Name: Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri l'estrazione automatizzata di DNA da campioni FFPE e la rilevazione delle mutazioni BRAF V600E mediante digital droplet PCR. Questo metodo migliora l'efficienza clinica e riduce i rischi di contaminazione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca e sviluppo per la società della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT &amp; Future Pianificazione (Grant No. 2013M3C8A1075908).

1. Estrazione del DNA da linee cellulari FFPE di riferimento standard Nota: Per questa procedura, estrazione del DNA è stata effettuata da linee cellulari standard di riferimento FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) utilizzando il tessuto DNA Kit di isolamento FFPE come descritto nel protocollo di seguito. Estrazione del DNA automatizzato è stato ottenuto seguendo le istruzioni del produttore per l&#39;estrazione del DNA totale. <ol><li> Utilizzando un microtomo e il blocco FFPE originale, preparare manualmente sezioni fresche prima di estrazione del DNA e analisi, secondo le procedure stabilite. Assicurarsi che l&#39;ingresso campione per la sezione di tessuto (s) analizzato non superi uno spessore totale di 10 micron e che la superficie non supera 600 mm 2 per una singola sezione. </li></ol> 1.2 Protocollo di TPS Nota: I volumi indicati nella tabella 1 corrispondono al minimo richiesto per elaborare 48 campioni, e la proceduraindicato è in conformità con le linee guida TPS. Prima di iniziare l&#39;esperimento sistemarsi i campioni FFPE nell&#39;e-tubo per centrifugazione a 600 xg, per evitare la perdita dei campioni nel corso del programma automatico. <ol><li> Accendere lo strumento isolamento del DNA automatizzato e il computer. Aprire il software di controllo Esegui e inserire un vassoio di caricamento automatico nella zona di piano di carico TPS. </li><li> Versare il reagente nelle loro depressioni corrispondenti, come mostrato in Figura 1. <ol><li> Posizionare i 4 campioni (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% e 1%) nei rack vettore campione. </li><li> Posizionare le scatole di punta nelle vaschette nelle colonne 2 e 3 e consultare i suggerimenti per la presenza di più di un filtro per ogni suggerimento, che interrompe la corsa. </li><li> Assicurare corretta miscelazione del tampone di lisi e tampone di lavaggio invertendo loro 3-5 volte e caricarle nelle rispettive depressioni nella colonna 4 (Figura 1). </li><li> Dopo l&#39;inversione per poche volte o Vort miteexing, caricare il tampone di eluizione, sfere magnetiche, e di buffer FFPE nelle piccole depressioni nella colonna 5, lasciando 1 slot vuoto dove indicato (Figura 1, Tabella 1). </li><li> Caricare un 2 ml profondo pozzetti (DWP) sul supporto piastra (Figura 1). </li></ol></li><li> Effettuare le seguenti operazioni finali prima di iniziare una corsa: <ol><li> Stappare tutti i tubi e le depressioni dei reagenti. Confermare che dispone di sufficiente capacità nella bottiglia rifiuti liquidi. Verificare che la bottiglia rifiuti solidi è vuota e foderato con un sacchetto. Verificare che la piastra di punta di espulsione è centrata nel gruppo dei rifiuti. </li><li> Chiudere il coperchio anteriore. </li></ol></li><li> Avviare il software. Aprire il file NA_Prep_Main_MLSTARlet.med. </li><li> Fare clic su &quot;Start&quot;. Lo stato dello strumento passa dal minimo a correre. </li><li> Inserire il numero di campioni per questa esecuzione. Scegliere il metodo desiderato per questa esecuzione (DNA = 0). Inserire la posizione della prima alta volume punta, selezionando &quot;1&quot; se tutti i vassoi sono pieni. Inserire la posizione della prima punta volume standard, selezionando &quot;1&quot; se tutti i vassoi sono pieni. Nota: Lo strumento quindi eseguire attraverso passaggi automatizzati senza l&#39;intervento dell&#39;utente. Un flusso di lavoro dettagliato è illustrato nella figura 2. Una volta che l&#39;esperimento è finito, rifiuti reagenti e punte sono iniettati nella piletta. </li><li> Quantificare DNA genomico purificato utilizzando un metodo fluorimetrico. Nota: campioni di DNA che contengono una concentrazione minima di 3,3 ng / ml sono sottoposti a ddPCR analisi (sezione 2). </li></ol> 2. DNA Mutazione Profiling: ddPCR protocollo Nota: Il protocollo per mutazione del DNA profiling consiste di 3 fasi principali: 1) generazione Droplet, 2) Convenzionale amplificazione PCR, 3) la lettura di gocce e 4) mutazione del DNA profiling. 