Name: Purificazione delle navi cervello di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Scopri come purificare i vasi cerebrali di topo preservandone l'integrità strutturale mediante centrifugazioni a bassa velocità e filtrazioni, senza anticorpi specifici o ceppi transgenici. Questo metodo semplice e rapido consente studi cellulari, molecolari e farmacologici sulla barriera ematoencefalica.

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Questo lavoro è stato supportato dal LABEX MemoLife e dal ARSEP (Fondazione per l&#39;aide à la recherche sur la sclérose en placche)

1. Soluzioni e materiali <ol><li> Preparare le soluzioni di isolamento dei vasi: B1, aggiungere 1,5 ml di HEPES 1M a 150 ml di HBSS; B2, aggiungere 3,6 g di destrano al 20 ml di B1; B3, aggiungere 1 g di BSA a 100 ml di B1. </li><li> Modificare il portafiltro tagliando il fondo al largo della parte superiore avvitamento. </li><li> Preparare le soluzioni di immunoistochimica: soluzione di fissaggio, 4% paraformaldeide in PBS pH 7,4; Permeabilization / soluzione bloccante, diluire siero di capra al 5% e Triton X100 al 0,25% in PBS pH 7,4. Nota: Fixation dipende dal tipo di anticorpi primari utilizzati. </li></ol> 2. Dissection Nota: le condizioni sterili non sono richieste, a meno che le navi sono utilizzati per scopi di colture cellulari. <ol><li> Preparare un bicchiere da 150 ml con 20 ml di B1. Continuate a ghiaccio e coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell&#39;aria. </li><li> Profondamente anestetizzare il mouse sotto una cappa con un piccolo asciugamano di carta imbevuto di 1 ml di isoflurano puro che viene aggiunto into la gabbia. L&#39;anestesia è verificata da una mancanza di reazione ad una presa punta. Uccidere il mouse dislocazione cervicale. NOTA: Questi passaggi sono realizzate nel rispetto della normativa nazionale e istituzionale. </li><li> Opzionale: eseguire perfusione intracardiaca con 20 ml di PBS 1x per eliminare il contenuto del sangue 24. </li><li> Sezione la pelle con un bisturi dal collo al naso e tirarlo via. Rimuovere tutti i peli contaminanti con PBS 1x. </li><li> Per aprire il cranio, prima inserire forbici anteriormente al bulbo olfattivo, e aprire le forbici per rompere il cranio in due parti. </li><li> Rimuovere con attenzione il cervello con una spatola cerebrale. Sezionare plessi corioidei dei ventricoli laterali come sarebbero contaminare il sangue di preparazione nave 38. NOTA: Opzionale: La preparazione finale conterrà vasi parenchimali e le meningi. Se non si desidera, le meningi possono essere staccata seguendo la procedura descritta da 38. </li><li> Transfer cervello nel becher contenente soluzione B1 su ghiaccio. Fino a 8 cervelli possono essere trattati insieme. </li></ol> 3. tessuto cerebrale omogeneizzazione <ol><li> Utilizzando due bisturi, manualmente e vigorosamente battere il cervello nella soluzione B1 ottenere successivamente pezzetti di circa 2 mm. </li><li> Omogeneizzare preparato, con un Dounce omogeneizzatore automatizzata, l&#39;esecuzione di 20 colpi a 400 rpm. Assicurarsi che il tubo di vetro è mantenuto in ghiaccio e che la parte superiore del douncer è in soluzione quando si spostano su e giù, in modo da impedire la formazione di sacche d&#39;aria. Se diversi campioni sono preparati, lavare il douncer con acqua ionizzata tra ogni omogeneizzazione. </li></ol> 4. Vessel Purificazione <ol><li> Trasferire l&#39;omogeneizzato in un tubo di plastica da 50 ml e procedere alla centrifugazione a 2.000 g per 10 min a 4 ° C. Un grande interfaccia bianca (principalmente mielina) formerà sulla parte superiore del serbatoio pellet (rosso se è stata eseguita alcuna perfusione). </li><li> Scartare il surnatante. Il pellet nave e l&#39;interfaccia bianco rimarrà attaccato insieme. Aggiungere 20 ml di soluzione B2 ghiacciata e agitare il tubo manualmente e vigorosamente per 1 min. </li><li> Procedere alla seconda centrifugazione a 4.400 g per 15 minuti a 4 ° C. La mielina ora formare uno strato bianco densa alla superficie del supernatante. </li><li> Staccare accuratamente lo strato mielina dalle pareti del tubo tenendo il tubo e ruotare lentamente per permettere il surnatante di passare lungo le pareti. Eliminare mielina con il surnatante. Il pellet contenente i vasi rimane attaccato al fondo della provetta. </li><li> Tamponare la parete interna del tubo con carta assorbente avvolto intorno ad un pipetta da 5 ml e rimuovere tutti i residui di liquido, evitare di toccare il