Name: Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un Gaussia Luciferasi SERCaMP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Scopri come monitorare l'omeostasi del calcio nel reticolo endoplasmatico utilizzando il reporter SERCaMP con luciferasi Gaussia. Questo metodo permette il monitoraggio in vivo nel tessuto epatico con campionamento mininvasivo.

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Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Intramurale presso l'Istituto Nazionale sull'Abuso di Droghe. Ringraziamo Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno e Josh Hinkle per il loro contributo allo sviluppo di questo metodo.

1. In vitro: Individuare SERCaMP uscita da una linea cellulare SH-SY5Y stabile <ol><li> Piastra SH-SY5Y-GLUC-ASARTDL (SERCaMP) in coltura trattata piastre a 150.000 cellule per cm 2 di superficie. Per piastre da 96 pozzetti, per esempio, seme 50.000 cellule per pozzetto (Figura 1A). Crescere cellule SH-SY5Y in DMEM (alto glucosio, Glutamax, piruvato) + 10% della crescita bovina di siero + 1x penicillina / streptomicina. <ol><li> Cellule Passage fino a 15 volte (Figura 1B). Numero più elevato passaggio non è stato testato. </li><li> Ritorno a cellule incubatore umidificato a 37 ° C con 5,5% di CO 2 e incubare durante la notte. </li></ol></li><li> Prima del trattamento sperimentale (s), raccogliere un campione di riferimento per ciascun pozzetto con il trasferimento di 5 ml di cultura surnatante in un opaco murato 96 pozzetti. Prima di raccogliere, picchiettare delicatamente la piastra su tutti i lati e agitare per evitare effetti di sfumatura. Sigillare la piastra opaca con un adesivo sfoglio di Ealing e conservare a 4 ° C fino al momento del test enzimatico. Nota: Secreted GLUC-SERCaMP è molto stabile nel terreno di coltura. Abbiamo precedentemente riportato circa il 5-10% di attività Gluc è stato perso dopo una incubazione 72 ore a 37 ° C (incubato sulle cellule SH-SY5Y) 12. </li><li> Il trattamento di cellule, se lo desideri esaminare ER calcio esaurimento (ad esempio ambientale, farmacologico, manipolazioni genetiche). Evitare l&#39;esposizione a lungo condizioni ambientali (al di fuori dell&#39;incubatore controllata) come variazioni di pH sarà rapidamente verificarsi in CO 2 atmosferica. Aggiungere HEPES al mezzo di coltura a 20 mM, per stabilizzare il pH 14, se sono necessarie manipolazioni prolungate. Evitare l&#39;esposizione alla luce durante l&#39;utilizzo HEPES in terreno di coltura 15. <ol><li> Controllo positivo: Trattare cellule con 100 tapsigargina nM (Tg) o 50 mM acido ciclopiazonico (CPA) per 4-6 ore per esperimenti in cellule SH-SY5Y. Risposta massima in altre linee cellulari possono richiedere incubazione più lunghi o diverso concenstrazioni di composti. </li><li> Controllo negativo: terreno di coltura Raccogliere da cellule SH-SY5Y parentali. Nella nostra esperienza, la luminescenza di fondo per questo dosaggio è inferiore al 0,05% della secrezione basale di cellule stabili SH-SY5Y-GLUC-SERCaMP. </li></ol></li><li> Raccogliere e campioni negozio 5 microlitri di media condizionata al timepoints desiderati, come indicato al punto 1.2. </li><li> Valutare l&#39;attività enzimatica nel medio come indicato nella Sezione 5. </li><li> Esaminare GLUC intracellulare da immunoblot o dosaggio luminescenza. <ol><li> Per immunoblot: cellule in tampone RIPA Lisare modificato contenente Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, 0,25% sodio desossicolato, 1 mM EDTA, 1% NP40, e inibitori della proteasi. Separato su gel di SDS-poliacrilammide e trasferimento a membrana PVDF 0.20 micron. Incubare a membrana con GLUC anticorpi (1: 2.000 diluizione) notte a 4 ° C. Eseguire incubazione anticorpi e membrana lavaggi secondarie come da protocollo definito dall&#39;utente per reagente rilevamento di scelta. </li><li> Perluminescenza test (Figura 2): eseguire le seguenti operazioni sul ghiaccio: <ol><li> Rimuovere tutti i media da pozzetti della piastra di coltura tissutale e risciacquare con 200 ml di PBS freddo. </li><li> Aggiungere 75 ml di tampone di lisi contenente Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% NP40 e inibitori della proteasi in ciascun pozzetto. </li><li> Ruotare la piastra su un agitatore orbitale (120 rpm) a 4 ° C per 20 min. </li><li> Pipetta delicatamente il lisato su e giù con una pipetta multicanale, evitando bolle d&#39;aria. Trasferire 5 ml di lisato ad una piastra opaco e valutare luminescenza come indicato nella Sezione 5. