Modellazione Encefalopatia di prematurità Utilizzando prenatale ipossia-ischemia con Lipopolisaccaride intra-amniotico in ratti

L'obiettivo generale di questa procedura chirurgica è quello di fornire un modello riproducibile di lesione cerebrale associata a parto estremamente prematuro, attraverso l'induzione di ipossia sistemica transitoria, ischemia e infiammazione intraamniotica in utero per ricapitolare, insufficienza placentare e corioamnioite nei ratti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla patogenesi delle lesioni cerebrali perinatali che derivano dai processi intrauterini, facilitando lo sviluppo di strategie terapeutiche dirette. Il vantaggio principale di questa tecnica è che induce la lesione sistemica che imita gli insulti intrauterini sia da infezione che da ipossia, l'ischemia produce deficit neurologici funzionali nel ratto maturo.

Questo modello è particolarmente adatto a sezionare i meccanismi di lesione legati all'infiammazione. Poiché l'ipossia, l'ischemia e gli stimoli infettivi possono essere testati singolarmente o come lesione combinata, a dimostrare la procedura sarà Lindsey Chan, un tecnico del nostro laboratorio. Prima di iniziare la procedura, utilizzare un tagliacapelli per piccoli animali per rimuovere tutti i peli dalla regione addominale inferiore di una giornata embrionale.

18 ratto gravido in uno schema rettangolare, facendo attenzione a non intaccare i capezzoli o a generare eruzioni cutanee da rasoio. Successivamente, utilizzando tamponi di cotone sterili, strofinare la pelle con tre applicazioni alternate di iodio povidone ed etanolo al 70%. Quando la pelle è asciutta, confermare la profondità appropriata dell'anestesia con la punta del piede, pizzicare e drappeggiare l'animale.

Quindi utilizzare un bisturi per praticare un'incisione della linea mediana di tre centimetri nell'addome dell'animale, seguita da una dissezione smussata dello strato cutaneo dalla fascia addominale con le forbici. Usando pinze e forbici chirurgiche. Sollevare lo strato della fascia addominale e praticare un'incisione attraverso il gomito lineare avascolare.

Quando la cavità peritoneale è esposta, posizionare una garza chirurgica all'esterno dell'incisione e inumidire la garza con soluzione fisiologica sterile. Quindi, utilizzando una pinza smussata e una pressione esterna sull'addome, rimuovere delicatamente le corna uterine dalla cavità peritoneale e disporre le corna sulla garza inumidita. Avendo cura di evitare l'impigliamento e il contatto con l'intestino, utilizzare solo il tessuto muscolare tra le singole sacche amniotiche per sistemare i feti.

Quindi, utilizzando la dissezione smussata, esporre e isolare le quattro arterie uterine. Fare attenzione a non danneggiare i vasi materni quando le arterie sono state isolate. Posizionare una clip per aneurisma di ratto calibro 30 su ciascun vaso Prima di applicare le clip, è importante assicurarsi che tutto il tessuto circostante sia completamente chiaro.

Quando si posizionano le clip, fissarle con la pinza smussata e poi posizionarle in parallelo. Osservare la cessazione del polso è fondamentale per garantire la completa ischemia da ipossia Quando tutte le clip sono state posizionate. Confermare la cessazione delle pulsazioni prossimali e distali e l'oscuramento dei vasi uterini, anche nelle singole placenta.

Quindi coprire l'intero campo chirurgico con una garza e irrigare il tessuto con soluzione fisiologica sterile. Ogni 10 minuti per un'ora dopo i 60 minuti, togliete la garza e irrigate nuovamente il campo. Quando le corna e i vasi uterini sono adeguatamente inumiditi, utilizzare una pinza per rimuovere delicatamente ogni clip dell'aneurisma, facendo attenzione a non causare traumi al vaso e a mantenere l'integrità del tessuto.

Quindi irrigare accuratamente le corna e il campo. Un'ultima volta, avendo cura di rimuovere eventuali fili di garza sparsi dalle sacche amniotiche. Per trattare i feti con LPS, utilizzare una pinza smussata per stabilizzare e ruotare ogni sacco amniotico in modo che la base di ogni singolo sacco amniotico sia visibile.

Quindi caricare una siringa da insulina ultra fine da 0,3 millilitri con un ago da otto millimetri calibro 31 con soluzione LPS e iniettare 100 microlitri di soluzione appena anteriormente a ciascuna placca placentare. Quando l'ago viene rimosso, applicare una pressione diretta sul sacco amniotico per arrestare eventuali perdite di liquido. L'inserimento di un ago ultrasottile da 31 gauge alla base del sacco amniotico è fondamentale per la corretta erogazione dell'LPS senza consentire la fuoriuscita del liquido amniotico.

Dopo aver irrigato le corna uterine tre volte con soluzione fisiologica sterile, utilizzare una pinza per riportare le corna nella cavità peritoneale. Quindi utilizzare una sutura di seta a tre per riapprossimare i bordi dello strato fasciale muscolare senza suturare dentro o attraverso un sacco, seguita dalla chiusura della pelle con un'altra sutura di seta 3.0. Quindi, utilizzare un ago calibro 26 per via sottocutanea.

Iniettare un millilitro di bupivacaina allo 0,125% attorno ai bordi della ferita. Asciugare il ratto con un asciugamano se necessario, iniettare 0,1 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina sulla nuca. Metti l'animale in una gabbia domestica pulita con monitoraggio fino a quando non si riprende completamente.

A seguito di ipossia sistemica transitoria, ischemia e somministrazione di LPS al giorno 18 embrionale, come appena dimostrato, la colorazione con het ed eosina rivela significative anomalie istopatologiche sia nella placenta che nel cervello. Infatti, la placenta esaminata nei giorni embrionali 19 e 21 è grossolanamente emessa con micro emorragia e necrosi in tutta la decidua e il labirinto. Si osservano anche infiltrati infiammatori significativi e aumento della vascolarizzazione.

Ulteriori cervelli esaminati il secondo giorno postnatale rivelano magaly ventricolare, così come la perdita di neuroni della sostanza bianca e della sottoplacca rispetto all'ipossia sistemica transitoria, l'ischemia e l'LPS hanno anche diminuito significativamente l'espressione della proteina del cotrasportatore del cloruro di potassio due, un cotrasportatore del cloruro centrale per lo sviluppo dell'inibizione GABAergica nella corteccia al giorno postnatale 15, che è coerente con l'alterata sovraregolazione dello sviluppo osservata durante il periodo postnatale critico della maturazione del circuito. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una solida comprensione di come eseguire questo intervento chirurgico nei ratti gravidi e di come indurre l'ischemia da ipossia transitoria prenatale tramite occlusione dell'arteria uterina con infiammazione in utero tramite iniezione intraamniotica di soluzione lipopolisaccaridica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 90 minuti se eseguita correttamente.