Name: A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri un metodo semplice per propagare cellule staminali pluripotenti umane su gelatina utilizzando mezzo condizionato da placenta umana. Questa tecnica elimina la necessità di substrati sintetici.

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Gli autori desiderano ringraziare Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Professore Associato, Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, Medical College Korea University) per la fornitura di tessuto placentare. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni (R1211902) dal National Research Foundation di Corea (NRF), Repubblica di Corea.

Etica dichiarazione: Lo studio è stato condotto placenta umana prospetticamente, con l&#39;approvazione del Institutional Review Board per la ricerca umana della University Korea (AN09085-001). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in un Germ-Free Clean facility in camera presso il Medical Center Korea University. Il design e le procedure che utilizzano hPSCs sperimentale sono state approvate dal Institutional Review Board della Korea University Medical Center (AN12277-003). 1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti <ol><li> Coat tutti i piatti della cultura con il 0,1% di gelatina. Salino Autoclave tampone fosfato (PBS) e pinze. Sterilizzare forbici chirurgiche, tubi microcentrifuga, e garze a 121 ° C sotto £ 15 psi per più di 15 min. </li><li> 0,25% tripsina-etilene ammina tetra-acetico preparati pre-riscaldato (tripsina-EDTA) e mezzi di pre-riscaldato cultura filtrato (DMEM) contenente siero bovino fetale 20% (FBS), 100 U / ml di penicillina, e 100 g / ml streptomycin prima di iniziare le procedure. </li></ol> 2. Isolamento delle cellule da placenta umana <ol><li> Ottenere tessuto placentare, dopo il parto cesareo, da parte delle donne sane in gravidanza normale fase di aborto o terapeutico a 7-32 settimane di gestazione dopo aver ottenuto il consenso informato scritto. </li><li> Hanno lo specialista ostetrico placenta umana piastre coriali chirurgicamente separati (HPC) dalla placenta; incubare questi in 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C per 20 minuti, e poi lavare con 5 ml di PBS. </li><li> Isolare villi coriali da HPC con le forbici; Tritare i villi e lavarli tre volte con 1 ml di PBS. Dopo macinazione, posizionare i villi coriali in una provetta per microcentrifuga con un puntale; lavare i campioni con 500 microlitri di PBS pipettando su e giù, e centrifugare le provette per 120 xg per 3 min. Lavare tessuti due volte con 500 ml di terreno di coltura pre-riscaldata. </li><li> Cellule culturali in media su piastre di gelatina rivestite a 37 ° C, in 5% di CO 2 </sub&gt;, e sotto il 95% di umidità. Pre-coat tutti i piatti con lo 0,1% di gelatina per 1 ora a 37 ° C. Le colonie di cellule fibroblasto-simili formeranno e crescita aderente circa 5-7 giorni dopo l&#39;inizio cultura nello stesso mezzo. </li><li> Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni fino al terzo passaggio. Durante la coltura, rimuovendo detriti cellulari galleggianti nel mezzo di coltura; crescita fibroblasti placentari si attaccheranno alla piastra. Coltivare le cellule di fibroblasti, come derivati ​​dal HPC fino al 10 ° passaggio e poi li raccolgono per le culture hESC dopo tripsinizzazione e mitomicina-C (10 mg / ml) trattamento. </li><li> Prima di congelamento HPC come campioni azionari, utilizzare trascrizione inversa-polymerase chain reaction (RT-PCR) per confermare che HPC non sono contaminati da agenti patogeni che normalmente infettano la placenta, tra cui micoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginina, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,e M. capricolum) e le specie batteriche, Ureaplasma urealyticum, utilizzando un kit di rilevamento micoplasma. <ol><li> Seguire le istruzioni del produttore per effettuare RT-PCR, utilizzare tutte primer e miscele fornite nel kit. Utilizzare il surnatante delle cellule che sono state coltivate per 36 giorni per la rilevazione micoplasma. Aggiungere 3 ml di questi campioni per le miscele PCR ed eseguire la