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. In vitro: trasfezione transiente di cellule immortalati con SERCaMP Nota: Abbiamo osservato che le procedure di trasfezione transiente può indurre stress cellulare e smorzare la conseguente risposta GLUC-SERCaMP. Il seguente metodo è stato sviluppato per minimizzare trasfezione eff<html> riflette nelle cellule SH-SY5Y. Ottimizzazione della procedura (compreso scelta di reagente di trasfezione) per linee cellulari alternati può essere richiesto. Quando possibile, si consiglia di utilizzare le linee cellulari stabili o metodi di trasduzione virale descritti rispettivamente nei punti 1 e 3. <ol><li> Piastra cellule SH-SY5Y in un piatto di 100 mm a 4 x 10 6 cellule. Questo piatto sarà sufficiente riseminare circa 300 pozzetti (96 pozzetti) formato seguendo la procedura di trasfezione. </li><li> Cellule trasfezione con il reagente xfect con 20 mg di DNA plasmidico (codifica GLUC-SERCaMP) e 6 ml di xfect reagente. Scala del DNA e xfect reagente conseguenza per recipienti di coltura più o meno grandi. </li><li> Cellule tornare a incubatore per 48 ore. </li><li> Trypsinize cellule e reseed a 96 pozzetti a 60.000 cellule per pozzetto. Seguire le successive fasi descritte nella Sezione 1. </li></ol> 3. In vitro: mediata vettore virale Espressione di GLUC-SERCaMP tenda &quot;&gt; Nota: virale adeno-associato (AAV) imballaggio vettore 16 e purificazione 12 e lentivirus produzione 13 sono stati segnalati in precedenza. <ol><li> Titolo GLUC-SERCaMP AAV utilizzando i seguenti primer e sonde: primer forward, 5&#39;-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 &#39;; primer reverse, 5&#39;-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 &#39;; Sonda (5&#39;-6-FAM / 3&#39;-BHQ-1 etichettato), 5&#39;-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 &#39;per la PCR quantitativa. <ol><li> Preparare la curva standard linearizzazione un plasmide contenente GLUC e purificazione del DNA con uno spin-colonna (ad es Machery-Nagel NucleoSpin Gel e PCR pulizia). Quantificare il DNA separando su un gel di agarosio a fianco di una scala di massa. Preparare 1:10 diluizioni del DNA di 100 pg / ml a 10 fg / ml in PBS. Calcolare le copie / ml di DNA plasmidico Gluc in ciascuna delle concentrazioni in base al peso molecolare del plasmide. </li><li> Diluire le scorte AAV in PBS (opportuna diluizione dipenderàparametri di preparazione virale e determinati empiricamente). </li><li> Eseguire la reazione PCR in un sistema PCR in tempo reale utilizzando le seguenti condizioni: 95 ° C x 5 min, 94 ° C × 20 sec e 60 ° C × 1 min per 41 cicli. Calcola copie / ml usando la curva standard. </li></ol></li><li> Titolo lentivirus con una p24 Lenti-X kit rapida del titolo. Scongelare aliquote lentivirali sul ghiaccio e diluire la proteina p24 di controllo in SH-SY5Y medio. <ol><li> Diluire il lentivirus tale che cadrà sulla curva standard (ad esempio, 1: 20.000 o 1: 100.000). Il fattore di diluizione necessaria varia in base ai parametri di preparazione lentivirali e deve essere determinato empiricamente. Seguire le istruzioni del produttore per tutte le fasi successive. </li></ol></li><li> Cellule piastra a 96 pozzetti. Per le cellule SH-SY5Y, le procedure di placcatura descritte nella sezione 1 possono essere seguite. Per ratto neuroni corticali primarie, le cellule devono essere isolati e seminate su piastre opportunamente rivestite as descritto in precedenza 16. Mantenere ratto neuroni corticali primarie Neurobasal media integrato con 1x B27 e 500 mM L-glutammina. Effettuare scambi e mezzo di media ogni due giorni. </li><li> Trasdurre le cellule con il virus. L&#39;obiettivo di trasduzione virale è quello di raggiungere l&#39;espressione di basso livello, come Gaussia luciferasi fornisce segnale più forte. <ol><li> Cellule SH-SY5Y AAV trasduzione: trasdurre il giorno seguente placcatura. Diluire AAV a 6.0 x 10 7 vg / ml in tampone di diluizione AAV (PBS + 0.5mm MgCl 2). Aggiungere 5 ml di AAV diluito (3.0 x 10 8 vg; MOI di circa 6.000) per pozzetto di 96 pozzetti (Figura 3A). Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti vettore virale. </li><li> AAV trasduzione di neuroni corticali di ratto primarie: trasdurre 6-8 giorni dopo la placcatura. Diluire AAV a 4,0 x 10 6 vg / ml in tampone di diluizione AAV. Aggiungere 5 ml di AAV diluito (2.0 x 10 7 vg; MOI di circa 350) per pozzetto di96 pozzetti (Figura 3B). L&#39;ottimale MOI dovrebbe essere determinata empiricamente per altri tipi di cellule. Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti vettore virale. </li><li> Trasduzione lentivirali di cellule SH-SY5Y: trasdurre il giorno seguente placcatura. Diluire lentivirus a 20 pg / ml p24 (concentrazione determinato utilizzando kit di titolazione) in soluzione salina bilanciata di Hank. Aggiungere 5μl del virus diluito per bene (100 pg di p24, pari a 1.250.000 particelle lentivirali, o ~ 1.250 IFUs) di una piastra ben 96 contenente 100 ml di volume. Scala di conseguenza per i formati più grandi. Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti virale. </li></ol></li><li> Raccogliere un campione di pre-trattamento dei media e iniziare le cure sperimentali a 48 ore (SH-SY5Y) o 5-7 giorni (ratto neuroni corticali primarie) dopo trasduzione. </li></ol> 4. In Vivo SERCaMP Assay Nota: Prima di effettuare qualsiasi procedura sugli animali da essere sicuri di ottenere l&#39;approvazione corretta attraverso il vostro istituto. Tuttiambulatori di sopravvivenza sono da fare in condizioni sterili con anestesia adeguata. Tutte le procedure descritte qui di seguito sono stati approvati e sono in conformità con le linee guida NIH ACUC. <ol><li> Strumenti chirurgici autoclave prima dell&#39;inizio della chirurgia (121 ° C, 30 min sterilizzazione, 20 min tempo di asciugatura). Pulire tutti gli strumenti in un ultrasonicatore immediatamente seguenti tutte le procedure e prima della sterilizzazione in autoclave. Mantenere condizioni di sterilità durante l&#39;intervento chirurgico la sopravvivenza. Per interventi chirurgici che richiedono più animali, pulire strumenti chirurgici con il 70% di alcol, ultrasonicate e tallone sterilizzare tra ratti. Fare riferimento a Materiali Lista per strumenti necessari. </li><li> Preparare topo per la chirurgia. Qui usiamo maschio Sprague-Dawley (180-200 g). <ol><li> Anestetizzare ratti utilizzando isoflurano gas per 3 minuti (4-5% isoflurano consegnato a 1.000 cc / min) seguita da iniezioni intraperitoneali di xilazina (8 mg / kg) e ketamina (80 mg / kg). Applicare pomata oftalmica per proteggere cornee si secchi. Bchirurgia EGIN una volta che il ratto è profondamente anestetizzati come dimostrato dalla mancanza di ritiro riflesso seguito coda o il piede pizzico. </li><li> Radere la regione dell&#39;addome leggermente sotto le costole (bassa regione toracica) alla regione addominale metà. Scrub l&#39;area chirurgica tre volte, alternando il 70% di alcol e Betadine macchia. Mettere ratto in posizione supina su area chirurgica sterile con teli chirurgici sterili. </li></ol></li><li> Diluire AAV-GLUC-SERCaMP a 7,6 x 10 9 VG / ml (concentrazione finale). Mescolare bene invertendo il tubo. Nota: Intervallo di concentrazione virale può variare (Figura 4). <ol><li> Dispensare 105 ml di AAV diluito in un piatto sterile. Usare un ago da 30 gauge per raccogliere il virus in una siringa. </li></ol></li><li> Eseguire un intervento chirurgico per esporre il fegato e iniettare AAV-GLUC-SERCaMP. <ol><li> Prima di effettuare un&#39;incisione nell&#39;addome, applicare bupivacaina 0,25% alla zona di incisione. Usando un bisturi, fare una incisione orizzontale sotto gabbia toracica (approximately 2-3 cm). Blunt sezionare a separare il tessuto connettivo da ipoderma. </li><li> Tagliare muscoli addominali, esponendo il lobo destro mediale del fegato. Nota: lobi aggiuntivi possono essere iniettati in base all&#39;applicazione finale. </li><li> Mettere animale sotto microscopio operatorio e regolare per ottenere il diritto del lobo mediale del fegato nel campo visivo. Iniettare virus nel parenchima del lobo mediale; 3 siti separati, di circa 33 ml per sito. Nota: Lasciare l&#39;ago nel tessuto per 5-10 secondi dopo l&#39;iniezione per garantire la consegna di tutto il volume di iniezione. </li><li> Suturare il muscolo addominale e la pelle separatamente e aggiungere Neosporin utilizzando cotone dell&#39;applicatore punta. Posizionare ratto in una camera di recupero fino coscienza è recuperato e ratto è in grado di mantenere la posizione eretta. Non lasciare ratto (s) incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Casa singolarmente fino a quando l&#39;incisione è guarita e le suture sono state rimosse (7-14 giorni). <br/&gt; Nota: Secondo le linee guida post-chirurgiche NIH, mantenere registrare chirurgico. Annota carta gabbia con procedura, la data, identificatore del test, il peso corporeo, e giorno dell&#39;intervento. Dolore / disagio, la produzione di feci, l&#39;attività, e il cibo e il consumo di acqua devono essere monitorati e registrati chirurgia 3 giorni post. Analgesia post-operatoria è fornito con l&#39;aggiunta di paracetamolo per l&#39;acqua potabile (450 mg / 100 cc), anche se non osserviamo tipicamente segni di dolore o disagio dopo l&#39;intervento. </li></ol></li><li> Inizia coda raccolta del sangue 4-7 giorni dopo l&#39;iniezione. Preparare le provette di raccolta del sangue, mediante l&#39;etichettatura e pre-pesatura. Aggiungere 50 ml di eparina (1.000 U / ml) per ogni provetta. </li><li> Luogo ratto in camera di isoflurano per 3 minuti (4-5% isoflurano consegnato a 1.000 cc / min). Rimuovere ratto dalla camera e posto nel naso cono (2-3% isoflurano consegnato a 500 cc / min). La raccolta del sangue può iniziare una volta che il ratto è profondamente anestetizzati come dimostrato dalla mancanza di ritiro riflesso seguito coda piNCH. <ol><li> Utilizzando le forbici sterili punta taglio della coda (1-2 mm) e raccogliere il sangue goccia a goccia nel tubo eparina pre-riempita. Raccogliere il sangue fino volume raggiunge maggiore di 2: 1 rapporto sangue eparina (&gt; 100 ml sangue / 50 ml di eparina). I volumi di raccolta del sangue possono essere regolati in base a disegno sperimentale. Utilizzare un applicatore di cotone umido per applicare la polvere emostatico alla coda per fermare l&#39;emorragia. </li><li> Provette di sangue Conservare a 4 ° C