pellet recipiente. Tenere il tubo capovolto su una carta assorbente per drenare eventuali residui di liquido. </li><li> Sospendere il pellet in 1 ml di soluzione B3 ghiacciata pipettando su e giù con punte basso vincolante, keeping la provetta in ghiaccio, quindi aggiungere altri 5 ml di soluzione B3. Assicurarsi che le navi sono disperse, per quanto possibile e non formano aggregati. </li></ol> 5. Filtrazione <ol><li> Preparare un becher su ghiaccio con 30 ml di soluzione B3 ghiacciata. Coprire con parafilm per evitare la contaminazione dell&#39;aria. </li><li> Collocare un filtro da 20 micron a maglia su un portafiltro modificato sulla sommità di un pallone becker ed equilibrare applicando 10 ml di soluzione B3 ghiacciata. </li><li> Versate la preparazione nave sul filtro e sciacquare i vasi con 40 ml di soluzione B3 ghiacciata. </li><li> Recuperare il filtro con pinze pulite e immergere immediatamente nel bicchiere contenente la soluzione B3. Staccare i vasi dal filtro scuotendolo delicatamente. </li><li> Versare il contenuto becher in un tubo di plastica da 50 ml e centrifugare a 2000 g per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Nota: in alternativa, la sospensione dei vasi cerebrali &#39;dal punto 4.6 può essere filtrata su un filtro a maglie micron 100.In questo caso, più grandi vasi sono preferenzialmente trattenuta dal filtro mentre il flow-through contiene microvasi (principalmente capillari), che vengono poi filtrati su un filtro 20 micron a maglie come sopra. </li><li> Risospendere il pellet di microvasi in 1 ml di soluzione B3 ghiacciata e trasferirlo pipettando in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Centrifugare a 2.000 g per 5 minuti a 4 ° C. </li></ol> 6. Fissazione, permeabilizzazione e blocco <ol><li> Vasi di trasferimento pipettando nella 0,2 ml provette PCR contenenti PBS usando una bassa punta vincolante 1,0 ml. Fare attenzione a non toccare i vasi in quanto potrebbero aderire alla parte esterna della punta. Eseguire le seguenti operazioni al microscopio binoculare. </li><li> Per ciascuno dei seguenti cambiamenti medi, lasciare i tubi in ghiaccio fino vasi hanno raggiunto il fondo, e pipettare la maggior parte dei liquidi con puntali gel-caricamento lunghi e cosa. </li><li> Eliminare la maggior parte PBS e aggiungere 200 ml di soluzione di fissativo.Sospendere i vasi agitando delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare la soluzione fissativo e sostituirlo con 200 ml di PBS 1x (primo lavaggio), incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e ripetere l&#39;operazione 3 volte. Ogni volta, verificare che le navi sono affondate correttamente al fondo delle provette e pipetta su PBS 1x, assicurando le navi non sono toccati. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, sostituire PBS 1x dal / soluzione di bloccaggio permeabilizzazione e incubare 1 ora a temperatura ambiente, risospendere i vasi agitando delicatamente di tanto in tanto. </li></ol> 7. Immunostaining <ol><li> Sostituire la / soluzione di bloccaggio permeabilizzazione con il mix di anticorpi primari (vedi riferimenti degli anticorpi utilizzati qui e diluizioni nella tabella modello Materials) diluito in / soluzione di blocco permeabilizzazione, e incubare a 4 ° CO / N. </li><li> Dopo 3 lavaggi in PBS a temperatura ambiente, incubare le navi con il mix di anticorpi secondari diluito in PBS per 2 orea RT. </li><li> Nota: si consiglia vivamente di eseguire una colorazione nucleare con Hoechst (1: 2.000) o DAPI (1: 2.000), al fine di distinguere le navi di possibile contaminazione peli o polveri sotto il microscopio. </li><li> Dopo 3 lavaggi in PBS, risospendere le navi in ​​50 ml di PBS. </li></ol> 8. Montaggio e di osservazione <ol><li> Preparare una punta con un capillare di vetro siliconato: tagliare una punta di pipetta P200 con un bisturi e regolare il capillare all&#39;interno. Il volume approssimativo del capillare è di 40 microlitri. </li><li> Trasferire le navi ad un vetrino utilizzando il capillare di vetro siliconato e rimuovere con attenzione il liquido con un pezzo di carta assorbente. </li><li> Applicare una sola goccia di soluzione di montaggio sulle navi e in possesso di un vetrino a 45 ° permettendo al calo di diffusione lungo il bordo dello slip. Lasciate andare la vetrino e lasciare medio di diffondersi lentamente. Lasciare asciugare O / N a RT con protezione dalla luce. Le navi possono essere osservati sotto un flmicroscopio confocale ent. </li></ol>

