dissociazione tumore, la fissazione delle cellule e permeabilizzazione quando richiesto. Generalmente, questa sezione può essere presa alla fine, una volta che tutte le altre parti sono state elaborate. Leftover campione del tumore rappresentante può essere utilizzato per la citometria a flusso. Opzionalmente, questo tubo può essere conservato a 4 ° CO / N o utilizzati per la colorazione di citometria di flusso immediatamente dopo la digestione in una sospensione cellulare (vedere il punto 4 - citometria a flusso colorazione). </li><li> Tagliare resto del tessuto in pezzi non più grandi di una dimensione massima di 0,5 mm x 0,5 mm e trasferirli criogenicofiale per immediatamente congelati in azoto liquido. Questi campioni a scatto congelati possono essere utilizzati per analisi future e le finalità di collaborazione. NOTA: La cura supplementare dovrebbe essere presa quando si lavora con l&#39;azoto liquido come il contatto diretto può provocare gravi lesioni. Gli occhi devono essere protetti con occhiali di sicurezza con protezioni laterali o con una visiera. Guanti criogenici dovrebbero anche essere indossati per proteggere dalle scottature azoto liquido causati da spruzzi e il contatto diretto. I guanti devono misura giusta ma essere abbastanza largo da rimuovere rapidamente dovrebbe azoto liquido spruzzata in loro. </li></ol> 4. citometria a flusso Colorazione <ol><li> Tissue omogeneizzazione <ol><li> Preparare medio digestione con DMEM (40 ml), DNasi I (50 U / ml) e collagenasi I (2 mg / ml). Luogo fresco o tumore O / N-memorizzato in tampone MACS nel coperchio di una piastra di Petri e sommergere con mezzo di digestione. NOTA:. Esistono diversi metodi di digestione, ciascuno con vantaggi (per esempio, superficie cellulare proteina expressione, vitalità). Assicurarsi di avere il metodo corretto per l&#39;applicazione a valle desiderata. </li><li> Tumore bottone al fondo del piatto con un ago, e taglio dall&#39;esterno per centrare con un bisturi, fino a quando il tumore ha una consistenza pastosa. Trasferimento mix tumore ad un tubo da 50 ml, sigillo e mettere in un sacchetto di plastica per evitare perdite. Trasferire tubo un&#39;incubatrice, e ruotare a 225 RPM, 37 ° C, 1 ora. </li><li> Filtro sospensione delle cellule tumorali attraverso un colino cellula 70μm. Sospensione cellulare a 250 xg Centrifugare, 4 ° C, 5 min. Risospendere pellet di cellule in 1 ml di tampone di FACS (500 ml di PBS, 1 ml di 0,5 m stock EDTA, 10 ml FCS o FBS). </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e risospendere alla concentrazione di 1x10 7 cellule / ml. Trasferire 100 microlitri per pozzetto (10 6 celle) in una piastra di fondo pozzo rotondo 96 per la colorazione. </li></ol></li><li> Viabilità e anticorpi colorazione <ol><li> Aggiungere 200 ml di soluzione colorante vitalità in ogni pozzetto e mescolare. Incubate per 30 minuti, a 4 ° C, al buio. Spin le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungi miscela di anticorpi a raccomandato / concentrazione titolato (secondo produttore) per antigeni di superficie in 200 ml di tampone FACS. Incubare le cellule a 4 ° C, 30 min, al buio. Spin le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante. </li><li> Lavare con 200 ml di tampone FACS, centrifugare le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 200 ml di buffer di FACS e procedere al citofluorimetro per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi. NOTA: Se si effettuano intracellulare citometria a flusso colorazione, eseguire fissazione e passi permeabilizzazione e colorazione intracellulare tra i passaggi 4.2.2 e 4.2.3. Se si esegue citochine colorazione, le cellule devono essere pre-attivato colorazione precedente come raccomandato, e un inibitore del trasporto della proteina intracellulare e la secrezione quali monensin dovrebbero essere utilizzati durante l&#39;attivazione perassicurare il mantenimento di fattori solubili. Cellule fisse possono essere conservate a breve termine (una settimana) a 4 ° C al buio prima di acquisizione su un citometro a flusso. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Infine, i metodi di lavorazione devono essere dettate dalla ipotesi desiderata e previsti saggi tecnici da eseguire (Figura 1). La sezione seguente serve come una panoramica di descrivere eventuali saggi che possono essere eseguite su tali sezioni di tessuto. E non è affatto un quadro esaustivo, ma ha lo scopo di aiutare i metodi di lavorazione campione di guida e scelta di saggi a valle con tecniche descrivere ed elencare i loro punti di forza e di debolezza. Citometria a f...