se la raccolta di campioni successivi. Pulire forbici con fondello etanolo e tallone sterilizzare tra le collezioni. </li><li> Pesare provette per il prelievo e regolare con eparina per ottenere rapporto 2: 1 (sangue: eparina). Questo passaggio normalizzare la quantità di eparina in ciascun campione (Tabella 1). </li><li> Tubi centrifugare a 2000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante (plasma) in una nuova provetta e conservare a -80 ° C fino al momento della luciferasi test (sezione 5). Nota: Conservazione dei campioni a 4 ° C fino a 72 ore prima del saggio enzimatico ha minimal effetto sulla luminescenza (Figura 5A). Fino a 3 cicli di gelo-disgelo dei campioni di plasma non hanno alcun effetto sulla luminescenza (Figura 5B). </li></ol></li><li> Amministrazione tapsigargina (controllo positivo): <ol><li> Preparare thapsigargin diluendo in etanolo ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml. Iniettare tapsigargina a 1 mg / kg ip nel basso addome. Nota: tapsigargina aumenta trombina piastrinica indotta coagulazione 17 e può fare la raccolta di sangue da coda più difficile. </li></ol></li><li> Gaussia luciferasi test: <ol><li> Scongelare i campioni di plasma sul ghiaccio. Nota: Per gli studi longitudinali, disgelo e di eseguire test di luminescenza per tutti i campioni tempo di valutazione nella stessa giornata (utilizzando solo la preparazione del sottofondo). </li><li> Trasferimento 10 ml di plasma per un piatto di murato opaco e misurare l&#39;attività enzimatica come descritto nel capitolo 5. Eseguire 3-4 repliche tecniche di ogni campione di plasma. </li></ol></li><li> Euthanasiun Nota: Il vantaggio della tecnologia SERCaMP è la capacità di monitorare longitudinalmente ER calcio. A seconda di parametri sperimentali e le analisi degli endpoint, gli animali devono essere eutanasia con misure adeguate per le analisi degli endpoint e secondo gli orientamenti ACUC istituzionali. </li></ol> 5. Luminescence Assay <ol><li> Preparare soluzioni coelenterazine (CTZ) stock diluendo il composto in metanolo acidificato (30 ml di HCl 10 N a 3 ml di metanolo) a 20 mM. Preparare aliquote monouso e conservare a -80 ° C. </li><li> Preparare il substrato lavorare il giorno di dosaggio. <ol><li> Per i saggi in vitro, diluire coelenterazine a 8 micron di PBS, ad esempio, aggiungere 10 ml di 20 mM magazzino CTZ a 25 ml di PBS (Figura 6A, B). </li><li> Per i saggi in vivo, diluire coelenterazine a 100 micron di PBS, 500 mm acido ascorbico, 5 mM NaCl. </li></ol></li><li> Incubare preparato CTZ per almeno 30 minutia temperatura ambiente prima di iniziare il test. Nota: Questo passo è spesso incluso in Gaussia saggi di luciferasi in quanto vi sono segnalazioni di rapido decadimento substrato durante la prima 30 minuti dopo la preparazione. Non abbiamo osservato questo effetto nel nostro sistema (Figura 6C); tuttavia, spesso includiamo la fase di incubazione che abbiamo trovato alcun impatto negativo sul dosaggio. </li><li> Utilizzare un lettore di piastre che è capace di monitorare bioluminescenza e dotato di un iniettore substrato. Prime le linee con substrato. Nota: Il substrato iniziale attraverso le linee possono essere soggette a degrado. Per evitare letture artificialmente bassi per i primi campioni, iniettare 20-30 pozzi vuoti (caricamento di un piatto vuoto sul lettore) prima di misurare campioni sperimentali. </li><li> Iniettare 100 ml di substrato in bene, agitare velocità media per 5 secondi, e misurare l&#39;emissione di luce. Per il lettore di piastre Biotek Synergy II, integrare l&#39;emissione di luce oltre 0,5 sec (campioni in vitro) e 5 sec (invivo campioni) per la fase di lettura. Ottimizzare i parametri del lettore piastra Per garantire prestazioni ottimali del test. Nota: mostre Gaussia luciferasi cinetica flash con rapido decadimento del segnale (rispetto a brillare cinetiche osservate con altri luciferasi). La cinetica d&#39;infiammabilità di GLUC è influenzata dal siero in terreno di coltura cellulare (Figura 7A), mettendo in evidenza l&#39;importanza di controllare per la composizione media tra i campioni. A causa del rapido decadimento della luminescenza dopo l&#39;aggiunta del substrato (cinetica Flash), il tempo tra iniezione e leggere passaggi deve essere uniforme per tutti i campioni. Il lettore di piastre deve essere impostato per iniettare substrato un pozzo, attendere un tempo fisso (ad esempio usiamo un frullato passo 5 sec), e leggiamo che bene. Aggiunta di substrato a un intero piatto prima lettura rappresenta una sfida significativa a meno substrato può essere aggiunto a tutti i pozzetti simultaneamente. Se un iniettore non è disponibile, il problema può essere parzialmente aggirato incubando la piastra per 10 minuti fra il supporto addizione e misurazione (evitando così la parte ripida della curva di decadimento) (Figura 7B). </li><li> Ripetere l&#39;iniezione, tempo di attesa, e leggere passaggi per ogni pozzetto della piastra. </li></ol>