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<li>Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Visual+Description+of+the+Dissection+of+the+Cerebral+Surface+Vasculature+and+Associated+Meninges+and+the+Choroid+Plexus+from+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
<li>Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Method+to+Isolate+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells+by+Magnetic+Cell+Sorting+and+Dominant+mRNA+Expression+of+Multidrug+Resistance-associated+Protein+1+and+4+in+Highly+Purified+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells.</a> Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).</li>
<li>Warren, M. S., Zerangue, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiles+of+ABC+transporters+in+brain+microvessel+endothelial+cells+and+brain+in+five+species+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human.</a> Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).</li>
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<li>Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+Resistance-Related+Transport+Proteins+in+Isolated+Human+Brain+Microvessels+and+in+Cells+Cultured+from+These+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates.</a> Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).</li>
<li>Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Sci Rep. 3, 1500(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La barriera ematoencefalica regola il passaggio di sostanze fisiologiche dentro e fuori del sistema nervoso centrale e lo protegge da sostanze potenzialmente nocivi presenti nel sangue. E &#39;coinvolto in diverse patologie del sistema nervoso centrale, tra cui le malattie neurodegenerative 2 e tumori cerebrali 28. La bassissima permeabilità della BBB ostacola anche il passaggio di agenti terapeutici mirati cellule neurali e lo sviluppo di metodi che intendono aprire reversibilmente BBB senza conse...