2.1. Generazione Droplet Nota: ddPCR Supermix èconsigliato per ddPCR, come questa miscela contiene reagenti necessari per la generazione di goccioline. <ol><li> Per evitare la contaminazione, seguire le precauzioni standard, ad esempio indossando guanti, utilizzando una cappa pulita PCR, pipette pulite, e tubi basso contenuto proteico vincolante. </li><li> Assicurarsi che la concentrazione minima di campione di DNA genomico umano è di 3,3 ng / ml. Nota: La quantità di concentrazione del campione di DNA purificato varia in base all&#39;analisi di rilevamento della frequenza di mutazione%. </li><li> Montare miscele di reazione a piastre PCR da 96 pozzetti. Scongelare ed equilibrare i componenti di reazione di RT. Preparare le reazioni PCR combinando 2X ddPCR supermix (10 ml) e 20 primer (avanti e indietro, 900 nm) e sonda (250 Nm), con ogni campione di DNA purificato (66ng / 2 ml), portare a 20 ml con acqua distillata (come secondo il protocollo generatore di gocce) </li><li> Agitare accuratamente la miscela di garantire l&#39;omogeneità e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto al fondo della provetta prima di dispensare. Carico 20 &amp; #181; l sulla cartuccia per la formazione di goccioline. </li><li> Il funzionamento del generatore di gocce, per protocollo consigliato dal produttore <ol><li> Inserire la cartuccia nel supporto con la tacca nella cartuccia posizionato sul lato superiore sinistro del titolare. Aggiungere 20 ml di miscela di reazione contenente campioni in mezzo, e 70 ml di olio di generatore nei pozzetti inferiori. </li><li> Fissare la guarnizione nella parte superiore della cartuccia. Assicurarsi che la guarnizione sia saldamente agganciato su entrambe le estremità del titolare; altrimenti, pressione sufficiente per la generazione di goccioline non sarà raggiunto. </li><li> Aprire il generatore gocciolina premendo il tasto verde sulla parte superiore dello strumento e inserire la cartuccia. Quando la porta è nella posizione corretta, sia la potenza (sinistra a destra) e il supporto (destra centro) spie sono verdi. </li><li> Premere il pulsante in alto sullo strumento nuovo per chiudere la porta e avviare la generazione delle gocce. Nota: Dopo aver premuto il button, un collettore si posizioni sopra i pozzi di scarico, disegno e campioni di olio attraverso i canali microfluidica, dove vengono create le goccioline. Goccioline confluiscono goccia pozzo, dove si accumulano. La spia delle gocce (a destra) lampeggia in verde dopo 10 secondi per indicare che la generazione delle gocce è in corso. </li><li> Quando la generazione delle gocce è completo, tutti gli indicatori 3 luci cambiano a verde fissa; aprire la porta premendo il pulsante, e rimuovere il supporto dall&#39;unità. Rimuovere la guarnizione usa e getta dal supporto e scartarla. Nota: I primi pozzetti della cartuccia contengono goccioline, ed i pozzetti medio e basso sono quasi vuoto, con una piccola quantità di olio residuo. </li></ol></li></ol> 2.2. Preparazione per la PCR <ol><li> Per ciascun campione, Pipettare 40 ml del contenuto goccioline dall&#39;alto bene le cartucce in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti PCR raccomandata indicata nella protocollo dello strumento del produttore. Note: Usando una pipetta multicanale è ideale per trasferire le goccioline emulsioni. Lento e dolce l&#39;aspirazione