Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare sperimentalmente, manipolare e coltivare innesti retinici interi provenienti da embrioni di pollo. Questo viene realizzato innanzitutto raccogliendo entrambi gli occhi da un embrione di pollo e posizionandoli in una piastra di Petri. Il secondo passaggio consiste nel rimuovere la sclera e l'epitelio pigmentato utilizzando pinzette fini.

Successivamente, l'intero espianato retinico viene sottoposto a elettroporazione con DNA plasmidico mediante elettrodi piani circolari. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare l'espianato retinico in un mezzo di coltura, in una piastra a 24 pozzetti posta in un incubatore.

Infine, gli impianti retinici vengono fissati, sezionati mediante crio-microtomia e analizzati mediante microscopia a immunofluorescenza per visualizzare i neuroni retinici. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le operazioni elettro in OVO, è che è rapida, facile da eseguire e garantisce risultati riproducibili. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo del sistema nervoso centrale, ad esempio in che modo la neurogenesi è influenzata da specifici reagenti chimici come inibitori enzimatici o prodotti genici che agiscono sul ciclo cellulare dopo l'incubazione.

Posizionare le uova all'età embrionale desiderata all'interno della cappa a flusso laminare e pulire i gusci con etanolo al 70% per evitare contaminazioni dell'embrione. Colpire con decisione il lato dell'uovo contro una superficie dura per romperlo, quindi versarne il contenuto in una piastra di Petri da 100 millimetri. Utilizzare un piccolo cucchiaio per trasferire l'embrione in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius, per evitare che il tessuto si secchi.

Successivamente, decapitare l'embrione e posizionare la piastra di Petri da 35 millimetri contenente il tessuto embrionale su un microscopio stereoscopico binoculare. All'interno della cappa a flusso laminare, utilizzare pinzette fini per praticare un'incisione attraverso la bocca, in posizione ventrale rispetto all'occhio. A partire dal sito dell'incisione, strappare il tessuto circostante l'intero occhio.

Successivamente, staccare delicatamente il nervo ottico e rimuovere l'occhio integro dalla cavità orbitaria. Raccogliere entrambi gli occhi, destro e sinistro, dallo stesso embrione per utilizzarli come occhio di controllo o occhio trattato. Utilizzare un piccolo cucchiaio per trasferire gli occhi in una nuova piastra di Petri da 35 millimetri contenente PBS preriscaldato usando pinzette fini.

Rimuovere tutti i tessuti intorno all'occhio, inclusa la sclera sulla laga. Successivamente, praticare una piccola incisione nell'epitelio pigmentato nella parte dorsale dell'occhio, avendo cura di non danneggiare la retina neurale. Quindi, strappare delicatamente l'epitelio pigmentato a partire dal punto di incisione.

Lasciare la lente e l'intera retina attaccate al corpo vitreo. Rimuovere l'epitelio pigmentato, facendo attenzione lungo il corpo ciliare intorno alla pupilla nella regione anteriore dell'occhio e lungo la fessura coroidea, poiché è difficile eliminarlo da queste sedi. Accendere l'elettrodo e impostare la tensione a 15 volt per una retina allo stadio hamburger e Hamilton 20-25 oppure a 20 volt per una retina allo stadio 26-27.

Successivamente, impostare le ripetizioni dell'impulso su cinque impulsi di 50 millisecondi di durata, con intervalli di un secondo. Utilizzare un generatore di impulsi che può essere controllato tramite un pedale a pedale sul pavimento, poiché entrambe le mani saranno necessarie per tenere ferme le elettrodi. Collegare due elettrodi in platino a forma di pala, realizzati su misura, alla presa di uscita del generatore di impulsi.

Gli elettrodi mostrati qui sono stati realizzati con una lamina di platino da 0,1 millimetro e il filo di collegamento da 0,8 millimetri era isolato. Utilizzando un tubo di plastica, trasferire con attenzione l'intero espianato retinico in un vete mediante una pipetta pastorizzata in polietilene a cui è stata tagliata l'estremità. Evitare di utilizzare le punte per pipetta poiché la retina tende ad aderire alla plastica e a strapparsi.

Successivamente, utilizzare una pipetta da 100 microlitri per rimuovere delicatamente tutto il PBS che circonda l'espianto retinico. Prestare attenzione a non toccare la retina per evitare di strapparla. Aggiungere 100 microlitri della soluzione plasmidica diluita al QVE e assicurarsi che l'intero espianto retinico sia ricoperto dalla soluzione.

Spingere delicatamente verso il basso l'espianato retinico con la pinzetta se galleggia in superficie. Utilizzare elettrodi a pinzetta per posizionare il cristallino in modo che sia rivolto verso uno qualsiasi dei lati del vete e indirizzare il nervo ottico verso il fondo del vete. Successivamente, posizionare l'elettrodo positivo davanti al cristallino e quello negativo dietro la retina, senza toccare il tessuto.

Applicare la corrente premendo il pedale e verificare la presenza di bolle agli elettrodi, segno di una scarica avvenuta con successo. Utilizzare una pipetta da 100 microlitri per rimuovere tutta la miscela di plasmidi dal qve senza danneggiare la retina. La miscela di plasmidi può essere riutilizzata da tre a cinque volte dopo la rimozione del plasmide.

Riempire il vete con PBS preriscaldato. Utilizzare la pinzetta per staccare delicatamente l'espianto retinico dalla parete del vete. Quindi utilizzare il tubo di polietilene applicato alla pipetta per trasferire l'intero espianto retinico in una piastra a 24 pozzetti contenente un millilitro di mezzo di coltura preriscaldato.

Incubare un solo espianato retinico per pozzetto nel mezzo. Incubare l'espianto retinico a 37 gradi Celsius e 5%CO2 su un agitatore rotante con una velocità costante di 50 giri al minuto. La rotazione garantisce un'esposizione massima al mezzo e impedisce l'adesione della retina al fondo della piastra a 24 pozzetti.

Dopo 24 ore di coltura, le cellule positive per GFP erano visibili in una vasta parte della retina integra, poiché l'elettroporazione aveva determinato l'assunzione del plasmide e l'espressione del gene reporter in un'ampia area retinica. Dopo la sezionatura, singole cellule positive per GFP sono state facilmente rilevate lungo l'asse basale ACO della retina. L'intero espianato retinico può essere coltivato per circa altre 24 ore.

I tempi di incubazione possono provocare ritardi nello sviluppo, malformazioni morfologiche, apoptosi e, infine, disintegrazione della retina. Una sezione di un'espianazione retinica intera coltivata per 24 ore è stata sottoposta a immunomarcatura con fosfo-istone tre, visibile qui nel canale rosso; il fosfo-istone tre etichetta le cellule in fase tarda della G2 e della metafase. Le cellule positive per l'istone fosforilato (pH3) si trovavano sul lato apicale della retina, in accordo con lo sviluppo retinico normale.

Come mostrato qui, questo sviluppo può essere bloccato aggiungendo un inibitore della CDK1/2; l'incubazione con l'inibitore per quattro ore prima dell'acquisizione delle immagini ha ridotto in modo significativo il numero di cellule positive per pH3 nella retina dopo il suo sviluppo. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per indagare l'espressione genica da nuovi plasmidi di DNA e per trattare espianti retinici con reagenti chimici, inclusi regolatori della via del danno al DNA e del ciclo cellulare. Dopo questa procedura, altri metodi come le elettroporazioni in ovo possono essere eseguiti per confermare ulteriormente i risultati.