Il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale (CNS) richiede un ambiente extracellulare altamente regolato, e le sue richieste metaboliche sono enormi rispetto ad altri organi 1. Il CNS è anche estremamente sensibile a una vasta gamma di prodotti chimici, generalmente innocui agli organi periferici, ma ad esso, neurotossico. Per un corretto funzionamento, la maggior parte del &#39;vascolare CNS costituisce una barriera endoteliale; la barriera emato-encefalica (BBB), che controlla il flusso di molecole e ioni così come il passaggio di cellule immunitarie tra il sangue e il cervello, mantenendo quindi una corretta omeostasi 2, ma anche limitando l&#39;ingresso di farmaci terapeutici, trattamenti ostacolano pertanto di disturbi neurologici 3. A livello cellulare, il BBB è sostenuta principalmente da ampi giunzioni strette tra le cellule endoteliali, espressione polarizzata dei trasportatori di efflusso e un tasso molto basso transcitosi 4. Proprietà e funzioni del BBB sono per lo più indotte da NEcellule ighboring 4. In particolare, periciti svolgono un ruolo importante nel indurre e mantenere la BBB 5,6. Essendo le cellule contrattili, periciti regolano anche il flusso di sangue 7 come le cellule della muscolatura liscia che circondano i grandi vasi. Infine, astrociti, le principali cellule gliali del cervello, inviano grandi processi denominati endfeet intorno la maggior parte del sistema vascolare cerebrale 8 e modulare l&#39;integrità BBB e quiescenza immunitario 9, il trasferimento di metaboliti di neuroni 10, e indurre l&#39;accoppiamento stretto tra l&#39;attività neuronale e il flusso di sangue 11,12. La possibilità di studiare le proprietà molecolari e cellulari del sistema cerebrovascolare è fondamentale per caratterizzare meglio il suo contributo alla fisiologia del cervello e fisiopatologia. Per affrontare questo problema, sono state sviluppate strategie per isolare il sistema cerebrovascolare del cervello, che consentono per la preparazione di frammenti dei vasi cerebrali intatti. Cerebral nave purification è stata inizialmente descritta utilizzando cervelli bovini 13 e migliorato e adattato ad altre specie, in particolare roditori 14. In questo ultimo studio, l&#39;uso di filtri di varie dimensioni è stato introdotto per separare vasi cerebrali in per frazioni arricchite in vasi di diametri diversi. È interessante notare che, in tali preparati, le cellule endoteliali mantenuto le loro proprietà metaboliche 15, funzionalità trasportatore 16 e 17 di polarizzazione. Qui, descriviamo in dettaglio questo protocollo e inoltre dimostrare che le navi isolate mantengono la maggior parte di loro in strutture in situ. Le cellule endoteliali restano legati da giunzioni strette e circondate da una lamina basale continuo. Periciti e cellule muscolari lisce rimangono attaccati allo strato endoteliale, così come membrane astrociti perivascolari. Tuttavia, astrociti, cellule microgliali, neuroni e oligodendrociti sono eliminati. Infine, si descrive una procedura per eseguire immunocolorazione sui vasi cerebrali isolate. </p&gt; Fino ad ora la maggior parte degli studi molecolari e cellulari riguardanti il sistema cerebrovascolare sono stati eseguiti su cellule dei vasi cerebrali purificate dissociati da cellule di smistamento utilizzando cellulari specifici ceppi di topi giornalista o procedure basate immunocolorazione-18,19. Sebbene queste tecniche consente l&#39;isolamento delle popolazioni cellulari quasi puro cerebrovascolari, cellule isolate perdono completamente la loro morfologia e in situ interazioni, che a sua volta, influisce notevolmente le loro proprietà molecolari e cellulari. Il protocollo qui descritto, consentendo l&#39;isolamento di interi frammenti cerebrovascolari senza necessità di anticorpi specifici o macchie di topi transgenici, offre una buona alternativa come la struttura complessiva di isolati vasi cerebrali è conservato, quindi, diminuendo ripercussioni sulla loro proprietà molecolari. Isolato imbarcazioni potrebbero quindi essere utilizzati per studiare l&#39;attività dei geni, la sintesi proteica e la regolamentazione a BBB come recentemente descritto 20,21 </sup&gt;. Infine, rispetto alla cattura microdissezione laser 22,23 il presente protocollo è poco costoso, facile da eseguire e rapidamente adattabile a qualsiasi laboratorio.

