Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

L'obiettivo generale di questo esperimento è isolare il DNA genomico umano da linee cellulari standard di riferimento formali e fisse incluse in paraffina utilizzando un sistema di preparazione tissutale, seguito dall'analisi delle mutazioni bra V 600 E nel DNA genomico utilizzando goccioline digitali. P-C-R-D-D-P-C-R Può aiutare a rispondere a domande chiave in oncologia molecolare, come la presenza e l'abbondanza della mutazione della sequenza AR e la quantificazione dell'acido nucleico a basso numero di copie del modello. Sebbene questo metodo sia stato dimostrato nell'AEP a partire dalle linee cellulari standard, può essere utilizzato anche in altri campioni biologici solo per assicurarsi di ottimizzare le condizioni per isolare il DNA di interesse.

Questo sistema di preparazione dei tessuti può essere utilizzato per isolare fino a 48 campioni di DNA genomico umano privo di contaminanti entro quattro ore rispetto ad altre procedure manuali. Questo sistema è un po' costoso per la preparazione a causa dell'uso di cordoni magnetici. Tuttavia, è più sicuro e prodotto e cleage di alta qualità A dimostrare la pressione sarà ssu A e un tecnico del nostro laboratorio.

L'estrazione del DNA verrà eseguita in uno strumento di isolamento del DNA completamente automatizzato utilizzando il sistema di preparazione dei tessuti o il protocollo TPS. Inizia accendendo lo strumento e il computer. Aprire il software di controllo della corsa e inserire un vassoio di caricamento automatico nell'area di caricamento del piatto TPS.

Quindi, erogare i reagenti nelle depressioni corrispondenti, come mostrato in questa figura, posizionare i quattro campioni nel rack portacampioni. Garantire la corretta miscelazione del tampone di lisi e dei tamponi di lavaggio capovolgendoli da tre a cinque volte e quindi caricandoli nei rispettivi canali della colonna quattro. Dopo l'inversione un paio di volte o un leggero vortice, caricare le perle magnetiche del tampone eluciano e il tampone FFPE nelle piccole depressioni della colonna cinque, lasciando due fessure vuote dove indicato.

Caricare una piastra a pozzetti profonda due millilitri sul portapiatti. Prima di iniziare una corsa, l'UNC tappare tutte le provette e le vasche dei reagenti. Verificare che la bottiglia per rifiuti liquidi abbia una capacità sufficiente e che la bottiglia per rifiuti solidi sia vuota e rivestita con un sacchetto per rischi biologici.

Verificare che la piastra di espulsione dell'ugello sia centrata nel gruppo di scarto. Chiudere il coperchio anteriore, avviare il software, aprire la stellina ML principale NA prep. Fai il file medico.

Fare clic su Start. Lo stato dello strumento passerà da inattivo a in funzione. Immettere il numero di campioni per l'esecuzione.

Scegli il metodo desiderato per questa corsa. Inserire la posizione della prima punta ad alto volume, selezionandone una. Se tutti i vassoi sono pieni, inserire la posizione del primo ugello del volume standard selezionandone uno.

Se tutti i vassoi sono pieni, lo strumento eseguirà le fasi automatizzate senza l'intervento dell'utente. Qui viene mostrato un flusso di lavoro dettagliato per evitare contaminazioni. Seguire le precauzioni standard come indossare guanti e utilizzare un cappuccio PCR pulito.

Pipette pulite e provette a basso legame proteico. Assemblare le miscele di reazione in strisce di provette per PCR, scongelare ed equilibrare i componenti di reazione a temperatura ambiente. Il campione di DNA genomico umano per l'analisi digitale delle goccioline, PCR o D-D-P-C-R deve avere una concentrazione minima di 3,3 nanogrammi per microlitro.

Preparare le reazioni alla PCR. Combinare i due X-D-D-P-C-R super mix 20 primer diretti e inversi e sondare con ogni campione di DNA purificato e preparare fino a 20 microlitri con acqua distillata. Agitare accuratamente la miscela per garantire l'omogeneità e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto sul fondo delle provette prima dell'erogazione.

Utilizzare il generatore di gocce secondo il protocollo consigliato dal produttore. Inserire la cartuccia nel supporto con una tacca nella cartuccia posizionata sul lato superiore sinistro del supporto. Aggiungere 20 microlitri di miscela di reazione contenente campioni nei pozzetti centrali e 70 microlitri di olio generatore nei pozzetti inferiori.

Fissare la guarnizione sulla parte superiore della cartuccia. Assicurarsi che la guarnizione sia agganciata saldamente su entrambe le estremità del supporto. In caso contrario, non si otterrà una pressione sufficiente per la generazione di goccioline.

Aprire il generatore di gocce premendo il pulsante verde sulla parte superiore dello strumento. Inserire la cartuccia quando il supporto è nella posizione corretta. Sia l'indicatore luminoso di alimentazione che quello del supporto sono verdi.