di goccioline si consiglia di ridurre al minimo delle gocce di taglio durante i trasferimenti. </li><li> Sigillare la piastra PCR con pellicola subito dopo il trasferimento gocce per evitare l&#39;evaporazione. Utilizzare piastra del foglio perforabili che sono compatibili con la pellicola sigillante PCR e gli aghi nel lettore gocciolina. Seguire le istruzioni riportate nel manuale di istruzioni sigillante piatto PCR. </li><li> Impostare la temperatura della piastra sigillante a 180 ° C e il tempo di 5 sec. </li><li> Toccare la freccia per aprire lo sportello del vassoio. Posizionare il blocco di supporto sul vassoio con il lato di 96 pozzetti rivolto verso l&#39;alto. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul blocco di supporto e assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra sono allineati con il blocco di supporto. </li><li> Coprire la piastra a 96 pozzetti con 1 foglio di pellicola di sigillo perforabile. Una volta che la piastra a 96 pozzetti è fissato sul blocco di supporto e coperto con la pellicola di sigillo perforabile, toccare il pulsante di tenuta. Il vassoio si chiudee saldatura a caldo avvierà. </li><li> Quando termosaldatura è completa, la porta si apre automaticamente; rimuovere la piastra dal blocco calore per cicli termici e quindi rimuovere il blocco di calore. </li><li> Assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra sono sigillate verificando che le depressioni del foglio sono evidenti su ogni bene. Una volta sigillato, il piatto è pronto per cicli termici. </li><li> Una volta che le goccioline vengono rimossi, premere i fermi sul supporto della cartuccia per aprirlo. Rimuovere la cartuccia vuota e disfarsene. </li><li> Eseguire convenzionale amplificazione PCR seguendo i parametri descritti nella tabella 2. </li></ol> 2.3 lettura Droplet (come da protocollo consigliato dal produttore) Nota: Dopo l&#39;amplificazione PCR del target di acido nucleico nelle goccioline, lo strumento lettore gocciolina analizza ogni gocciolina singolarmente usando un sistema di rilevamento 2-colore 13. Noi di solito impostato per rilevare un FAMd VIC fluorofori giornalista. <ol><li> Fai clic su &quot;Sistema Flush&quot; per innescare il lettore droplet e renderlo pronto per l&#39;analisi ddPCR. </li><li> Caricare la piastra nel lettore droplet e cliccare su &quot;start&quot;. Il lettore gocciolina aspira ogni campione, singulates le goccioline, e torrenti in fila davanti a un rilevatore a 2 colori. Il rivelatore legge le goccioline enumerare campioni positivi e negativi. </li><li> Quando la lettura delle gocce, aprire la porta e rimuovere il supporto targa dall&#39;unità. Rimuovere la piastra PCR a 96 pozzetti dal supporto e scartarla. </li><li> Per una corretta manutenzione, sostituire l&#39;olio lettore di droplet e svuotare il contenitore di raccolta in base alle esigenze. Aggiungere 50 ml di candeggina al 10% per la bottiglia degli scarti per evitare la crescita microbica. </li></ol> 2.4 DNA mutazione del profilo (come da protocollo consigliato dal produttore) Nota: le goccioline PCR-positivi e PCR-negativi sono contate per fornire quantific assolutozione di destinazione mutazioni BRAF V600E DNA in forma digitale, utilizzando software di analisi dei dati. <ol><li> Fare clic su Imposta per inserire le informazioni relative ai campioni, saggi, ed esperimenti. </li><li> Nella finestra di installazione, caricare una piastra (filename.qlp), quindi fare clic su Analizza per aprire e analizzare i dati. L&#39;interfaccia di analisi dei dati è suddiviso in tre finestre: Tabella Risultati, ben Selector e dati oggetto di trattamento / grafico di visualizzazione. </li><li> Nella finestra dati elaborati, i dati di concentrazione per ogni target appaiono nei pozzetti nella mappa piastra e sono riportati nella tabella dei risultati. Clicca Concentrazione per visualizzare i dati Terreni di concentramento. </li></ol>