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<li>Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+and+toxicity+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+7%2C+8%2C+and+9+in+rat+neurons+and+glia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro.</a> Virology. 372 (1), 24-34 (2008).</li>
<li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li>
<li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li>
<li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+in+gene+therapy%3A+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo evidenzia in vitro e in vivo di utilità Gluc-SERCaMP monitorare deplezione di ER calcio. Anche se la modifica della proteina di generare SERCaMP sembra generalizzare ad altre proteine ​​reporter di 12, abbiamo scelto Gaussia luciferasi per la sua robustezza (200-1.000 volte maggiore) bioluminescenza rispetto agli altri luciferasi 18. Dimostriamo rilevabile tapsigargina indotta rilascio GLUC-SERCaMP attraverso un range di dosaggio 100 volte virus GLUC-SER...

Il reticolo endoplasmatico (ER) funzioni in molte capacità cellulari tra cui il ripiegamento delle proteine, la secrezione di proteine, lipidi omeostasi, e intracellulare di segnalazione 1. Centrale alla funzione ER normale è mantenere le concentrazioni di calcio luminali in ~ 5.000 volte quelli trovati nel citoplasma 2-4. Questo processo intensità energetica è regolata dalla ATPasi sarco / reticolo endoplasmatico calcio (SERCA), una pompa che si muove ioni calcio al pronto soccorso. Passaggio di calcio dalle ER è mediato principalmente dal rianodina (RyR) e trifosfato inositolo (IP3R) recettori. Poiché molti processi ER dipendono calcio, interrompendo il negozio può portare a ER stress e la morte delle cellule. ER disregolazione del calcio è stata osservata in malattie tra cui cardiomiopatia, diabete, morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e 5. A causa della natura progressiva di queste malattie, è stato impegnativo per delineare la causa-effetto rerappor- tra la patogenesi e alterazioni del negozio ER calcio. Un certo numero di tecnologie hanno permesso significativi progressi nella nostra comprensione delle dinamiche ER calcio, compresi i coloranti e gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS). Coloranti di calcio a bassa affinità, che aumentano di fluorescenza quando si lega a Ca 2+, possono essere caricati in cellule per esaminare compartimenti subcellulari con elevate concentrazioni di calcio 6. GeCIS, quali D1ER e catcher consentire un monitoraggio delle fluttuazioni di calcio con un controllo più preciso della localizzazione subcellulare 7-9. Recentemente, un&#39;altra classe di GECIS chiamati indicatori di proteine ​​organelli-intrappolato-calcio misura (Cepia) sono stati descritti 10. Un terzo approccio che combina la genetica e la piccola molecola chimica è mirata-esterasi dye carico (TED), che utilizza un carbossilesterasi geneticamente codificato (mirato al pronto soccorso), con un calcio di colorante a base di estere-11. Mentre il aforapprocci ementioned hanno punti di forza e debolezze intrinseche, possono fornire informazioni preziose dinamiche di calcio ER attraverso misure acuti di fluorescenza. Sono, tuttavia, non è ottimale per gli studi longitudinali spesso necessarie per determinare la progressione della malattia. Con l&#39;obiettivo di escogitare un metodo per monitorare dinamiche di calcio per periodi di tempo prolungati, abbiamo identificato e sviluppato una modifica proteina per creare le proteine ​​secrete calcio ER supervisione (SERCaMPs) 12. SERCaMP elude diversi limiti associati con altre metodologie, fornendo un approccio mini-invasivo per interrogare più volte il negozio ER calcio. Abbiamo precedentemente dimostrato che il peptide ASARTDL carbossiterminale (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-aspartico-leucina) è sufficiente a favorire la ritenzione ER; Tuttavia, in condizioni che causano diminuzioni ER calcio, la sequenza di peptidi non è più in grado di trattenere ER localization e la proteina è secreta 13. La base della tecnologia SERCaMP è l&#39;appendice di ASARTDL al carbossi-terminale di una proteina secreta (es Gaussia luciferasi o Gluc) tale che la secrezione è innescato dalla deplezione ER calcio, creando così un robusto giornalista di ER calcio disregolazione 12. L&#39;espressione di GLUC-SERCaMP tramite metodi transgenici permette fluidi biologici tra cui coltura cellulare di medio e di plasma da analizzare per i cambiamenti nell&#39;attività GLUC come indicatore dell&#39;omeostasi ER calcio. Il metodo ha applicazioni per lo studio longitudinale alterazioni progressive nell&#39;archivio calcio ER sia in vitro che in vivo. Il protocollo che segue è scritto come un quadro generale per l&#39;uso di base-GLUC SERCaMP studiare ER calcio omeostasi, ma il protocollo può servire come guida per SERCaMPs giornalista alternative.