La ricerca medica ha beneficiato immensamente dallo studio di entrambe le linee cellulari umane e modelli animali. Linee cellulari consentono un migliore controllo dei componenti in un sistema, così come l&#39;uso di cellule dalla corretta organismo. Lavorare con le cellule umane, mentre più rappresentativo, presenta un&#39;istantanea drasticamente semplificata di meccanismi che potrebbero essere responsabili per la salute e la malattia, perché le linee di cellule non potrebbero riassumere l&#39;impatto di altre cellule, componenti stromali e gli organi che possono influenzare le risposte 1. D&#39;altra parte, i modelli animali, anche se non del tutto accurata nel riprodurre malattie umane e eterogeneità genetica, offrono ulteriore comprensione, consentendo per l&#39;introduzione di sistemi animali interi nella maggior parte dei modelli 2,3. Carenze a parte, entrambi i metodi hanno i loro vantaggi e sono complementari. Tuttavia, l&#39;obiettivo principale rimane per studiare le cellule e organi umani, in un corpo pieno, sistema multi-organo. Di conseguenza, la ricerca traslazionale ha takit grandi passi avanti nel facilitare lo studio di organi e tessuti umani estratti da pazienti, al fine di cogliere meglio i meccanismi della malattia di base. Ricerca traslazionale offre il vantaggio di studiare il risultato di trattamenti e malattie in tutto il corpo e in cellule opportune, fornendo in tal modo il meglio dei due mondi tra cellula animale e di lavoro 4. Ricerca traslazionale inoltre, non è esente da difetti. Campioni raccolti da pazienti umani, dopo la rimozione dal padrone di casa, sono immediatamente sottoposti a ischemia e altri fattori esterni, da cui sarebbero stati altrimenti protetti. Ciò può causare cambiamenti molecolari e genetiche indotte dallo stress, e causare pregiudizi in studi successivi. Pertanto, molto sforzo è stato messo in estrarre e trattare i tessuti con metodi rigorosi per conservare meglio organo e l&#39;integrità delle cellule per gli studi a valle 5. È importante sottolineare che le future applicazioni devono essere considerate attentamente quando si seleziona i metodi of elaborazione campioni umani, come certi metodi possono essere dannosa per i componenti cellulari e vie di segnalazione, risparmiando altri. Per ogni ricerca che coinvolge i tessuti umani, questioni normative devono essere affrontate. Dopo le relazioni di Tuskegee e Belmont, c&#39;è stata una crescente accettazione del fatto che la ricerca biomedica è risultato associato a rischi spesso con conseguente dilemmi etici inevitabili 6. La necessità di norme nazionali è stata riconosciuta e il governo federale ha creato Institutional Review Boards (IRB) come un mezzo per sostenere i principi del Rapporto Belmont (rispetto delle persone, la beneficenza, la giustizia). IRB di ogni istituzione è un comitato di medici, ricercatori e membri della comunità che sono responsabili per la protezione dei partecipanti alla ricerca. Si richiede che il consenso volontario presso tutti i partecipanti di studi di ricerca biomedica, e che tale consenso documentato in un consenso informato fo<html> rm. Il processo di consenso informato si propone di fornire informazioni adeguate a un partecipante, in modo che una decisione informata può essere fatta o meno di iscriversi in uno studio, o di continuare la partecipazione. A questo proposito, il documento