<ol><li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li>
<li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li>
<li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras%2FRaf%2F+MEK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+anti-cancer+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li>
<li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li>
<li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline%2C+%27definetherain%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological+methods%22%5BJournal%5D)">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li>
<li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943(2013).</li>
<li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li>
<li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+using+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li>
<li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li>
<li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+detection+and+quantification%22%5BJournal%5D)">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li>
<li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li>
<li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li>
<li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li>
</ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim e Young Kim Deug sono dipendenti di ABION CRO.

Qui, si evidenzia l&#39;applicabilità di ddPCR e isolamento del DNA da campioni di linee cellulari normali di riferimento FFPE una specifica valutazione mutazione del gene. In questo studio, TPS DNA metodo di isolamento automatico viene utilizzato, che può essere facilmente adattato, automatizzato, e può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo per esperimenti su scala più ampia e bassa variabilità. Uno dei limiti di isolamento del DNA nel presente lavoro è che ogni campione FFPE è unico, e va...

L&#39;accumulo di mutazioni genetiche nei principali geni regolatori altera programmazione cellula normale come la proliferazione cellulare, il differenziamento e la sopravvivenza, che porta al cancro 1. La chinasi RAS-RAF-MAP media le risposte cellulari ai segnali di crescita. Mutazioni BRAF oncogeno possono derivare da mutazioni del driver nel gene BRAF, che possono causare il BRAF oncoprotein a diventare iperattiva 2. Le mutazioni nel gene BRAF anche tradursi nella segnalazione a valle iperattiva tramite MEK e ERK 3, che, a sua volta, porta alla crescita eccessiva delle cellule e la proliferazione indipendentemente da fattore di crescita-mediata regolazione 4-6. Sono disponibili diversi strumenti per la mutazione del DNA profiling, come ad esempio in tempo reale mutazioni BRAF V600E quantitativi fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) di riferimento standard di linee cellulari di ddPCR. ddPCR è un metodo basato sulla PCR per la quantificazione assolutaoffrendo una maggiore precisione rispetto ai tradizionali quantitativa real-time PCR (qPCR) 7,8. ddPCR fornisce anche una maggiore potenza e precisione la risoluzione per la rilevazione di mutazioni rare nei modelli di DNA, consentendo la ricerca sul cancro più informativo e la diagnosi 9. Ulteriori vantaggi di ddPCR oltre qPCR convenzionale sono la sua maggiore sensibilità e precisione quando si studia il numero di copie a basso modello 10-12. Qui, un protocollo per estrarre automaticamente DNA da linee cellulari normali riferimento FFPE, seguiti da determinare la presenza o l&#39;assenza di mutazioni BRAFV600E da ddPCR è dimostrata. L&#39;utilizzo di software per l&#39;analisi dei dati e una rappresentazione grafica dei risultati sono anche descritti. L&#39;intera procedura è relativamente semplice e totalmente dipende dal numero di campioni da profilati e il numero delle macchine convenzionali PCR e ddPCR disponibili. Il protocollo che segue descrive le procedure standard per la BR<html> AF-V600E positivi di riferimento FFPE linee di cellule normali (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) viene eseguita in uno strumento completamente automatico che utilizza il protocollo Tissue preparazione sistema (TPS). Successivamente, i campioni di DNA isolati vengono analizzati per la presenza di mutazioni BRAF V600E utilizzando il sistema ddPCR. Analisi mirata mutazione viene eseguita dopo tutti i campioni sono stati profilato e i dati sono stati caricati nel software di analisi dati. A seconda del numero di campioni / gruppi studiati, analisi dei dati può richiedere da una a diverse ore. Il componente sperimentale della metodologia richiede accuratezza nella gestione <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="L&#39;isolamento degli acidi nucleici da lievito, un video JOVE Scienze della Formazione spiegare di più sul contesto di RNA">DNA</a> erological Pipette e pipette, un video JOVE Scienze della Formazione spiegare di più sul contesto di pipettaggio &quot;&gt; pipettaggio in 96 pozzetti, mentre l&#39;analisi dei dati viene eseguita utilizzando il software.