<table><tbody><tr><td>Tubi da 1,5 ml</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione NP-40 al 10%&nbsp;</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>per saggi intracellulari di GLuc</td></tr><tr><td>Siringhe luer-lok da 1 ml Fisher</td><td></td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>Puntali filtranti da 200 microlitri</td><td>Suture</td> chirurgiche Rainin <td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Fisher</td><td></td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>aghi da 30 G Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-821-13A</td><td></td></tr><tr><td>Fogli sigillanti per micropiastre adesive</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di flusso automatico per anestesia</td><td>EZ Anesthesia</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Camera di recupero per animali</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di betadina</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Siero per la crescita bovina</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Celenterazina, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da taglio Suture a 3/8 cerchi</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore digitale ad ultrasconica</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio, GlutaMAX, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Scala di massa del DNA</td> Life <td>Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferasi (proteina ricombinante)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Gaussia luciferasi (per WB, ICC o IHC)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2.000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinatore 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per saggi Gluc (96 pozzetti, opache)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Maggiordomo isoflurano</td><td> Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Polvere emostatica</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R Centrifuga</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie neurobasali per la</td><td>media vita</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio Nikon</td><td></td><td>Gel Nucleospin Nikon</td> SMZ745T <td></td></tr><tr><td>e pulizia PCR</td><td>Pipetta Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Kit di titolazione rapida Lenti-X</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh Carbone di legna Contenitore del filtro</td><td>EZ Anestesia</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi, #10</td><td>Fine Science tools Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>SD ratti 150-200 g</td><td>Charles River</td><td>Ratti ratti</td><td>ordinati a 150-200 g. Intervento chirurgico 5 giorni dopo l'arrivo</td></tr><tr><td>Marchi auricolari per piccoli animali</td><td>National Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Teli chirurgici sterili</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 lettore di piastre</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>dannoso per salute umana</td></tr><tr><td>Virapower miscela di imballaggio lentivirale</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione Xfect</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi utilizzando un<em&gt; gaussia</em&gt; luciferasi sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Il reticolo endoplasmatico (ER) contiene il più alto livello di calcio intracellulare, con concentrazioni di circa 5000 volte superiore a livelli citoplasmatici. Stretto controllo sulla ER calcio è un imperativo per ripiegamento proteico, la modifica e il traffico. Perturbazioni ER calcio può provocare l&#39;attivazione della risposta unfolded proteina, un meccanismo di risposta allo stress ER tre poli, e contribuire alla patogenesi di varie malattie. La capacità di monitorare alterazioni ER calcio durante l&#39;insorgenza e la progressione della malattia è importante in linea di principio, ma stimolante in pratica. Metodi attualmente disponibili per monitorare ER calcio, come coloranti e proteine ​​fluorescenti calcio-dipendente, hanno fornito visione dinamica ER calcio nelle cellule, tuttavia questi strumenti non sono adatti per gli studi in vivo. Il nostro laboratorio ha dimostrato che una modifica al carbossi-terminale della luciferasi Gaussia conferisce la secrezione del reporter in risposta aER deplezione di calcio. I metodi per l&#39;utilizzo di una base luciferasi, ER secreta proteina monitoraggio calcio (SERCaMP) in vitro e per applicazioni in vivo sono qui descritti. Questo video mette in evidenza le iniezioni epatiche, manipolazione farmacologica del GLUC-SERCaMP, la raccolta e il trattamento del sangue, e parametri del test per il monitoraggio longitudinale ER calcio.