procedura 1 st PCR per 35 cicli, ciascuno costituito da 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 2 min, e 72 ° C per 1 min. </li><li> Aggiungere con cautela 0,5 ml di 1 ° prodotto PCR alla miscela PCR ed eseguire la procedura 2 ° PCR per 30 cicli usando le stesse condizioni di prima. Analizzare i prodotti amplificati di 1% gel di agarosio; applicare 10 ml di ogni del 1 ° e 2 ° prodotti di PCR per i gel. </li></ol></li><li> Se HPC si trovano ad essere contaminati da agenti patogeni, eliminarliutilizzando una combinazione di antibiotici (BM-ciclina), seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere un nuovo terreno contenente 10 mg / ml di BM-ciclina 1 per 3 giorni, e poi trattare le cellule con 5 mg / ml BM-ciclina 2 per altri 4 giorni. Ripetere questo ciclo per due volte e quindi verificare la presenza di contaminazione da micoplasma di nuovo. </li></ol> 3. Cellule raccolta umana Placenta derivati ​​condizionata Media (hPCCM) <ol><li> Dopo aver escluso contaminazione, trattare le cellule attaccate (85-90% di confluenza, (1,5 × 10 7 cellule / fiasco) con mitomicina-C (10 ug / ml) per 2 ore e 30 minuti, e le cellule lavate tre volte con 10 ml PBS. Incubare le cellule con mezzo di pre-riscaldato senza mitomicina-C per 24 ore. </li><li> Un giorno dopo il trattamento, incubare cellule in 10 ml di mezzo (DMEM-F12 integrato con il 20% di knock-out siero sostituzione [KOSR], 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 1% NEAA, e l&#39;1% di penicillina-streptomicina). Dopo 24 ore di incubazione, il raccolto CM in un tubo da 15 ml efiltrata del CM con un filtro siringa da 0,22 micron. </li><li> Aggiungere altri 10 ml di nuovi media e di incubazione. Raccogliere tutte surnatanti dalle culture ogni giorno per 1 settimana e congelare il medium raccolto a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. </li></ol> 4. Cellule Cultura di staminali embrionali umane (hESC) e induzione di cellule staminali pluripotenti (iPSCs) <ol><li> Ottenere linee di cellule staminali embrionali umane, H1 e H9 cellule (elencati nel Registro NIH hESC con il nome di WA01 e WA09, rispettivamente) e di cellule staminali indotte pluripotenti-IPSC-1: iPS (prepuzio) -1 e IPSC-2 (IISH1i- BM) dal Research Institute WiCell (Madison, WI, USA). Le cellule devono essere scongelati e coltivate seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Per il gruppo di controllo, le cellule di coltura su piatti matrice di membrana basale rivestite in diffuso mezzo di coltura definito senza siero-libero-alimentazione e a 37 ° C e in 5% di CO 2. Inizialmente, sementi 80-100 ciuffi di hPSCs in 35 mm piatti. Crescere cellule in questi piatti fino a 70-80% di confluenza e di routine cellule passaggio per sub-coltura una volta ogni 5-6 giorni, con metodi meccanici o enzimatici (dispasi). Lavare le cellule due volte con terreno e li piastra in un rapporto di 1: 4. Sostituire il supporto con terreno fresco ogni giorno. </li><li> Per i gruppi sperimentali, le cellule di coltura in hPCCM sui piatti pre-rivestite con 0,1% di gelatina e di eseguire passaging di routine una volta ogni 5 giorni, sia meccanicamente o enzimatica. Cellule piastra a rapporti nella gamma di 1: 6-1: 10. hPSCs allegare alla gelatina entro 2 giorni dopo il trasferimento. Sostituire il supporto con terreno fresco tutti i giorni. </li></ol> 5. Caratterizzazione di cellule staminali pluripotenti umane NOTA: Caratterizzare hPSCs utilizzando diversi metodi, come la colorazione fosfatasi alcalina, immunocitochimica, quantitativa real-time PCR (qRT-PCR), e western blotting. <ol><li> Immunofluorescenza <ol><li> Per immunofluorescence di colorazione, hPSCs cultura e fissare le cellule nelle camere di scorrimento 8 pozzetti con il 4% (w / v) paraformaldeide per 10 minuti; poi, le cellule permeabilizzate con 0,1% (v / v) Triton-X100 per 15 min, e bloccare le cellule per 1 ora con 3% (v / v) di siero di cavallo normale in PBS contenente 0,1% (v / v) Tween- 20. Lavare PBS due volte per 5 minuti tra ogni passo. </li><li> Incubare le cellule con l&#39;anticorpo primario (ottobre-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, diluizione di 1: 