Premere nuovamente il pulsante superiore dello strumento per chiudere lo sportello e avviare la generazione di goccioline. La spia delle goccioline lampeggia in verde dopo 10 secondi per indicare che è in corso la generazione delle goccioline. Al termine della generazione delle gocce, tutte e tre le spie diventeranno verdi fisse.

Aprire la porta premendo il pulsante e rimuovere il supporto dall'unità. Rimuovere la guarnizione monouso dal supporto e gettarla. Si noti che i pozzetti superiori della cartuccia contengono le goccioline e i pozzi centrale e inferiore sono quasi vuoti con una piccola quantità di olio residuo dopo la generazione di goccioline.

Prepararsi per l'amplificazione PCR convenzionale. Per ogni tubo di campionamento aveva 40 microlitri del contenuto di goccioline dal pozzetto superiore delle cartucce in un singolo pozzetto di una piastra PCR da 96 pozzetti raccomandata come indicato nel protocollo dello strumento del produttore, aspirare la gocciolina lentamente e delicatamente per ridurre al minimo il taglio delle goccioline durante i trasferimenti. Immediatamente dopo il trasferimento delle goccioline, la piastra PCR deve essere sigillata per evitare l'evaporazione.

Impostare la temperatura della sigillatrice per lastre su 180 gradi Celsius e il tempo su cinque secondi. Toccare la freccia per aprire lo sportello del vassoio. Posizionare il blocco di supporto sul vassoio con il lato a 96 pozzetti rivolto verso l'alto.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul blocco di supporto e assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra siano allineati con il coperchio del blocco di supporto. La piastra a 96 pozzetti con un foglio di sigillo di alluminio Utilizzare guarnizioni per piastre di alluminio parabole compatibili con un sigillante per piastre PCR e gli aghi nel lettore di gocce. Una volta che la piastra a 96 pozzetti è fissata sul blocco di supporto e coperta con un foglio di tenuta polimerizzabile.

Toccare il pulsante del sigillo. Il vassoio si chiuderà e si avvierà il soffitto riscaldante. Al termine della termosaldatura, la porta si aprirà automaticamente.

Rimuovere la piastra dal blocco termico, quindi rimuovere il blocco termico. Assicurarsi che tutti i pozzetti della piastra siano sigillati controllando le depressioni. La lamina è facilmente visibile su ogni pozzetto.

Una volta sigillata, la piastra è pronta per il ciclo termico. Eseguire l'amplificazione PCR convenzionale seguendo i parametri dettagliati nel testo del protocollo. Una volta completata l'amplificazione PCR del bersaglio dell'acido nucleico nelle goccioline.

Il passo successivo consiste nell'analizzare ogni gocciolina singolarmente utilizzando un sistema di rilevamento a due colori. Tipicamente, lo strumento lettore di gocce è impostato per rilevare i fluoro quattro reporter FAM e VIC. Fare clic sul sistema di lavaggio per adescare il lettore di gocce e renderlo pronto per l'analisi D-D-P-C-R.

Caricare la piastra nel lettore di gocce e fare clic su start. Al termine della lettura delle gocce, aprire lo sportello e rimuovere il portatarga dall'unità. Togliere. Rimuovere la piastra a muro 96 dal supporto e gettarla.

Successivamente eseguire la profilazione delle mutazioni del DNA utilizzando un software di analisi dei dati come descritto nel testo del protocollo. In questa analisi D-D-P-C-R, sono state studiate le mutazioni RAF V 600 E. La fluorescenza è stata rilevata ed elaborata in un grafico a dispersione bidimensionale.

È stato utilizzato un software personalizzato per disegnare i cancelli appropriati ed è stato contato il numero di goccioline all'interno di ciascun cancello. Le goccioline rappresentate da punti blu sopra la linea di demarcazione rosa per tutti i campioni sono positive. Per RAF V 600 E mutato, le goccioline del reggiseno di tipo selvaggio sono rappresentate da punti verdi in entrambi i grafici.

I punti grigi nella parte inferiore sono considerati come lo sfondo a fluorescenza. Le frequenze complessive degli alleli mutanti sono state quindi calcolate sulla base delle percentuali relative di concentrazioni di bra wild type e brav V 600 E template rilevate in un semestre. La frequenza cardiaca con l'analisi individuale può essere eseguita entro quattro ore successive a questa postura.

Altri campioni come una biopsia liquida PPT possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come il monitoraggio della progressione del cancro dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica di accompagnamento per esplorare vari rilevamenti di mutazioni nel campo dell'oncologia molecolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il sistema di preparazione dei tessuti e la gocciolina digitale P-C-R-S-A per un punto specifico, il rilevamento delle mutazioni del DNA.