di consenso informato deve avere una buona leggibilità e dovrebbe essere scritto in un linguaggio che può essere facilmente compreso (6 all&#39;8 livello di lettura grado) da parte della popolazione bersaglio. La possibilità di coercizione o indebito condizionamento deve essere ridotto al minimo, e il soggetto deve essere dato tempo sufficiente per prendere in considerazione la partecipazione. Il partecipante deve essere consentito di esercitare il diritto di revocare il consenso in qualsiasi momento durante il corso dello studio senza penalità. Consenso informato volontario è un pre-requisito obbligatorio per la partecipazione di un soggetto nel campo della ricerca ed è anche giuridicamente efficace 7. Come da regolamento per la protezione dei diritti umani assoggetta 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), partecipanti allo studio devono essere informati dello scopo della ricerca, le procedure coinvolti nella ricerca, alternative alla partecipazione, tutti i rischi prevedibili e disagi (tra cui non solo danni fisici, ma anche possibile danni psicologici, sociali o economiche, disagio o disagio), i benefici della ricerca per la società e, eventualmente, per l&#39;individuo, tempo in cui il soggetto si aspetta di partecipare, persona da contattare per le risposte alle domande o in caso di un infortunio connesse alla ricerca o di emergenza, dichiarazione che indichi che la partecipazione è volontaria e che il rifiuto di partecipare non comporterà alcuna conseguenza o qualsiasi perdita di benefici, come un compromesso in una regolare cura clinica che il partecipante ha comunque diritto a ricevere come risultato dei suoi / sue diagnosi, e, infine, una dichiarazione per quanto riguarda il diritto del soggetto alla riservatezza e diritto di recedere dalstudio in qualsiasi momento senza conseguenze. I campioni di tessuto da partecipanti che si ritirano consenso nel corso dello studio non devono essere inclinate e devono essere immediatamente esauriti. Rinuncia di uno o più elementi di consenso informato possono essere ottenute presso la IRB per alcuni progetti di ricerca che non possono praticamente essere fatto senza una modifica gli elementi necessari o per studi in cui gli elementi richiesti non sono applicabili. Grande cura deve essere presa per garantire la riservatezza dei dati. La Health Insurance Portability e Accountability Act (HIPAA) è una legge federale che impedisce di utilizzo o la divulgazione &quot;Protected Health Information&quot; (PHI) senza il consenso scritto da parte dei partecipanti. PHI include ma non si limita alle informazioni sulla salute trasmesse o mantenuti in qualsiasi forma o mezzo e comprende campi che potrebbero essere utilizzate per identificare un individuo 9. Attraverso questo lavoro, ci proponiamo di delineare il protocollo da seguire durante tissue trattamento - compresi gli appalti, e lo stoccaggio e sottolineano l&#39;importanza di queste linee guida rigorose seguente, in modo da ridurre al minimo le distorsioni che possono derivare a causa delle sollecitazioni un tessuto è sottoposto al momento dell&#39;estrazione. Abbiamo anche sforziamo di fornire una breve panoramica dei saggi a valle o analisi (Figura 1) che possono essere eseguite su tali esemplari modo che i lettori possano esprimere un giudizio qualificato su quale dosaggio (s) più adatta alle loro esigenze.