1.000) O / N a 4 ° C e con l&#39;anticorpo secondario. </li><li> Prima del montaggio, incubare le cellule con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti al buio. Lavare le cellule rigorosamente tre volte per 5 minuti ciascuno e secche cellule completamente, nel buio. Conservare le cellule in mezzo di montaggio fluorescenza e osservarli al microscopio a fluorescenza. </li></ol></li><li> qRT-PCR <ol><li> Isolare RNA totale da cellule utilizzando un kit RNeasy mini secondo le specifiche del produttore e quantificare l&#39;RNA estratto utilizzando un Nano goccia spettrofotometro. </li&gt; <li> Sintetizzare cDNA aggiungendo 2 ug di RNA totale per un oligo contenente 20 microlitri miscela di reazione (dT) primer e Superscript II trascrittasi inversa; seguire le istruzioni del produttore in questa procedura. </li><li> Amplificare il cDNA sintetizzato con un sistema iQ Bio-Rad iCycler, utilizzando iQ SYBR Green qPCR Master Mix e le sequenze di primer descritti nella tabella di riferimento S1. Normalizzare i valori di soglia ciclo dei geni di interesse a quelli di deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH). </li></ol></li><li> La fosfatasi alcalina (AP) colorazione <ol><li> Rilevare l&#39;attività AP utilizzando il cellulare ES Caratterizzazione Kit, secondo il protocollo del produttore. </li><li> Il giorno 5, aspirare i media e fissare i hPSCs con paraformaldeide al 4% in PBS per 12 min. Non overfix; fissa cellule per più di 2 min comporterà l&#39;inattivazione di fosfatasi alcalina. Aspirare il fissativo e lavare con 1x Sciacquare tampone. Noni pozzetti si asciughino tra i passaggi. </li><li> Aggiungere soluzione colorante sufficiente a coprire ogni pozzetto (1 ml per pozzetto di un piatto da 35 mm). Incubare le piastre al buio a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare i piatti con 1x Sciacquare tampone. Celle di copertura con PBS 1x per prevenire l&#39;essiccazione ed esaminare e immagine le cellule colorate utilizzando un microscopio Olympus. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Eseguire l&#39;analisi western blot come descritto in precedenza in 9. In breve, determinare le concentrazioni di proteine ​​in lisati cellulari. Risolvere uguali quantità di proteine ​​su un gel elettroforesi solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) gel di sodio dodecil e trasferire le proteine ​​su un fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana. </li><li> Bloccare la macchia e la sonda è O / N con anticorpi primari diversi a 4 ° C; successivamente incubare la macchia con anticorpi secondari HRP-coniugati per 1 ora. Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti ogni volta tra incubazione. Rileva segnali mediante un reagente ECL. </li&gt; </ol></li><li> Short Tandem Repeat (STR) Analisi <ol><li> hPSCs sono state raccolte dal controllo e gruppi sperimentali allo stesso passo. DNA genomico è stato estratto utilizzando un kit Micro DNA, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Amplificare il DNA genomico per 16 loci genetici diversi utilizzando il kit CF / STR PCR amplificazione, secondo le specifiche del produttore e elettroforesi capillare è stata effettuata utilizzando un analizzatore genetico. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).</li>
<li>Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itskovitz-Eldor+Feeder+layer+and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
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<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+human+placenta+as+a+source+of+the+universal+feeder+in+human+and+mouse+pluripotent+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture.</a> Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).</li>
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<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li>
<li>Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+differentiation+of+stem+cells+mesenchymal+progenitors+by+inhibition+of+TGF-beta%2Factivin%2Fnodal+using+SB-431542%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542.</a> J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).</li>
</ol>