<table><tbody><tr><td>Macina Tessuti Taglia C</td><td>Thomas scientific</td><td>3431E25</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga 5415&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuga 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000320</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio modulare ad alte prestazioni</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Compact System fornisce punte Leica LED1000</td><td>Leica</td><td>LED1000</td><td></td></tr><tr><td>di alta qualità a basso legame (P1000)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>14200T</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex 47 mm portafiltro PP 8/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Disco filtrante in rete di nylon Hydrophilic 20 &micro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Disco filtrante a rete in nylon Hydrophilic 100 &micro; m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td><td></td></tr><tr><td>Tubo in borosilicato a parete standard</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>1014356290F</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di copertura, spessore 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>P10143263NR1</td><td></td></tr><tr><td>Provette a parete sottile da 0,2 ml e tappo bombato</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PARAFILM M (formato rotolo 4 pollici & volte; 125 piedi)</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo</td><td>Tecnologia Life</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Tecnologia Life</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>destrano da Leuconostoc spp. Mr ~70.000</td><td>Sigma</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldeide (p/v), senza metanolo&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33342 tricloridrato (Hoechst)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4 Da Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Coniugato; Diluizione 1/100</td><td>Life technology</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Agrin (coniglio) ; diluizione 1/400</td><td>gentilmente fornita dal Dr Markus A Ruegg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti ZO-1 (topo, clone 1A12)</td><td>Life technology</td><td>33-9100</td><td>diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin (topo, clone 1A4)</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>&nbsp; diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anti GFAP (topo, clone GA5)</td><td>Sigma</td><td>G3893</td><td>&nbsp; diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anti AQP4 (coniglio)</td><td>Sigma</td><td>A5971</td><td>&nbsp; diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anti Cx43 (topo, clone&nbsp; 2)</td><td>BD Biosciences</td><td>610061</td><td>&nbsp; diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anti Olig2 (coniglio)</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>&nbsp; diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Anti NF-M (topo)</td><td>fornita dal Dr. Beat M. Riederer, Università di Losanna, Svizzera.</td><td>&nbsp; diluizione 1:10</td><td></td></tr><tr><td>Anti Iba1 (coniglio)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>&nbsp; diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra Anti-Topo IgG (H+L) Anticorpo</td><td>Life technology</td><td>A11029</td><td>&nbsp; diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>Life technology</td><td>A11034</td><td>&nbsp; diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Capra Anti-Topo IgG (H+L) Anticorpo</td><td>Life technology</td><td>A21424</td><td>&nbsp; diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 555 coniugato</td><td>Life technology</td><td>A21429</td><td>&nbsp; diluizione 1:2.000</td></tr></tbody></table>

purificazione delle navi cervello di topo

Purification of Mouse Brain Vessels

Nel cervello, la maggior parte del sistema vascolare costituito da una barriera selettiva, la barriera emato-encefalica (BBB) ​​che regola lo scambio di molecole e cellule immunitarie tra il cervello e il sangue. Inoltre, la grande richiesta metabolica neuronale richiede un regolamento momento per momento del flusso sanguigno. In particolare, le anomalie di questi regolamenti sono le caratteristiche distintive eziologici della maggior parte delle patologie cerebrali; compresi glioblastoma, ictus, edema, epilessia, malattie degenerative (es: la malattia di Parkinson, il morbo di Alzheimer), tumori cerebrali, così come le condizioni infiammatorie come la sclerosi multipla, la meningite e sepsi indotta disfunzioni cerebrali. Pertanto, la comprensione degli eventi di segnalazione che modulano la fisiologia cerebrale è una sfida importante. Molto comprensione delle proprietà cellulari e molecolari dei vari tipi di cellule che compongono il sistema cerebrovascolare può essere acquisita da coltura primaria o separazione delle cellule dal tessuto cerebrale di recente dissociato. Però,proprietà come polarità cellulare, morfologia e rapporti intercellulari non sono mantenuti in tali preparazioni. Il protocollo che descriviamo qui è concepito per purificare frammenti dei vasi cerebrali, mantenendo l&#39;integrità strutturale. Abbiamo dimostrato che i vasi isolati costituiti da cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette che sono circondati da una lamina basale continuo. Periciti, cellule muscolari lisce e le membrane astrociti endfeet perivascolari rimangono attaccati allo strato endoteliale. Infine, si descrive come eseguire gli esperimenti di immunoistochimica sui vasi cerebrali purificate.

Qui, descriviamo un protocollo che consente l&#39;isolamento meccanico dei vasi cerebrali 14. La figura 1 riassume le fasi principali di questa tecnica. L&#39;architettura dei vasi cerebrali è complesso e comprende vari tipi di cellule, cioè, cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette e circondati da periciti, cellule muscolari lisce e processi piede astrociti 9. Così, dopo l&#39;isolamento dei vasi cerebrali, abbiamo voluto caratterizzare la struttura dei vasi pur...

Descriviamo un protocollo che permette la purificazione del compartimento vascolare del cervello del topo. I vasi cerebrali isolati includono cellule endoteliali collegate da giunzioni strette e circondate da una lamina basale continua, periciti, cellule muscolari lisce vascolari e membrane astrogliali perivascolari.

