Caspasi-3 L'attività nel ratto amigdala Misurato da Spettrofluorimetria dopo infarto miocardico

'infarto del miocardio (MI) non è solo seguito da una compromissione della funzione cardiaca, ma anche da apoptosi nell'amigdala, una regione del cervello coinvolta nelle conseguenze comportamentali dell'infarto miocardico. Questo protocollo descrive come indurre l'infarto miocardico, raccogliere il tessuto dell'amigdala e misurare l'attività della caspasi-3, un marcatore di apoptosi.

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività della caspasi-3 nell'amigdala di ratto dopo un infarto del miocardio utilizzando la spettrofluorimetria. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo delle scienze neurali comportamentali, come le conseguenze di un infarto del miocardio sulle prestazioni cognitive, sulla salute mentale, sul processo di invecchiamento e sul sonno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, rapida e affidabile.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avrebbero difficoltà perché richiede la destrezza per la chirurgia e il campionamento dei tessuti. A dimostrare la procedura sarà Kim Gilbert, assistente di ricerca nel nostro laboratorio. Dopo aver indotto l'anestesia secondo i protocolli istituzionali approvati, confermare la corretta anestesia attraverso l'assenza del riflesso di pizzicamento della zampa.

Intubare il ratto con un tubo endotracheale e posizionare l'animale in posizione di decubito ventrale su un termoforo per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius. Collegare il tubo endotracheale a una macchina per anestesia che eroga isofluorano al 2%. Successivamente, preparare il sito chirurgico con clorexidina gluconato e alcol isopropilico.

E applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza. Posizionare un telo sterile sull'animale per creare un campo sterile attorno al sito chirurgico. E posizionare gli strumenti chirurgici sterili necessari su un altro campo sterile accanto all'animale.

Quindi, incidi la pelle con una lama di bisturi numero 10 o con le forbici. Usa le forbici o un morsetto emostatico per staccare il tessuto muscolare. Quindi utilizzare le forbici o una pinza emostatica per aprire la parete toracica e posizionare il divaricatore toracico, quindi aprire il pericardio con la pinza emostatica.

Per indurre l'occlusione coronarica, prima avvolgere una sutura di seta a quattro zero lunga 360 millimetri attorno all'arteria coronaria discendente e attraverso il tessuto miocardico contiguo. Inserire entrambe le estremità della sutura di seta in un tubo di plastica lungo 14 gauge 1,25 centimetri. Tirare entrambe le estremità della sutura di seta e spingere il tubo verso il basso contro l'arteria per occluderla.

Fissare l'occlusione bloccando il tubo di plastica con una pinza emostatica e mantenere l'occlusione per 40 minuti. Dopo 40 minuti, rilasciare l'occlusione rimuovendo la pinza emostatica e poi il tubo flessibile e la sutura di seta. Chiudere il torace con due punti zero e posizionare un catetere flessibile attraverso la cavità toracica e aspirare l'aria dal torace con una siringa da 10 millilitri per prevenire lo pneumotorace.

Cucire il muscolo con sutura di seta a quattro zero e la pelle con sutura di seta a tre zero. Prima di chiudere l'ultima sutura cutanea, aspirare nuovamente l'aria dal torace utilizzando la siringa da 10 millilitri e il catetere. Terminare la chiusura della pelle e poi interrompere l'isofluorano.

Metti il ratto in una gabbia pulita e monitoralo durante il recupero dall'anestesia. Somministrare analgesia con dosi ripetute ogni otto ore. Dopo aver decapitato umanamente l'animale secondo le procedure approvate, posizionare la testa del topo su un piatto posto su ghiaccio tritato.

Usa le forbici per aprire il teschio. Quindi utilizzare i rongeurs per staccare i covoni ossei senza mutilare il tessuto sottostante tirando verso l'alto. Quindi, posiziona la lama piatta di una spatola tra la parte inferiore del cranio e la superficie ventrale posteriore del cervello e stacca il cervello dal cranio spingendo delicatamente la lama in avanti, sollevando il cervello dal cranio.

Posiziona il cervello sulla sua superficie dorsale. Identificare l'ipotalamo davanti al cervelletto e tagliare il cervello coronalmente davanti all'estremità posteriore dell'ipotalamo e anche dietro l'estremità anteriore. Identifica l'amigdala bilaterale come due piccole sfere sotto i lobi temporali proprio accanto all'ipotalamo.

Quindi capovolgere il cervello sulla sua estremità frontale con la superficie dorsale lontana dallo sperimentatore. Quindi, separa gli emisferi e rimuovi la corteccia dall'amigdala continua. Quando l'amigdala è rivelata, taglia via l'amigdala con un bisturi.

Tagliare lungo la sutura scura che attraversa l'amigdala per separare le parti mediali basolaterali e centrali, quindi posizionare le due parti in tubi separati etichettati sul ghiaccio. Questo passaggio deve essere fatto il più velocemente possibile per prevenire il deterioramento degli enzimi. Dopo aver ripetuto la procedura di dissezione con l'altro emisfero, immergere tutte e quattro le fiale in azoto liquido per un minuto e poi conservare nel congelatore a 80 gradi Celsius negativi.

Iniziare aggiungendo 150 microlitri di tampone di lisi a ciascun 5-10 milligrammi di campione su ghiaccio. Sonicare ogni campione sul ghiaccio alla massima intensità per cinque secondi. Quindi incubare su ghiaccio per 30 minuti.

Durante l'incubazione, agitare il campione per cinque secondi ogni cinque minuti. Quindi, eseguire tre cicli di congelamento-scongelamento posizionando i campioni alternativamente in azoto liquido e su una piastra riscaldante controllata termostaticamente impostata a 37 gradi Celsius. Dopo il ciclo finale di congelamento e scongelamento, centrifugare i campioni di tessuto a 1300 g a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi, aspirare con cura il surnatante e trasferirlo in un tubo fresco con ghiaccio. Dopo aver quantificato la proteina secondo le istruzioni nel protocollo scritto, aggiungere 25 microgrammi di proteina a una provetta di reazione contenente 0,8 microlitri di Ac-DEVD-AMC da 10 millimolari e tampone di reazione per un volume finale di 200 microlitri. Per i campioni di reazione negativa, combinare 25 microgrammi di proteine con un microlitro di Ac-DEVD-CHO da 800 micromolari e 0,8 microlitri di Ac-DEVD-AMC da 10 millimolari.

Incubare tutti i campioni e i controlli al buio per tre ore a 37 gradi Celsius. Trascorso il tempo di incubazione, interrompere la reazione con 600 microlitri di glicina molare 0,4 e idrossido di sodio molare 0,4 molare a pH 10 in ciascun campione e controllare. Aggiungere due millilitri di acqua distillata ad ogni reazione in una cuvetta di vetro.

Quantificare la fluorescenza mediante spettrofluorimetria. Leggi controlli e campioni per 10 secondi con una lettura al secondo. Infine, quantificare l'attività specifica in ciascun campione in base alla formula ora visualizzata sullo schermo.

Questo istogramma mostra l'attività della caspasi-3 nell'amigdala di ratti che hanno subito infarto del miocardio. I dati sono espressi come percentuale di attività media nei controlli fittizi impostata al 100%Ogni gruppo era composto da otto ratti. L'asterisco indica una differenza significativa tra i gruppi con un valore p inferiore a 0,05.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore, escludendo l'intervallo tra l'intervento chirurgico di infarto del miocardio e il prelievo di tessuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre un infarto del miocardio in un ratto e misurare l'attività della caspasi-3 nell'amigdala di ratto utilizzando la spettrofluorimetria.