Gli autori indicano conflitti di interesse.

Questo modello è stato sviluppato per propagare successo hPSCs, pur mantenendo le loro caratteristiche, in condizioni di coltura privo di alimentazione umanizzati senza aggiunta di esogeni fattori di crescita ricombinanti come bFGF o insulina, consentendo la manipolazione di hPSCs in un microambiente umanizzato. Supplementazione esogena bFGF è comune e l&#39;applicazione di substrati come Matrigel o laminina è essenziale per la coltura senza alimentatore di hPSCs 14. Questo protoc...

L'obiettivo di questo protocollo è la propagazione di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in condizioni completamente umanizzate ex vivo prive di feeder, senza richiedere ulteriori supplementazioni esogene e substrati sintetici. Ad oggi, lo sviluppo di modelli di coltura di hPSC ex vivo, che consentono l'introduzione di prodotti di coltura in clinica, è stata una delle principali preoccupazioni nella ricerca sulle cellule staminali. In particolare, è necessario affrontare due problemi critici. In primo luogo, è necessario un sistema di coltura ex vivo umanizzato per la propagazione delle hPSC che ovvi al rischio di contaminazione da prodotti cellulari animali. In secondo luogo, è necessario un modello di coltura senza alimentatore per facilitare la produzione di massa facile ed economica di hPSC. Per le applicazioni terapeutiche delle hPSC, è necessario identificare i fattori che ne regolano l'auto-rinnovamento e la differenziazione.
Poiché Xu et al. hanno inizialmente riportato la fattibilità dell'utilizzo di terreni condizionati (CM) derivati da fibroblasti embrionali di topo (MEF) per far crescere hESC su Matrigel1, molti studi hanno esaminato metodi di propagazione ex vivo ottimali per hPSCs2-4. Tuttavia, non è stato sviluppato un sistema di propagazione ideale di hPSC umanizzato ex vivo senza feeder perché i metodi attuali richiedono substrati esogeni aggiuntivi tra cui bFGF e insulina, noti fattori che sostengono l'hPSC, nei terreni di coltura5-7. Inoltre, substrati sintetici come il Matrigel o la laminina sono utilizzati in tutte le colture prive di alimentatore.
Il razionale alla base dello sviluppo e dell'uso di questo protocollo si basa sui nostri studi precedenti che dimostrano che le cellule del corion della placenta umana supportano in modo eccellente la propagazione delle hPSC senza l'integrazione di bFGF8-11. Questo protocollo presenta una serie di vantaggi, tra cui la sua semplicità di manipolazione e il suo rapporto costo-efficacia, ed è una coltura umanizzata quasi perfetta che consente la propagazione dell'hPSC senza substrati sintetici esogeni. L'applicazione del CM derivato dalla placenta umana (hPCCM) per le hPSC prevede 3 fasi. In primo luogo, le cellule del corion vengono isolate dalla placenta umana e coltivate. In secondo luogo, l'hPCCM è prodotto da cellule in coltura. In terzo luogo, le hPSC vengono coltivate utilizzando hPCCM e le loro caratteristiche sono confermate. 
Questo protocollo faciliterà le applicazioni cliniche delle hPSC e gli studi sui meccanismi di proliferazione e attaccamento delle hPSC. In questo articolo, viene presentato il protocollo per la propagazione di hPSCs in hPCCM su un piatto rivestito di gelatina.

<table><tbody><tr><td>Mitomicina-C</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>M4287</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>kit di rilevamento di micoplasma</td><td>TaKaRa Bio Inc.</td><td>#6601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>#354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>#05850</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02100</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>G2500</td><td>0,10%</td></tr><tr><td>BM-Ciclina</td><td>Roche</td><td>799 050</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>RNeasy mini kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro a nano goccia</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Mix master qPCR verde&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>#170-8882AP</td><td></td></tr><tr><td>ES Kit di caratterizzazione cellulare</td><td>Chemicon International, Inc.,</td> <td>SCR001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi del cDNA di potenza&nbsp;</td><td>iNtRON Biotecnologia</td><td>25011</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&reg; Kit DNA Micro</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>AmpF/STR&reg; Identificatore&reg; Kit di amplificazione per PCR</td><td>Applied Biosystems Inc.</td><td></td><td></td>4322288</tr><tr><td>Applied Biosystems&reg; Analizzatore genetico 3130xl&nbsp;</td><td>Biosistemi applicati Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel cultura modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su gelatina in media placenta condizionata