<table><tbody><tr><td>Aghi</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi monouso in acciaio inox</td><td>Miltex</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale</td><td>Cassette per</td><td>biopsia</td> Corning 353003 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione stabilizzante dell'RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 ml</td><td>Phenix</td><td>MAX-815</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponata neutra al 10%</td><td>StatLab Medical Products</td><td>28600-5</td><td></td></tr><tr><td>Contenitori in formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-032-059</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione ottimale per la temperatura di taglio (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; filtri cellulari m</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>piastre a fondo rotondo a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di colorazione viva/morta</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr></tbody></table>

lavorare con tessuti umani per translational cancer research

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

La ricerca medica a beneficio dell'uomo è fortemente ostacolata dalla necessità di tessuti e soggetti umani. Tuttavia, dopo aver ottenuto il consenso per i campioni umani, i campioni preziosi devono essere maneggiati con la massima cura al fine di garantire l'integrità di organi, tessuti e cellule al massimo grado. Purtroppo, il processamento tissutale richiede per definizione l'estrazione di tessuti dall'ospite, un cambiamento che può causare un grande stress cellulare e avere importanti ripercussioni sulle analisi successive. Queste sollecitazioni potrebbero far sì che il campione non sia più rappresentativo del sito da cui è stato recuperato. Pertanto, è necessario rispettare un protocollo rigoroso durante l'elaborazione di questi campioni per garantire la rappresentatività. Anche il saggio o i saggi desiderati devono essere presi in considerazione al fine di garantire che venga utilizzata una tecnica ottimale per l'elaborazione dei campioni. Di seguito viene descritto un protocollo per il recupero dei tessuti, l'elaborazione e varie analisi che possono essere eseguite su tessuti lavorati al fine di massimizzare la produzione a valle da campioni di tessuto limitati.

<html> I risultati visualizzati rappresentano il flusso di strategia citometria gating per un&#39;ampia fenotipizzazione immunitario un tumore melanoma trattati. Il giorno di colorazione, campione di tessuto è stato digerito con collagenasi e omogeneizzato I e DNasi I incubazione per 60 min a 37 ° C sotto 225 rotazione RPM. A seguito di digestione, sospensione cellulare è stata filtrata attraverso un colino cella 70 micron per eliminare i detriti e le cellule sono state colorate con il flusso di fluorescenza marcata cito...

La ricerca traslazionale sul cancro dipende dall'estrazione di tessuti umani. Molto lavoro è stato dedicato all'ottimizzazione dei metodi di estrazione per l'analisi ex vivo. Qui, descriviamo i metodi di lavorazione dei tessuti che consentono di ottenere la massima produzione di dati da campioni limitati.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