Purificazione delle navi cervello di topo

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

L'obiettivo generale della procedura è quello di purificare il compartimento vascolare del cervello del topo mantenendone l'integrità strutturale, mediante una serie di centrifugazioni e filtrazioni a bassa velocità, senza la necessità di impiegare anticorpi specifici o ceppi transgenici. Sono stati fatti numerosi sforzi per sviluppare tecniche che permettano indagini cellulari, molecolari e farmacologiche sulla barriera emato-encefalica. L'assenza di separazione, gradienti, colonne o passaggi di centrifugazione ad alta velocità rende la purificazione dei vasi cerebrali tramite questa procedura molto semplice, rapida ed economica.I vasi cerebrali rimarranno strutturalmente integri con le cellule endoteliali sigillate da giunzioni strette e circondati dai parassiti lamellari basali, dalla maggior parte delle cellule muscolari vascolari e dalle membrane astro perivascolari. Questo protocollo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo alla funzione del compartimento vascolare dell'encefalo e permettere lo studio della sua composizione molecolare; dimostrare la procedura sarà un ruolo da ricercatore postdottorato del team di Martin Coen S. Prima di iniziare la procedura, tagliare la parte inferiore della sezione superiore filettata del supporto per filtro.Quindi utilizzare un bisturi per incidere la cute dal collo del topo fino al naso e tirare indietro la pelle. Lavare il cranio con PBS per rimuovere eventuali peli contaminanti, quindi inserire un paio di forbici nel cranio anteriormente ai bulbi olfattivi. Aprire le forbici per frantumare il cranio in parti e rimuovere il cervello con la spatola.Successivamente, dissezionare il plesso coroideo dai ventricoli laterali e trasferire il cervello in un becher da 150 millilitri contenente 20 millilitri di soluzione B one posti sul ghiaccio. Quindi utilizzare due bisturi per tritare energeticamente il cervello in frammenti di tessuto di due millimetri e utilizzare un omogeneizzatore automatico per omogeneizzare il tessuto per 20 passaggi a 400 giri al minuto sul ghiaccio. Per purificare i vasi, trasferire l'omogeneato in un tubo di plastica da 50 millilitri e centrifugare la sospensione di tessuto.In una centrifuga con rotore oscillante, si formerà nella parte superiore del pellet un'ampia interfaccia bianca costituita principalmente da mielina. Eliminare il soprannatante, aggiungere 20 millilitri di soluzione B due fredda ghiacciata e agitare vigorosamente il tubo per un minuto. Dopo una seconda centrifugazione, la mielina formerà uno strato bianco denso sulla superficie del soprannatante.Ruotare lentamente il tubo in modo che la soluzione B due scorra lungo la parete durante il travaso, quindi scartare la mielina insieme al soprannatante. Successivamente, utilizzare una pipetta di plastica avvolta in carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido dalle pareti del tubo. Fare attenzione a non toccare il pellet del campione e capovolgere il tubo sul ghiaccio.Successivamente, risospendere il pellet in un millilitro di soluzione B tre fredda con ghiaccio, seguito dall'aggiunta di altri cinque millilitri di soluzione B tre, avendo cura che i vasi non formino aggregati. Posizionare ora un filtro in nylon da 20 micron sopra un becher e equilibrare il filtro con 10 millilitri di soluzione B tre fredda con ghiaccio. Versare la preparazione dei vasi sul filtro e risciacquare attentamente i vasi con altri 40 millilitri di soluzione B tre fredda con ghiaccio.Quindi utilizzare pinze pulite per trasferire immediatamente il filtro in un becher contenente 30 millilitri di soluzione B tre fresca e agitare delicatamente i contenitori con il filtro. Versare il contenuto del becher in un tubo di plastica da 50 millilitri. Successivamente, dopo una centrifugazione, risospendere il pellet in un millilitro di soluzione B tre fredda ghiacciata prima della colorazione immunoistochimica.Trasferire i vasi in provette PCR da 0,2 millilitri e posizionare le provette sul ghiaccio fino a quando il sedimento tissutale si deposita sul fondo delle provette. Successivamente, utilizzare punte gel per aspirare la maggior parte del liquido. Poi, inserire una capillare di vetro silanizzata da 40 micrometri in una punta di pipetta P200 e utilizzare la capillare per trasferire i vasi su un vetrino; una volta che i vasi si sono depositati, rimuovere con attenzione il liquido utilizzando un pezzo di carta assorbente.Quindi, applicare una singola goccia di mezzo di montaggio sui vasi e posizionare un coperchio ad un angolo di 45 gradi, permettendo al mezzo di montaggio di diffondersi lungo il bordo del vetro fino a quando il coperchio non è correttamente posizionato. In questa immagine, è possibile osservare una marcatura continua di RIN attorno alle cellule endoteliali neurali, confermando la conservazione della lamina basale sui vasi purificati. Anche componenti delle giunzioni strette endoteliali, come ZO-1, vengono rilevate sui vasi purificati.Inoltre, l'etichettatura per NG2 e per l'actina del muscolo liscio indica rispettivamente la conservazione di parassiti integri e di cellule muscolari lisce vascolari. Le proteine della membrana astrocitaria perivascolare connexina 43 e acquaporina 4 sono inoltre rilevate sulla superficie dei vasi purificati, dimostrando la ulteriore conservazione delle membrane astrocitari perivascolari durante il processo di purificazione; tuttavia, si osservano soltanto fibre positive per GFAP brevi e disperse sui vasi isolati, indicando che i corpi cellulari degli astrociti non vengono co-purificati. Restano attaccate ai vasi solo poche fibre neuronali.Allo stesso modo, le cellule positive per IBA uno e oli due non vengono rilevate, confermando che microglia e oligodendrociti non vengono co-purificati. Raccomandiamo vivamente di rimuovere il plesso corioide attuale prima dell'omogeneizzazione del cervello, poiché abbiamo riscontrato che può rappresentare una possibile fonte di contaminazione, di lavorare in un'area pulita e di evitare la contaminazione da capelli e polvere, poiché gli anticorpi presentano un'elevata affinità non specifica per questi materiali.È inoltre fondamentale eseguire sempre anche una colorazione nucleare. È possibile rimuovere le cellule sanguigne dai vasi purificati effettuando una perfusione intracardiaca con PBS prima dell'estrazione dei vasi. Abbiamo estratto con successo aria e proteine da vasi purificati mediante questa procedura, sia da campioni freschi che da vasi congelati.Abbiamo inoltre utilizzato sonde fluorescenti e microscopia confocale per studiare la funzione di trasporto endoteliale ex vivo dei vasi. Vi auguriamo buona fortuna con i vostri esperimenti.

