Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un

L'obiettivo generale del seguente esperimento è monitorare nel tempo la disregolazione del calcio nel reticolo endoplasmatico avvalendosi di una proteina reporter secreta. Questo risultato si ottiene mediante trasgenesi mediata da vettore virale del tessuto bersaglio, in particolare il fegato. In questo esempio, impiegando il reporter Gai luciferasi circa, si raccoglie un fluido biologico successivo, come il sangue, al fine di misurare la quantità di circa rilasciata dal tessuto; successivamente, il substrato della luciferasi viene aggiunto ai campioni di plasma e la luminescenza viene misurata per determinare la carenza di calcio nel reticolo endoplasmatico.

I risultati mostrano una disregolazione del calcio nel reticolo endoplasmatico, indicata da livelli aumentati di C camp plasmatico. L'omeostasi del calcio nel reticolo endoplasmatico può essere monitorata per periodi prolungati mediante campionamenti ripetuti di piccoli volumi di fluidi biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come coloranti per il calcio a bassa affinità o indicatori genetamente codificati per il calcio, è che l'omeostasi del calcio nel reticolo endoplasmatico può essere monitorata in vivo nel tempo attraverso una procedura minimamente invasiva. Esistono due possibili applicazioni terapeutiche per questa tecnica.

Il primo approccio consiste nel ricercare farmaci in grado di mantenere o ripristinare l'omeostasi del calcio nel reticolo endoplasmatico allo stato fisiologico normale. Il secondo approccio prevede la modifica di proteine terapeutiche per trasformarle in AMP terapeutici, la cui secrezione avviene in risposta alla carenza di calcio nel reticolo endoplasmatico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul malfunzionamento dell'omeostasi del calcio nel reticolo endoplasmatico nel fegato.

È inoltre possibile applicarlo ad altri sistemi organici come cervello, cuore, muscolo o pancreas. Dopo aver anestetizzato un ratto sprat dolly, secondo il protocollo indicato nel testo, applicare un unguento oftalmico ed eseguire una compressione sulla coda per verificare l'anestesia, quindi rasare la regione dell'addome appena al di sotto delle costole fino alla zona addominale centrale e detergere l'area chirurgica per tre volte, alternando Betadine ed etanolo al 70%. Successivamente, posizionare il ratto in posizione supina su un'area chirurgica sterile e coprire con camici chirurgici sterili, quindi diluire un campione di gluc a v alla concentrazione ottimizzata dall'utente.

In questo caso, abbiamo utilizzato 7,6 volte 10 alla nona genomi virali per millilitro e abbiamo miscelato capovolgendo il tubo. Quindi, pipettare 105 microlitri dell'A a V diluito in una piastra sterile e utilizzare un ago da 30 gauge per raccogliere il virus in una siringa. Contrassegnare il sito di incisione target per esporre il fegato da iniettare, utilizzando un bisturi.

Eseguire un'incisione orizzontale lunga circa due o tre centimetri al di sotto della gabbia toracica. Procedere con una dissezione ottusa per separare il tessuto connettivo dall'ipoderma. Tagliare il muscolo addominale per esporre il lobo mediale destro del fegato.

Successivamente, posizionare l'animale sotto un microscopio chirurgico e regolare in modo da visualizzare il lobo mediale destro del fegato. Quindi, utilizzando la siringa, iniettare un terzo del volume totale del virus in tre siti all'interno del parenchima del lobo mediale destro, mantenendo l'ago nel tessuto per cinque-dieci secondi dopo l'iniezione per assicurare il rilascio completo del volume iniettato. Suturare il muscolo addominale e la ferita, quindi utilizzare un applicatore di cotone per applicare Neosporin. Posizionare il ratto in una camera di recupero fino al ritorno della coscienza e fino a quando non sarà in grado di mantenere una posizione eretta, prima di riconsegnare l'animale alla sua gabbia singola.

Da quattro a sette giorni dopo l'iniezione. Preparare le provette per il prelievo di sangue etichettandole e pesandole preventivamente. Quindi aggiungere 50 microlitri di 1000 unità per millilitro di eparina a ciascuna provetta.

