Purificazione delle navi cervello di topo

L'obiettivo generale della procedura è quello di purificare il compartimento vascolare del cervello del topo mantenendone l'integrità strutturale, mediante una serie di centrifugazioni e filtrazioni a bassa velocità, senza la necessità di impiegare anticorpi specifici o ceppi transgenici. Sono stati fatti numerosi sforzi per sviluppare tecniche che permettano indagini cellulari, molecolari e farmacologiche sulla barriera emato-encefalica. L'assenza di separazione, gradienti, colonne o passaggi di centrifugazione ad alta velocità rende la purificazione dei vasi cerebrali tramite questa procedura molto semplice, rapida ed economica.

I vasi cerebrali rimarranno strutturalmente integri con le cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette e circondati dai parassiti lamellari basali, dalla maggior parte delle cellule muscolari vascolari e dalle membrane astro perivascolari. Questo protocollo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo alla funzione del compartimento vascolare dell'encefalo e permettere lo studio della sua composizione molecolare; dimostrare la procedura sarà un ruolo da ricercatore postdottorato del team di Martin Coen S. Prima di iniziare la procedura, tagliare la parte inferiore della sezione superiore filettata del supporto per filtro.

Quindi utilizzare un bisturi per incidere la cute dal collo del topo fino al naso e tirare indietro la pelle. Lavare il cranio con PBS per rimuovere eventuali peli contaminanti, quindi inserire un paio di forbici nel cranio anteriormente ai bulbi olfattivi. Aprire le forbici per frantumare il cranio in parti e rimuovere il cervello con la spatola.

Successivamente, dissezionare il plesso coroideo dai ventricoli laterali e trasferire il cervello in un becher da 150 millilitri contenente 20 millilitri di soluzione B one posti sul ghiaccio. Quindi utilizzare due bisturi per tritare energeticamente il cervello in frammenti di tessuto di due millimetri e utilizzare un omogeneizzatore automatico per omogeneizzare il tessuto per 20 passaggi a 400 giri al minuto sul ghiaccio. Per purificare i vasi, trasferire l'omogeneato in un tubo di plastica da 50 millilitri e centrifugare la sospensione di tessuto.

In una centrifuga con rotore oscillante, si formerà nella parte superiore del pellet un'ampia interfaccia bianca costituita principalmente da mielina. Eliminare il soprannatante, aggiungere 20 millilitri di soluzione B due fredda ghiacciata e agitare vigorosamente il tubo per un minuto. Dopo una seconda centrifugazione, la mielina formerà uno strato bianco denso sulla superficie del soprannatante.

Ruotare lentamente il tubo in modo che la soluzione B due scorra lungo la parete durante il travaso, quindi scartare la mielina insieme al soprannatante. Successivamente, utilizzare una pipetta di plastica avvolta in carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido dalle pareti del tubo. Fare attenzione a non toccare il pellet del campione e capovolgere il tubo sul ghiaccio.

Successivamente, risospendere il pellet in un millilitro di soluzione B tre fredda con ghiaccio, seguito dall'aggiunta di altri cinque millilitri di soluzione B tre, avendo cura che i vasi non formino aggregati. Posizionare ora un filtro in nylon da 20 micron sopra un becher e equilibrare il filtro con 10 millilitri di soluzione B tre fredda con ghiaccio. Versare la preparazione dei vasi sul filtro e risciacquare attentamente i vasi con altri 40 millilitri di soluzione B tre fredda con ghiaccio.

Quindi utilizzare pinze pulite per trasferire immediatamente il filtro in un becher contenente 30 millilitri di soluzione B tre fresca e agitare delicatamente i contenitori con il filtro. Versare il contenuto del becher in un tubo di plastica da 50 millilitri. Successivamente, dopo una centrifugazione, risospendere il pellet in un millilitro di soluzione B tre fredda ghiacciata prima della colorazione immunoistochimica.

Trasferire i vasi in provette PCR da 0,2 millilitri e posizionare le provette sul ghiaccio fino a quando il sedimento tissutale si deposita sul fondo delle provette. Successivamente, utilizzare punte gel per aspirare la maggior parte del liquido. Poi, inserire una capillare di vetro silanizzata da 40 micrometri in una punta di pipetta P200 e utilizzare la capillare per trasferire i vasi su un vetrino; una volta che i vasi si sono depositati, rimuovere con attenzione il liquido utilizzando un pezzo di carta assorbente.

Quindi, applicare una singola goccia di mezzo di montaggio sui vasi e posizionare un coperchio ad un angolo di 45 gradi, permettendo al mezzo di montaggio di diffondersi lungo il bordo del vetro fino a quando il coperchio non è correttamente posizionato. In questa immagine, è possibile osservare una marcatura continua di RIN attorno alle cellule endoteliali neurali, confermando la conservazione della lamina basale sui vasi purificati. Anche componenti delle giunzioni strette endoteliali, come ZO-1, vengono rilevate sui vasi purificati.

Inoltre, l'etichettatura per NG2 e per l'actina del muscolo liscio indica rispettivamente la conservazione di parassiti integri e di cellule muscolari lisce vascolari. Le proteine della membrana astrocitaria perivascolare connexina 43 e acquaporina 4 sono inoltre rilevate sulla superficie dei vasi purificati, dimostrando la ulteriore conservazione delle membrane astrocitari perivascolari durante il processo di purificazione; tuttavia, si osservano soltanto fibre positive per GFAP brevi e disperse sui vasi isolati, indicando che i corpi cellulari degli astrociti non vengono co-purificati. Restano attaccate ai vasi solo poche fibre neuronali.

Allo stesso modo, le cellule positive per IBA uno e oli due non vengono rilevate, confermando che microglia e oligodendrociti non vengono co-purificati. Raccomandiamo vivamente di rimuovere il plesso corioide attuale prima dell'omogeneizzazione del cervello, poiché abbiamo riscontrato che può rappresentare una possibile fonte di contaminazione, di lavorare in un'area pulita e di evitare la contaminazione da capelli e polvere, poiché gli anticorpi presentano un'elevata affinità non specifica per questi materiali.

È inoltre fondamentale eseguire sempre anche una colorazione nucleare. È possibile rimuovere le cellule sanguigne dai vasi purificati effettuando una perfusione intracardiaca con PBS prima dell'estrazione dei vasi. Abbiamo estratto con successo aria e proteine da vasi purificati mediante questa procedura, sia da campioni freschi che da vasi congelati.

Abbiamo inoltre utilizzato sonde fluorescenti e microscopia confocale per studiare la funzione di trasporto endoteliale ex vivo dei vasi. Vi auguriamo buona fortuna con i vostri esperimenti.