L'obiettivo generale di questa procedura è massimizzare la qualità e la quantità di dati estratti da campioni di tessuto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca traslazionale sul cancro, come ad esempio quali mutazioni sono presenti, quali percorsi sono attivati e quali sottotipi di cellule immunitarie infiltrano i tumori umani. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile generare una grande quantità di dati a partire da un singolo intervento chirurgico di resezione del tessuto umano.Uno dei passaggi più critici prima dell'elaborazione del campione è garantire la qualità del campione e validare la presenza di tumore vitale mediante valutazione istopatologica, come descritto nel testo del protocollo. Tutte le informazioni rilevanti relative al campione o al tessuto, come nome del paziente, numero, trattamento e data dell'intervento chirurgico, devono essere facilmente accessibili in un database istituzionale dei tessuti. I campioni di tessuto fresco devono essere sempre conservati su ghiaccio umido ed elaborati il più rapidamente possibile per limitare le alterazioni indotte dall'estrazione del campione tessutale dal suo ambiente naturale. I campioni di tessuto tumorale e di tessuto normale abbinato al tumore devono essere elaborati separatamente.Per evitare contaminazioni incrociate, preparare una piastra di Petri sterile, un bisturi e un ago o delle pinzette per l'elaborazione del tessuto. Per limitare il tempo di lavorazione del campione, disporre in anticipo tutti gli strumenti necessari come mostrato qui. Posizionare il campione di tessuto all'interno della piastra di Petri aperta, appoggiandolo piatto sulla superficie.Esaminare il campione da tutti gli angoli per ottenere una migliore comprensione della sua struttura e delle sue dimensioni. Fissare il campione al fondo della piastra con l'ago e procedere a sezionare il tessuto lungo il suo asse più lungo e rappresentativo. Ritagliare un piccolo pezzo di tessuto e collocarlo in una provetta sterile da 1,5 millilitri per microcentrifuga contenente un millilitro di soluzione stabilizzante per RNA.Collocare questo campione sul ghiaccio per il resto del processo e conservarlo a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Disporre una cassetta per biopsia aperta e pre-etichettata sul coperchio della piastra di Petri. Tagliare una fetta di tessuto non più spessa di tre-cinque millimetri e trasferirla nella cassetta.Posizionare la cassetta in formalina tamponata al 10% per un minimo di 72 ore. A temperatura ambiente, asportare un pezzo di tessuto e collocarlo in uno stampo per tessuti. Coprire la sezione di tessuto con composto ottimale per la temperatura di taglio e congelarla immediatamente a meno 20 gradi Celsius fino al momento della criosezionatura.Prelevare uno o più pezzi di tessuto e trasferirli in un tubo da 50 millilitri contenente buffer max. I tessuti possono essere utilizzati freschi o conservati durante la notte a quattro gradi Celsius per l'analisi di citometria a flusso. Tagliare il tessuto rimanente in frammenti di dimensioni non superiori a 0,5 millimetri per 0,5 millimetri e trasferirli in provette criogeniche.Congelare immediatamente i tessuti in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per iniziare questa procedura, preparare il mezzo di digestione con DM EMD NS one e collaghenasi. Posizionare un tumore fresco o conservato durante la notte nel buffer max nel coperchio di una piastra di Petri e immergerlo nel mezzo di digestione.Fissare il tumore al fondo della piastra con un ago e tagliare dall'esterno verso il centro con un bisturi fino a quando il tumore assume una consistenza simile a una pasta. Trasferire la sospensione tumorale in un tubo da 50 millilitri e sigillare il tubo per evitare perdite. Collocare il tubo in un incubatore e agitare a 225 giri al minuto a 37 gradi Celsius per un'ora.Dopo un'ora, filtrare la sospensione di cellule tumorali attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri, quindi centrifugare la sospensione cellulare a 250 ×g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare con un millilitro di buffer fax. Dopo aver contato le cellule utilizzando un emocitometro, risospendere le cellule a una concentrazione di 1 × 10⁷ cellule per millilitro.Trasferire 100 microlitri o 10 alla sesta cellule in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo. Aggiungere 200 microlitri di soluzione colorante per la vitalità in ogni pozzetto e mescolare; incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Dopo 30 minuti, centrifugare le cellule a 250 G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Aspirare il soprannatante. Aggiungere la miscela di anticorpi alla concentrazione titolata raccomandata per gli antigeni di superficie in 200 microlitri di buffer fax. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius al buio per 30 minuti.Centrifugare le cellule a 250 G e a quattro gradi Celsius per cinque minuti ed aspirare il soprannatante; lavare con 200 microlitri di buffer fax e centrifugare nuovamente le cellule, quindi aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer fax. Le cellule sono ora pronte per l'analisi mediante citometria a flusso. Questi risultati rappresentativi mostrano la strategia di gating in citometria a flusso per un fenotipaggio immunitario ampio su campioni tumorali di melanoma processati come illustrato e conservati durante la notte in buffer max a quattro gradi Celsius, che mostrano una mortalità estremamente limitata.Inoltre, viene illustrata l'elaborazione del tessuto. Consente un fenotipaggio ampio e multicolore di sottopopolazioni di cellule immunitarie nel melanoma, come cellule B, cellule T CD quattro, cellule T CD otto, cellule T gamma delta e cellule K, cellule dendritiche, macrofagi, mastociti, basofili, neutrofili ed eosinofili, una volta acquisita la padronanza della tecnica. Se eseguita correttamente, questa tecnica può essere completata in quattro ore.

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Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

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