Il metodo GLUC-SERCaMP permette per la valutazione di ER calcio omeostasi campionando fluidi extracellulari. Diversi controlli possono essere inclusi nel disegno sperimentale per migliorare l&#39;interpretazione dei risultati. In primo luogo, l&#39;uso di un reporter costitutivamente secreta (ad esempio GLUC senza il ASARTDL C-terminale o &quot;GLUC-No Tag&quot;) può essere impiegato per valutare gli effetti dei trattamenti sperimentali sulla via secretoria (secrezione cellulare globale) e l&#39;espressione del...

L'omeostasi del calcio del reticolo endoplasmatico è interrotta in diverse patologie. Un reporter della proteina di monitoraggio del calcio ER secreta (SERCaMP) può essere utilizzato per rilevare le interruzioni nella riserva di calcio ER. Questo protocollo descrive l'uso di una Gaussia luciferasi SERCaMP per esaminare l'omeostasi del calcio ER in vitro e in vivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è monitorare nel tempo la disregolazione del calcio nel reticolo endoplasmatico avvalendosi di una proteina reporter secreta. Questo risultato si ottiene mediante trasgenesi mediata da vettore virale del tessuto bersaglio, in particolare il fegato. In questo esempio, impiegando il reporter Gai luciferasi circa, si raccoglie un fluido biologico successivo, come il sangue, al fine di misurare la quantità di circa rilasciata dal tessuto; successivamente, il substrato della luciferasi viene aggiunto ai campioni di plasma e la luminescenza viene misurata per determinare la carenza di calcio nel reticolo endoplasmatico.I risultati mostrano una disregolazione del calcio nel reticolo endoplasmatico, indicata da livelli aumentati di C camp plasmatico. L'omeostasi del calcio nel reticolo endoplasmatico può essere monitorata per periodi prolungati mediante campionamenti ripetuti di piccoli volumi di fluidi biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come coloranti per il calcio a bassa affinità o indicatori genetamente codificati per il calcio, è che l'omeostasi del calcio nel reticolo endoplasmatico può esse