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

La propagazione di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in terreno condizionato derivato da cellule umane in condizioni di coltura senza alimentatore è stata di interesse. Tuttavia, non è stato sviluppato un metodo di propagazione ideale ex vivo ex vivo senza feeder per le hPSC; attualmente, ulteriori substrati esogeni, tra cui il fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF), un fattore principale che sostiene l'hPSC, vengono aggiunti a tutti i terreni di coltura e substrati sintetici come Matrigel o laminina vengono utilizzati in tutte le colture prive di alimentatore. Recentemente, il nostro gruppo ha sviluppato un protocollo semplice ed efficiente per la propagazione delle hPSC utilizzando solo terreni condizionati derivati dalla placenta umana su un piatto rivestito di gelatina senza supplementazione esogena aggiuntiva o substrati sintetici specifici per le hPSC. Questo protocollo non è stato riportato in precedenza e potrebbe consentire ai ricercatori di propagare le hPSC in modo efficiente in condizioni di coltura umanizzata. Inoltre, questo modello ovvia ai rischi di contaminazione da hPSC da parte di prodotti animali come virus o proteine sconosciute. Inoltre, questo sistema facilita la facile produzione di massa di hPSC utilizzando il rivestimento in gelatina, che è semplice da maneggiare, riducendo drasticamente i costi complessivi della manutenzione ex vivo dell'hPSC.

Un vantaggio di questo metodo di propagazione HPSC è che utilizza componenti secreti dalle cellule umane. Un passo più ciritical nel protocollo è l&#39;isolamento e la coltura di cellule derivate da placenta umana. Ciò richiede ed accurata dissezione da una parte precisa di HPC piastra villi. La Figura 1 mostra la procedura per l&#39;isolamento delle cellule derivate placenta umana. Questo processo è semplice e conveniente per l&#39;isolamento delle cellule, e può essere facilmente eseguita entro 1 ora....

Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficiente per propagare le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando solo terreni condizionati derivati dalla placenta umana in un piatto rivestito di gelatina senza ulteriori supplementazioni esogene o substrati sintetici specifici per hPSC.