<table><tbody><tr><td>Hamilton MICROLAB STARlet IVD strumento</td><td>Siemens</td><td>10701001</td><td>Strumento automatizzato per l'isolamento del DNA</td></tr><tr><td>QX200 Generatore di gocce&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>772BR1119</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lettore di gocce</td><td>Bio-Rad</td><td>771BR1497</td><td></td></tr><tr><td>Macchina PCR convenzionale in grado di regolare</td><td></td> il tempo di rampa <td>621BR17718</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Sigillante per piastre PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>770BR1575</td><td></td></tr><tr><td>Software QuantaSoft</td> Kit di isolamento del DNA <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Reagenti per la preparazione dei tessuti Scatola 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632398</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Reagenti per la preparazione dei tessuti Scatola 1&nbsp;</td><td>Suggerimenti Siemens</td><td>10632399</td><td></td></tr><tr><td>CO-RE</td><td></td> Analisi mutazionale ddPCR Siemens <td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3010</td><td></td></tr><tr><td>Cartuccia DG8 a concentrazione 2X&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-4008</td><td></td></tr><tr><td>Olio generatore di goccioline</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3006</td><td></td></tr><tr><td>Olio lettore di gocce</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

impiegando digitale droplet pcr per identificare mutazioni braf v600e in inclusi in paraffina fissati in formalina linee cella di riferimento standard

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR è un metodo PCR altamente sensibile che utilizza un sistema di emulsione acqua-olio. Utilizzando un generatore di goccioline, un campione di acido nucleico estratto viene suddiviso in ~20.000 goccioline di acqua in olio di dimensioni nanometriche e l'amplificazione PCR avviene in singole goccioline. L'approccio della ddPCR consiste nell'identificare mutazioni di sequenza, alterazioni del numero di copie e selezionare riarrangiamenti strutturali che coinvolgono geni mirati. Qui, dimostriamo l'uso della ddPCR come potente tecnica per quantificare con precisione le rare mutazioni di BRAF V600E nelle linee cellulari standard di riferimento FFPE, che è utile per identificare gli individui con cancro. In conclusione, la tecnica ddPCR offre il potenziale per profilare con precisione le mutazioni rare specifiche in diversi geni in vari tipi di campioni FFPE.

Per la nostra analisi ddPCR, abbiamo studiato le linee di cellule normali di riferimento mutazione FFPE BRAFV600E. Il lettore droplet si connette a un software portatile di analisi dei dati del computer in esecuzione. Ogni singola goccia viene definita sulla base dell&#39;ampiezza fluorescente come positivo o negativo. Il software fornito dal produttore permette anche un taglio definito dall&#39;utente da immettere per definire la soglia tra le goccioline positivi e negativi. Il numero di goccioline positivi e ...

L&#39;obiettivo di questo video è quello di dimostrare come eseguire l&#39;estrazione del DNA automatizzato da inclusi in paraffina linee cellulari fissate in formalina (FFPE) di riferimento standard e delle gocce digitali PCR (ddPCR) analisi per individuare mutazioni rare in un ambiente clinico. Rilevamento mutazioni nei campioni FFPE dimostra l&#39;utilità clinica di ddPCR in campioni FFPE.

Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è isolare il DNA genomico umano da linee cellulari di riferimento standard fissate in formalina e incluse in paraffina, utilizzando un sistema di preparazione dei tessuti, seguito dall'analisi delle mutazioni BRAF V600E nel DNA genomico mediante digital droplet PCR. La ddPCR può aiutare a rispondere a domande fondamentali nell'oncologia molecolare, come la presenza e l'abbondanza di mutazioni della sequenza BRAF e la quantificazione degli acidi nucleici a bassi numeri di copie del template. Sebbene questo metodo venga qui dimostrato su linee cellulari standard, può essere applicato anche ad altri campioni biologici, a condizione che si ottimizzino le condizioni per l'isolamento del DNA di interesse.Questo sistema di preparazione dei tessuti può essere utilizzato per isolare fino a 48 campioni di DNA genomico umano privi di contaminanti entro quattro ore, rispetto ad altre procedure manuali. Questo sistema è relativamente costoso per la preparazione a causa dell'uso di microsfere magnetiche. Tuttavia, è più sicuro e produce frammenti di alta qualità. La dimostrazione verrà effettuata da un ricercatore e da un tecnico del nostro laboratorio.L'estrazione del DNA verrà eseguita in uno strumento automatizzato per l'isolamento del DNA utilizzando il sistema di preparazione dei tessuti o protocollo TPS. Iniziare accendendo lo strumento e il computer. Aprire il software di controllo della corsa ed inserire un vassoio di auto-caricamento nell'area di caricamento della piattaforma TPS.Successivamente, distribuire i reagenti nei rispettivi contenitori come mostrato in questa figura e posizionare i quattro campioni nel portacampioni. Assicurarsi un'adeguata miscelazione del buffer di lisi e dei buffer di lavaggio ribaltandoli da tre a cinque volte, quindi caricarli nei contenitori corrispondenti della colonna quattro. Dopo aver ribaltato qualche volta o aver effettuato una leggera agitazione con vortex, caricare il buffer di eluizione, le perle magnetiche e il buffer FFPE nei piccoli contenitori della colonna cinque, lasciando due alloggiamenti vuoti nelle posizioni indicate.Caricare una piastra deep well da due millilitri sul supporto per piastre. Prima di avviare un'analisi, chiudere tutti i tubi e i serbatoi dei reagenti con tappi UNC. Verificare che nella bottiglia per i rifiuti liquidi sia disponibile capacità sufficiente e che la bottiglia per i rifiuti solidi sia vuota e foderata con un sacchetto per rifiuti biologici.Verificare che la piastra di espulsione della punta sia centrata nell'assiembo dei rifiuti. Chiudere il coperchio anteriore, avviare il software e aprire il NA prep main ML starlet. Eseguire il file med.Fare clic su Avvia. Lo stato dello strumento passerà da inattivo a in esecuzione. Inserire il numero di campioni per questa esecuzione.Scegliere il metodo desiderato per questa esecuzione. Inserire la posizione della prima punta ad alto volume, selezionandone una. Se tutti i vassoi sono pieni, inserire la posizione della prima punta a volume standard, selezionandone una.Se tutti i vassoi sono pieni, lo strumento eseguirà i passaggi automatizzati senza intervento dell'utente. Qui viene mostrato un flusso di lavoro dettagliato per evitare contaminazioni. Seguire le precauzioni standard, come indossare guanti e utilizzare una cappa PCR pulita.Pipette pulite e tubi con bassa ritenzione proteica. Assemblare le miscele di reazione in strip di tubi PCR, scongelare e portare i componenti della reazione a temperatura ambiente. Il campione di DNA genomico umano per l'analisi con goccioline digitali, PCR o D-D-P-C-R deve avere una concentrazione minima di 3,3 nanogrammi per microlitro.Preparare le reazioni di PCR. Combinare la miscela superiore X-D-D-P-C-R 20x, gli iniziatori forward e reverse e la sonda con ciascun campione di DNA purificato e portare a un volume finale di 20 microlitri con acqua distillata. Vortexare accuratamente la miscela per garantire un'omogeneità uniforme e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto sul fondo dei tubi prima della distribuzione.Utilizzare il generatore di goccioline seguendo il protocollo raccomandato dal produttore. Inserire la cartuccia nel supporto con la tacca sulla cartuccia posizionata nell'angolo superiore sinistro del supporto. Aggiungere 20 microlitri di mix di reazione contenente i campioni nei pozzetti centrali e 70 microlitri di olio generatore nei pozzetti inferiori.Collegare la guarnizione sulla parte superiore della cartuccia. Assicurarsi che la guarnizione sia saldamente agganciata alle due estremità del supporto. In caso contrario, non si raggiungerà la pressione sufficiente per la generazione delle goccioline.Aprire il generatore di gocce premendo il pulsante verde nella parte superiore dello strumento. Inserire la cartuccia quando il supporto è nella posizione corretta. Sia l'alimentazione che l'indicatore del supporto sono