Caspasi-3 L'attività nel ratto amigdala Misurato da Spettrofluorimetria dopo infarto miocardico

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività della caspasi-3 nell'amigdala del ratto dopo un infarto miocardico, utilizzando la spettrofluorometria. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze comportamentali, come le conseguenze di un infarto miocardico sulle prestazioni cognitive, sulla salute mentale, sul processo di invecchiamento e sul sonno. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è semplice, rapida e affidabile.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché richiede destrezza chirurgica e per il prelievo di campioni di tessuto. A dimostrare la procedura sarà Kim Gilbert, assistente di ricerca nel nostro laboratorio. Dopo aver indotto l'anestesia secondo i protocolli istituzionali approvati, verificare l'adeguata anestetizzazione attraverso l'assenza del riflesso alla compressione della zampa.

Intubare il ratto con un tubo endotracheale e posizionare l'animale in posizione prona su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius. Collegare il tubo endotracheale a un macchinario per anestesia che eroga isoflurano al 2%. Successivamente, preparare il sito chirurgico con clorhexidina gluconato e alcol isopropilico.

Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione. Posizionare un telo sterile sull'animale per creare un campo sterile intorno al sito chirurgico. Posizionare gli strumenti chirurgici sterili necessari su un altro campo sterile accanto all'animale.

Successivamente, praticare un'incisione nella pelle con una lama da bisturi n. 10 o con delle forbici. Utilizzare le forbici o una pinza emostatica per rimuovere il tessuto muscolare. Quindi usare le forbici o una pinza emostatica per aprire la parete toracica e posizionare il retrattore toracico, e aprire il pericardio con la pinza emostatica.

Per indurre l'occlusione coronarica, passare prima un filo di seta 4-0 lungo 360 millimetri attorno all'arteria coronaria discendente e attraverso il tessuto miocardico contiguo. Inserire entrambe le estremità del filo di seta in un tubo di plastica da 14 gauge lungo 1,25 centimetri. Tirare entrambe le estremità del filo di seta e spingere il tubo verso il basso contro l'arteria per occluderla.

Fissare l'occlusione stringendo il tubo di plastica con una pinza emostatica e mantenere l'occlusione per 40 minuti. Dopo 40 minuti, rilasciare l'occlusione rimuovendo prima la pinza emostatica, poi il tubo flessibile e il filo di seta. Chiudere il torace con due punti di sutura zero e inserire un catetere flessibile attraverso la cavità toracica, aspirando l'aria dal torace mediante una siringa da 10 millilitri per prevenire il pneumotorace.

Cucire il muscolo con un punto di sutura in seta 0 e la pelle con un punto di sutura in seta 3/0. Prima di chiudere l'ultimo punto di sutura cutaneo, aspirare nuovamente l'aria dalla cavità toracica utilizzando una siringa da 10 millilitri e un catetere. Completare la chiusura della pelle e quindi interrompere l'isoflurano.

Posizionare il ratto in una gabbia pulita e monitorare durante il recupero dall'anestesia. Somministrare analgesia con dosi ripetute ogni otto ore. Dopo aver decapitato umanamente l'animale secondo le procedure approvate, posizionare la testa del ratto su una piastra posta su ghiaccio tritato.

Utilizzare le forbici per aprire il cranio. Quindi utilizzare le rongeur per staccare le lamine ossee senza mutilare il tessuto sottostante, tirando verso l'alto. Successivamente, posizionare il bordo piatto di una spatola tra la parte inferiore del cranio e la superficie ventrale posteriore del cervello e staccare il cervello dal cranio spingendo delicatamente la lama in avanti, sollevando il cervello fuori dal cranio.

Posizionare il cervello sulla sua superficie dorsale. Individuare l'ipotalamo davanti al cervelletto e tagliare il cervello in senso coronale davanti all'estremità posteriore dell'ipotalamo e anche dietro all'estremità anteriore. Individuare le amigdale bilaterali come due piccole sfere al di sotto dei lobi temporali, subito adiacenti all'ipotalamo.

Quindi capovolgere il cervello appiattendolo sull'estremità frontale, con la superficie dorsale rivolta lontano dall'operatore. Successivamente, separare gli emisferi e rimuovere la corteccia dall'amigdala continua. Quando l'amigdala è visibile, asportarla con un bisturi.

Tagliare lungo la sutura scura che attraversa l'amigdala per separare le parti basolaterale e mediale centrale, quindi posizionare le due parti in tubi etichettati separati e metterli sul ghiaccio. Questo passaggio deve essere eseguito il più rapidamente possibile per prevenire il deterioramento degli enzimi. Dopo aver ripetuto la procedura di dissezione con l'emisfero opposto, immergere tutti e quattro i vial nell'azoto liquido per un minuto, quindi conservarli nel congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Iniziare aggiungendo 150 microlitri di buffer di lisi a ogni campione di cinque-dieci milligrammi su ghiaccio. Sottoporre ogni campione a sonicazione su ghiaccio a intensità massima per cinque secondi. Successivamente, incubare sul ghiaccio per 30 minuti.

Durante l'incubazione, vortexare il campione per cinque secondi ogni cinque minuti. Successivamente, eseguire tre cicli di congelamento-scongelamento posizionando i campioni alternativamente in azoto liquido e su una piastra riscaldante termostatata impostata a 37 gradi Celsius. Dopo l'ultimo ciclo di congelamento-scongelamento, centrifugare i campioni di tessuto a 1300 G a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Successivamente, aspirare con attenzione il soprannatante e trasferirlo in una provetta fresca posta sul ghiaccio. Dopo aver quantificato le proteine seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto, aggiungere 25 microgrammi di proteina in una provetta da reazione contenente 0,8 microlitro di Ac-DEVD-AMC 10 millimolare e tampone di reazione, per un volume finale di 200 microlitri. Per i campioni di reazione negativi, combinare 25 microgrammi di proteina con un microlitro di Ac-DEVD-CHO 800 micromolare e 0,8 microlitri di Ac-DEVD-AMC 10 millimolare.

Incubare tutti i campioni e i controlli al buio per tre ore a 37 gradi Celsius. Al termine del periodo di incubazione, arrestare la reazione aggiungendo 600 microlitri di glicina 0,4 molare e idrossido di sodio 0,4 molare a pH 10 a ciascun campione e controllo. Aggiungere due millilitri di acqua distillata a ciascuna reazione in una cuvetta di vetro.

Quantificare la fluorescenza mediante spettrofluorometria. Leggere i controlli e i campioni per 10 secondi con una lettura ogni secondo. Infine, quantificare l'attività specifica in ciascun campione secondo la formula ora mostrata a schermo.

Questo istogramma mostra l'attività della caspasi-3 nell'amigdala di ratti sottoposti a infarto miocardico. I dati sono espressi come percentuale dell'attività media nei controlli fittizi, impostata al 100%. Ogni gruppo era composto da otto ratti. L'asterisco indica una differenza significativa tra i gruppi con un valore p inferiore a 0,05.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore, escluso l'intervallo tra l'intervento chirurgico per infarto miocardico e il prelievo del tessuto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre un infarto miocardico in un ratto e misurare l'attività della caspasi-3 nell'amigdala del ratto mediante spettrofluorometria.