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

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Biologia

Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Il reticolo endoplasmatico svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine ​​e di omeostasi del calcio. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare il ruolo di canali Ca2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione. Questo sistema comporta silenziamento genico mediato siRNA e cellule vive Ca2 + imaging.

Vivere Imaging calcio cella Combinato con il silenziamento del gene mediata siRNA Identifica Ca 2 + Canali di perdite nella membrana ER e nei relativi meccanismi regolatori

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Fonte: Bannai, H., et. al., Dissezione dei segnali locali di Ca2+ in cellule coltivate mediante indicatori di Ca2+ mirati alla membrana. J. Vis. Exp. (2019)Il video mostra l'imaging a fluorescenza per osservare la dinamica spontanea del calcio specifica del compartimento negli astrociti, monitorando in sequenza le proteine sensibili al calcio localizzate sulla membrana plasmatica e sul reticolo endoplasmatico.

Imaging spontaneo del calcio per la dinamica compartimentale specifica negli astrociti

Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) supporta l'analisi delle dinamiche di calcio intracellulare negozio di imaging di fluorescenza. Il metodo basa sul targeting di un carbossilesterasi ricombinante al reticolo endoplasmatico (ER), dove migliora la smascheramento locale di sintetico a bassa affinità...

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Presentiamo protocolli per l'applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER + per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K d in situ .

Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

Questo protocollo descrive un metodo semplice per analizzare segnali di calcio negli impianti generati da insetti Pentatomomorfi, come gli afidi. Thaliana di Arabidopsis trasformate con il biosensore di calcio GFP GCaMP3 consentire per l'imaging in tempo reale in vivo della dinamica del calcio con un'alta risoluzione temporale e spaziale.

Registrazione in tempo reale In Vivo di Arabidopsis segnali di calcio durante l'alimentazione dell'insetto utilizzando un biosensore fluorescente

Qui presentiamo un protocollo per Ca2 + imaging in neuroni e cellule gliali, che consente la dissezione di Ca2 + segnali a risoluzione subcellulare. Questo processo è applicabile a tutti i tipi di cellulari che permettono l'espressione di codificato geneticamente indicatori di Ca2 + .

Dissezione del locale Ca2 + segnali in cellule coltivate di targeting per membrana Ca2 + indicatori

Questo protocollo descrive un approccio per l'esecuzione dell'imaging del calcio in organoidi intestinali umani infettati da virus e offre un approccio all'analisi.

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Abbiamo stabilito un saggio di riassemblaggio della luciferasi divisa per monitorare i contatti reticolo endoplasmatico-mitocondri nelle cellule vive. Utilizzando questo saggio, descriviamo un protocollo per misurare quantitativamente il livello di questi accoppiamenti inter-organelli in cellule HEK293T, in condizioni di trattamento chimico.

Saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive

Scopri come monitorare l'omeostasi del calcio nel reticolo endoplasmatico utilizzando il reporter SERCaMP con luciferasi Gaussia. Questo metodo permette il monitoraggio in vivo nel tessuto epatico con campionamento mininvasivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un

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