verdi.Premere nuovamente il pulsante superiore dello strumento per chiudere la porta e avviare la generazione delle goccioline. Dopo 10 secondi, la spia indicatrice delle goccioline lampeggia in verde per indicare che la generazione delle goccioline è in corso. Al termine della generazione delle goccioline, tutte e tre le spie indicatrici diventano verdi fisse.Aprire la porta premendo il pulsante ed estrarre il supporto dall'unità. Rimuovere la guarnizione monouso dal supporto e smaltirla. Si noti che le pozze superiori della cartuccia contengono le goccioline, mentre le pozze centrali e inferiori sono quasi vuote, con una piccola quantità di olio residuo dopo la generazione delle goccioline.Preparare l'amplificazione mediante PCR convenzionale. Per ogni campione, prelevare 40 microlitri del contenuto delle gocce dal pozzetto superiore delle cartucce e trasferirli in un singolo pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti raccomandata, come indicato nel protocollo dello strumento del produttore; aspirare lentamente e delicatamente la goccia per minimizzare la rottura delle gocce durante il trasferimento. Immediatamente dopo il trasferimento delle gocce, la piastra PCR deve essere sigillata per evitare l'evaporazione.Impostare la temperatura del sigillatore per piastre a 180 gradi Celsius e il tempo a cinque secondi. Premere la freccia per aprire la porta del vassoio. Posizionare il blocco di supporto sul vassoio con il lato da 96 pozzetti rivolto verso l'alto.Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul blocco di supporto e assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra siano allineati con il coperchio del blocco di supporto. La piastra a 96 pozzetti con un foglio di sigillo in alluminio. Utilizzare sigilli in alluminio compatibili con un sigillatore per piastre PCR e con gli aghi del lettore di goccioline. Una volta che la piastra a 96 pozzetti è fissata saldamente sul blocco di supporto ed è coperta con un sigillo in alluminio fotopolimerizzabile.Toccare il pulsante di sigillatura. Il vassoio si chiuderà e verrà avviato il riscaldamento del soffitto. Al termine della sigillatura termica, la porta si aprirà automaticamente.Rimuovere la piastra dal blocco termico e quindi rimuovere il blocco termico. Assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra siano sigillati verificando la presenza delle depressioni. Le pellicole di alluminio sono chiaramente visibili sopra ciascun pozzetto.Dopo la sigillatura, la piastra è pronta per il termociclaggio. Eseguire l'amplificazione PCR convenzionale seguendo i parametri dettagliati nel testo del protocollo. Al termine dell'amplificazione PCR della sequenza di acido nucleico bersaglio nelle goccioline.Il passo successivo consiste nell'analizzare singolarmente ogni gocciolina utilizzando un sistema di rilevamento a due colori. In genere, lo strumento lettore di goccioline è impostato per rilevare i fluorocromi marcatore FAM e VIC. Fare clic su "flush system" per preparare il lettore di goccioline e renderlo pronto per l'analisi D-D-P-C-R.Caricare la piastra nel lettore di goccioline e fare clic su avvio. Al termine della lettura delle goccioline, aprire lo sportello ed estrarre il supporto della piastra dall'unità. Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dal supporto e smaltirla.Eseguire successivamente il profiling delle mutazioni del DNA utilizzando un software di analisi dei dati, come descritto nel testo del protocollo. In quest'analisi D-D-P-C-R, sono state studiate le mutazioni RAF V 600 E. La fluorescenza è stata rilevata ed elaborata in un grafico a dispersione bidimensionale.È stato utilizzato un software personalizzato per tracciare i gate appropriati e conteggiare il numero di goccioline all'interno di ciascun gate. Le goccioline rappresentate da punti blu sopra la linea di cutoff rosa per tutti i campioni sono positive. Per le goccioline di RAF mutato V600E e di tipo selvaggio BRA, i punti verdi rappresentano entrambe le condizioni nei due grafici.I puntini grigi nella parte inferiore sono considerati come fondo di fluorescenza. Le frequenze alleliche mutanti complessive sono state quindi calcolate in base alle percentuali relative delle concentrazioni del template di tipo selvaggio bra e della mutazione brav V 600 E rilevate in un semestre. L'analisi HR individuale può essere eseguita entro quattro ore seguendo questa procedura.Campioni di altro tipo, come un'analisi liquida PPT, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio il monitoraggio della progressione del cancro dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica complementare, permettendo di esplorare diverse modalità di rilevamento delle mutazioni nel settore dell'oncologia molecolare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il sistema di preparazione del tessuto e la P-C-R-S-A a goccioline digitali per il rilevamento specifico di una mutazione puntiforme del DNA.