Dopo aver anestetizzato il ratto secondo il protocollo descritto nel testo, eseguire una leggera pressione sulla coda per verificare lo stato di sedazione e, utilizzando forbici sterili, tagliare l'estremità della coda a circa uno o due millimetri dalla punta. Raccogliere più di 100 microlitri di sangue, goccia a goccia, in un tubo pre-riempito con eparina per arrestare l'emorragia.

Utilizzare un applicatore di cotone umido per applicare la polvere di STIC sulla coda. Utilizzare un batuffolo di alcol per pulire le forbici e sterilizzare le perle tra un prelievo e l'altro. Conservare le provette del sangue a quattro gradi Celsius.

Se si raccolgono campioni successivi, pesare le provette di raccolta e regolare l'eparina per ottenere un rapporto da due a uno tra sangue ed eparina. Questo passaggio normalizzerà la quantità di eparina in ciascun campione. Centrifugare le provette a 2000 ×g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Trasferire il surnatante plasmatico in una provetta nuova e conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di 72 ore o a ottanta gradi sotto zero per il lungo termine per il saggio della luciferasi per somministrare thaa garin come controllo positivo. Diluire in etanolo a una concentrazione finale di 2,5 milligrammi per millilitro. Quindi iniettare un milligrammo per chilogrammo per via intraperitoneale nella parte inferiore dell'addome.

Prelevare il primo campione di sangue a 24 ore dall'iniezione come descritto sopra. Per misurare la luminescenza, preparare il substrato lavorativo di selenazina seguendo il protocollo indicato nel testo e incubare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 30 minuti.

Nel frattempo, scongelare tutti i campioni su ghiaccio e trasferire 10 microlitri di plasma in una piastra con pareti opache utilizzando un lettore di piastre in grado di monitorare la bioluminescenza e dotato di un iniettore di substrato. Prime le linee con il substrato. Iniettare 100 microlitri di substrato in un pozzetto.

Agitare a velocità media per cinque secondi e misurare l'emissione luminosa per i campioni in vitro. Integrare l'emissione luminosa per 0,5 secondi nel passaggio di lettura e, per i campioni in vivo, integrare per cinque secondi nel passaggio di lettura per valutare l'omeostasi del calcio. Utilizzando il Metodo Gluc SAR Camp, è possibile includere diversi controlli, come un reporter costitutivamente secreto, ad esempio Gluc Noag in questo caso.

Un aumento dei livelli extracellulari sia di GLUC SAR camp che di Gluc noag in risposta a condizioni sperimentali sarebbe considerato un risultato ambiguo. Tuttavia, un aumento della secrezione di gluc SAR camp senza risposta di gluc noag supporta un evento dipendente dal calcio del reticolo endoplasmatico. Modulatori farmacologici delle riserve di calcio del reticolo endoplasmatico possono essere utilizzati per confermare il contributo del calcio del reticolo endoplasmatico al rilascio di SAR camp in nuovi paradigmi.

Ad esempio, come dimostrato qui, la dantrolene, un antagonista del recettore INE che stabilizza il calcio del reticolo endoplasmatico, inibisce il rilascio di SAR camp in risposta all'argon tio per studi in vitro utilizzando SAR camp basato su glucosio; la risposta indotta dal trattamento deve essere valutata meglio nel corso del tempo. Monitorando le variazioni della risposta relativa all'interno di una piastra rispetto ai controlli, non è consigliabile confrontare i valori grezzi tra più piastre, dove il decadimento del substrato può portare a modifiche nei valori assoluti. Per gli studi in vivo, i dati devono essere valutati separatamente per ogni animale, con ciascun animale che funge da controllo rispetto al trattamento precedente.

Questo è necessario per tenere conto della variabilità nella consegna e nell'espressione del transgene tra gli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la tecnologia sircam per studiare la regolazione del calcio nel reticolo endoplasmatico in modelli rodentici di malattia epatica. Non dimenticare che lavorare con vettori virali può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare l'adeguata attrezzatura di protezione individuale, durante l'esecuzione di questa procedura.