Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un Gaussia Luciferasi SERCaMP

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di monitorare la disregolazione del calcio del reticolo endoplasmatico nel tempo utilizzando una proteina reporter secreta. Ciò si ottiene mediante transgenesi mediata da vettore virale del tessuto bersaglio, in particolare del fegato. In questo esempio con la luciferasi Gai circa reporter il fluido biologico successivo, come il sangue, viene raccolto per misurare la quantità di circa rilasciata dal tessuto, quindi il substrato di luciferasi viene aggiunto ai campioni di plasma e la luminescenza viene misurata per determinare la deplezione di calcio ER.

I risultati mostrano che la disregolazione del calcio nell'ER, come indicato da un aumento dei livelli plasmatici di C camp, l'omeostasi dell'ER può essere monitorata per periodi prolungati mediante campionamento ripetuto di piccoli volumi di fluidi biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i coloranti di calcio a bassa affinità o gli indicatori di calcio geneticamente codificati è che l'omeostasi del calcio er può essere monitorata in vivo nel tempo tramite una procedura minimamente invasiva. Ci sono due strade terapeutiche per questa tecnica.

Il primo è lo screening dei farmaci in grado di mantenere o ripristinare l'omeostasi del calcio al normale stato fisiologico. Il secondo approccio consiste nel modificare la proteina terapeutica per farla diventare ampere terapeutico in cui si verifica la secrezione in risposta alla deplezione di calcio dell'er. Anche se questo metodo può fornire informazioni sulla disregolazione del calcio nel fegato.

Può anche essere applicato ad altri sistemi di organi come cervello, cuore, muscoli o pancreas. Dopo l'anestesia, un ratto bambola spratto, secondo il protocollo di testo, applica un unguento oftalmico ed esegue un pizzicotto della coda per verificare l'anestesia, rade la regione dell'addome leggermente al di sotto delle costole fino alla regione addominale centrale e strofina l'area chirurgica tre volte, alternando Betadine ed etanolo al 70%. Quindi posizionare il ratto in posizione supina su un'area chirurgica sterile e coprire con teli chirurgici sterili diluire a a v gluc samp alla concentrazione ottimizzata dall'utente.

In questo caso, abbiamo usato da 7,6 volte 10 al nono genoma virale per millilitro e mescolato invertendo nella provetta. Quindi pipettare 105 microlitri di A V diluito in un piatto sterile e utilizzare un ago calibro 30 per raccogliere il virus in una siringa. Contrassegnare il sito di incisione bersaglio per esporre il fegato per l'iniezione utilizzando un bisturi.

Fai un'incisione orizzontale di circa due o tre centimetri di lunghezza sotto la gabbia toracica. Sezionare smussata per separare il tessuto connettivo dall'ipoderma. Tagliare il muscolo addominale esponendo il lobo mediale destro del fegato.

Quindi, posiziona l'animale sotto un microscopio chirurgico e regolalo per ottenere il lobo mediale destro del fegato nel campo visivo. Quindi, utilizzando la siringa, iniettare un terzo del volume totale del virus in tre siti nel parenchima del lobo mediale destro, lasciando l'ago nel tessuto per cinque-10 secondi dopo l'iniezione per garantire l'erogazione dell'intero volume di iniezione, suturare il muscolo addominale e l'incisione e utilizzare un applicatore con punta di cotone per applicare Neosporin. Metti il ratto in una camera di recupero fino a quando non riprende conoscenza ed è in grado di mantenere una posizione eretta prima di riportare l'animale in una gabbia domestica ospitata.

Da quattro a sette giorni dopo l'iniezione. Preparare le provette per la raccolta del sangue etichettandole e prepesandole. Quindi a 50 microlitri di 1000 unità per millilitro di eparina in ogni tubo.

Dopo aver anestetizzato il ratto secondo il protocollo di testo, eseguire un pizzicamento della coda per verificare la sedazione e utilizzando forbici sterili. Taglia la punta della coda a circa uno o due millimetri dall'estremità. Raccogliere più di 100 microlitri di sangue goccia a goccia in una provetta preriempita di eparina per fermare l'emorragia.

Utilizzare un applicatore di cotone bagnato per applicare la polvere STIC sulla coda. Usa un tampone di etanolo per pulire le forbici e sterilizzare le perline tra una raccolta e l'altra. Conservare i tubi di sangue a quattro gradi Celsius.

Se si raccolgono campioni successivi, pesare le provette di raccolta e regolare l'eparina per ottenere un rapporto di due a uno tra sangue ed eparina. Questo passaggio normalizzerà la quantità di eparina in ciascun campione. Centrifugare le provette a 2000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Trasferire il surnatante plasmatico in una provetta nuova e conservarlo a quattro gradi Celsius per un massimo di 72 ore o meno 80 gradi Celsius a lungo termine per il dosaggio della luciferasi per somministrare thaa garin come controllo positivo. Diluire in etanolo fino a una concentrazione finale di 2,5 milligrammi per millilitro. Quindi iniettare a un milligrammo per chilogrammo intraperitoneale nell'addome inferiore.

Prelevare il primo campione di sangue 24 ore dopo l'iniezione come descritto sopra. Per misurare la luminescenza. Preparare il substrato di lavoro selen ezine secondo il protocollo di testo e incubato a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 30 minuti.

Nel frattempo, scongelare tutti i campioni su ghiaccio e trasferire 10 microlitri di plasma su una piastra a parete opaca utilizzando un lettore di piastre in grado di monitorare la bioluminescenza e dotato di un iniettore di substrato. Adescare le linee con il substrato. Iniettare 100 microlitri di substrato in un pozzetto.

Agitare a velocità media per cinque secondi e misurare l'emissione di luce per campioni in vitro. Integrare l'emissione luminosa in 0,5 secondi per la fase di ripetizione e per i campioni in vivo, integrare in cinque secondi la fase di lettura per valutare l'omeostasi del calcio. Utilizzando il metodo Gluc SAR Camp, possono essere inclusi diversi controlli, come in questo caso un reporter secreto costituentemente come Gluc Noag.

Un aumento dei livelli extracellulari sia del campo SAR GLUC che del Gluc noag in risposta a condizioni sperimentali sarebbe considerato un risultato ambiguo. Tuttavia, un aumento della secrezione del campo gluc SAR senza risposta al gluc noag supporta un evento ER calcio-dipendente. I modulatori farmacologici della riserva di calcio dell'ER possono essere utilizzati per confermare il contributo del calcio dell'ER al rilascio del campo SAR in nuovi paradigmi.

Ad esempio, come dimostrato qui il dantrolene, un antagonista del recettore INE che stabilizza il calcio dell'ER inibisce il rilascio di SAR camp in risposta all'argon thic per studi in vitro che utilizzano SAR camp a base di gluc, la risposta indotta dal trattamento è meglio valutata nel corso del tempo. Tracciando i cambiamenti nella risposta relativa all'interno di una lastra rispetto ai controlli, non è consigliabile confrontare i numeri grezzi su più piastre in cui il decadimento del substrato può portare a cambiamenti nei valori grezzi. Per gli studi in vivo, i dati devono essere valutati in modo indipendente per ciascun animale, fungendo da controllo pre-trattamento.

Ciò è necessario per tenere conto della variabilità nella consegna e nell'espressione del transgene tra gli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare una tecnologia sircam per studiare la regolazione del calcio nei modelli di roditori di malattie epatiche. Non dimenticare che lavorare con i vettori virali può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i dispositivi di protezione individuale adeguati.