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Viene descritto un sistema integrato per il sequenziamento mirato di nuova generazione di campioni oncologici. Questo sistema multipiattaforma è ottimizzato per biopsie tumorali di bassa qualità e bassa quantità, accoglie bassi input di DNA, include controlli multivariante ben caratterizzati e presenta un nuovo chiamante di varianti informato da misure quantitative di controllo di qualità pre-analitiche.

Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

La PCR bloccante di tipo selvatico seguita dal sequenziamento diretto offre un metodo di rilevamento altamente sensibile per le mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni.

Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

Rilevamento di acido ribonucleico (cRNA) dal sangue di circolazione è un bisogno insoddisfatto in diagnostica clinica. Qui descriviamo i metodi che caratterizzano cRNA dai malati di cancro del polmone non a piccole cellule usando reazione a catena della polimerasi digitale sensibile e specifico. Le prove di soddisfano requisiti di progettazione per individuare varianti di fusione entro 72 ore.

Un emoderivato di Test per la rilevazione di ROS1 e RET trascrizioni di fusione da acido ribonucleico usando reazione a catena della polimerasi digitale di circolazione

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le alterazioni genetiche multiple di una regione di destinazione in una singola reazione usando drop-off ddPCR e un paio di idrolisi sonde uniche.

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Qui, descriviamo un in situ di ibridazione test che consente la rivelazione sensibile e specifica delle sequenze più breve 50 nucleotidi con risoluzione del singolo-nucleotide a livello di singola cellula. L'analisi, che possono essere eseguita manualmente o automaticamente, può abilitare la visualizzazione delle varianti di splicing, brevi sequenze e mutazioni all'interno del contesto del tessuto.

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Nel presente protocollo, dimostriamo come visualizzare la resezione finale a doppio filamento del DNA durante la fase S/ G2 del ciclo cellulare utilizzando un metodo basato sull'immunofluorescenza.

Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare

Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile per visualizzare l'amplificazione genica in campioni di tessuto inclusi in paraffina (FFPE) fissati in formalina.

Rilevamento robusto dell'amplificazione genica in campioni inclusi in paraffina fissati in formalina mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Identificazione dei meccanismi alla base danno muscolare è cruciale. Qui vi presentiamo la tecnica istologica per la preparazione inclusi in paraffina e congelati sezioni dei muscoli toracici Drosophila. Questo permette l'analisi della morfologia muscolare e la localizzazione di proteine ​​e altri componenti delle cellule muscolari.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

Questo video dimostra il protocollo per l'estrazione del DNA da fissati in formalina materiale in paraffina. Questa è una di più giorni procedura di sezioni di tessuto in cui sono deparaffinate con xilene, reidratato con etanolo e trattati con proteinasi K per purificare e isolare il DNA per le successive analisi del gene-specifici o genoma.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Scopri l'estrazione automatizzata di DNA da campioni FFPE e la rilevazione delle mutazioni BRAF V600E mediante digital droplet PCR. Questo metodo migliora l'efficienza clinica e riduce i rischi di contaminazione.

Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard (Video) | JoVE Journal

Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

Esplora altri video