A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è descrivere come produrre in massa cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un rivestimento semplice ed economico a base di gelatina. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando il villi coriali VII da tessuti placentari umani, e successivamente tritando i villi in piccoli frammenti di tessuto come secondo passaggio. I frammenti di tessuto vengono coltivati su piastre rivestite con gelatina, dove formano colonie di cellule aderenti simili a fibroblasti nell'arco di cinque-sette giorni, e vengono quindi utilizzati per produrre un mezzo condizionato per la coltura di cellule staminali pluripotenti umane.Successivamente, da 80 a 100 aggregati di cellule staminali pluripotenti umane vengono seminati in mezzo condizionato derivato da cellule della placenta umana e sottoposti a subcoltura ogni quattro-cinque giorni. I risultati mostrano una differenziazione e un'adesione cellulari simili tra le cellule coltivate nelle condizioni considerate standard d'oro e quelle coltivate con il metodo qui descritto su piastre rivestite di gelatina in mezzo condizionato da placenta umana. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo tradizionale è che utilizza componenti secreti da cellule umane senza richiedere supplementazione esogena aggiuntiva né tratti sintetici morbidi.Per iniziare, rivestire le piastre di coltura T 25 con cinque millilitri di una soluzione di gelatina allo 0,1% per un'ora a 37 gradi Celsius, quindi sterilizzare 500 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato, una pinza, forbici chirurgiche, provette da microcentrifuga e garza mediante autoclave a 121 gradi Celsius sotto 15 libbre per pollice quadrato per più di 15 minuti. Successivamente, preriscaldare il DMEM sterile filtrato contenente siero fetale bovino al 20%, 100 unità per millilitro di penicillina e 100 grammi per millilitro.Streptomycin ottiene chirurgicamente piastre corioniche di placenta umana separate, raccolte da donne sane in gravidanza tra la settima e la trentaduesima settimana di gestazione. Dopo aver ottenuto il consenso informato scritto, lavare le piastre con cinque millilitri di PBS utilizzando un paio di forbici. Isolare il corionico VII dalle piastre corioniche di placenta umana e tritare il tessuto in piccoli pezzi.Quindi lavare i pezzi di tessuto tre volte utilizzando un millilitro di PBS per ogni risciacquo, trasferire il VII tritato in una provetta da microcentrifuga e utilizzare una pipetta per lavare i campioni con 500 microlitri di PBS, aspirando e dispensando delicatamente su e giù. Quindi centrifugare la provetta a 120 G per tre minuti per raccogliere il tessuto tritato. Lavare il tessuto altre due volte con 500 microlitri di mezzo di coltura preriscaldato, ripetendo ogni volta la centrifugazione.Eseguire un passaggio tra ogni lavaggio della coltura, quindi seminare il tessuto tritato e il mezzo sui piatti rivestiti con gelatina preparati in precedenza, a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo circa cinque-sette giorni di coltura nello stesso mezzo, si possono osservare formazioni di colonie simili a fibroblasti in crescita aderente dopo sette giorni. Scambio della coltura.Il mezzo di coltura deve essere sostituito rimuovendo eventuali detriti cellulari in sospensione, poiché i fibroblasti placentari in crescita si attaccano alla piastra; continuare a sostituire il mezzo ogni due o tre giorni fino alla terza passaggiazione. Le cellule di tipo fibroblastico ottenute dalle placche corioniche della placenta umana possono essere mantenute fino alla 10ª passaggiazione. Successivamente, raccoglierle mediante tripsina per essere utilizzate come campioni di riserva per colture di cellule staminali pluripotenti umane, dopo aver escluso contaminazioni, come descritto nel protocollo testuale allegato, utilizzando un milione di cellule (1 × 10⁷) in una fiasca da coltura T75 e coltivando le cellule a 37 °C e 5% CO₂ fino a raggiungere una confluenza dell’85-90%.Trattare le cellule aderenti con 10 microgrammi per millilitro di mitomicina C per due ore e mezza, quindi lavare le cellule tre volte con 10 millilitri di PBS preriscaldato. Successivamente, incubare le cellule in mezzo preriscaldato senza mitomicina C per 24 ore, un giorno dopo il trattamento. Sostituire il mezzo sulle cellule con 10 millilitri di Dmf.12 ml di mezzo integrato con il 20% di un sostituto del siero, 0,1 millimolare di beta-mercaptoetanolo, 1% di NEAA e 1% di penicillina-streptomicina. Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere il mezzo condizionato in un tubo conico da 15 millilitri e filtrarlo utilizzando un filtro a siringa da 0,22 micron. Quindi aggiungere altri 10 millilitri di mezzo fresco alle cellule e continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Raccogliere tutti i soprannatanti dalle colture ogni giorno per una settimana e congelare il mezzo raccolto a meno 80 gradi Celsius. Congelare il mezzo in un nuovo contenitore ogni volta. Per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, ottenere una linea di cellule staminali embrionali umane come la linea H1 e iniziare la coltivazione seguendo le istruzioni del produttore per la coltura dei gruppi sperimentali.Le stesse cellule su piastre rivestite con gelatina 0,1% in coltura cellulare derivata dalla placenta. Mezzo, eseguire un confezionamento di routine ogni cinque giorni utilizzando metodi di confezionamento meccanici standard. Passaggi le cellule di controllo da uno a quattro e il gruppo sperimentale da uno a sei e da uno a dieci.Sostituire il mezzo con mezzo fresco ogni giorno, a partire dal giorno due. Le linee di cellule staminali pluripotenti umane possono essere mantenute su piastre rivestite con Gelatina 0,1% in un mezzo di coltura derivato da cellule della placenta umana, a un livello simile a quello osservato per le cellule mantenute in una coltura tipica di cellule staminali.Mezzo su piastre rivestite con matrice della membrana basale per confermare che il mezzo di coltura cellulare derivato dalla placenta umana fosse compatibile con altre matrici. Le cellule staminali sono state sottocultivate su piastre rivestite con laminina, vitro nin e non rivestite. Le cellule si sono attaccate e sono cresciute sulle piastre rivestite con laminina e vitro nin.Tuttavia, dopo diversi passaggi, molte colonie si sono differenziate. A differenza di quelle del gruppo con rivestimento di gelatina. Dopo il trasferimento in piastre non rivestite, non è stata osservata alcuna adesione per le cellule staminali.Le linee cellulari H one e IPSE mostrate qui sono state coltivate per 10 passaggi in condizioni sperimentali. Dopo due settimane, hanno formato corpi embrionali contenenti mesoderma, ectoderma ed endoderma, come misurato mediante colorazione immunofluorescente dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali umane per esplorare applicazioni cliniche.Poiché questo metodo, ovata non contaminazione con prodotto animale.

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