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In questo articolo vi presentiamo una semplice tecnica pratica per la fusione cerebrovascolari che è facile da eseguire e possono essere utilizzati per l'immagine dell'albero vascolare del cervello di topo adulto.

Casting cerebrovascolare del topo adulto per l&#39;imaging 3D e analisi morfologica

Questo video dimostra l'isolamento di vasi intatti dal cervello di un topo che costituiscono la barriera emato-encefalica (BEE) insieme a neuroni e cellule gliali. I vasi isolati possono essere utilizzati come modello in vitro per studiare il loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi cerebrale.

Isolamento dei vasi cerebrali di topo: un protocollo per isolare i vasi intatti da un campione di cervello murino

Questo video dimostra l'isolamento dei capillari dai cervelli suini freschi. Il processo prevede la rimozione delle meningi, l'isolamento della materia grigia dal tessuto cerebrale, l'omogeneizzazione e il filtraggio della materia grigia per isolare i capillari e, infine, l'utilizzo della digestione enzimatica per purificare ulteriormente i capillari.

Purificazione dei capillari da un cervello suino

Questo video dimostra un metodo per isolare i periciti cerebrali dal cervello di un topo. Le cellule isolate vengono coltivate in terreni specifici per i periciti per promuovere la proliferazione dei periciti.

Isolamento e coltura di periciti cerebrali di topo

Questo video mostra un metodo per isolare i tubi endoteliali dal parenchima cerebrale di topo. Attraverso una combinazione di digestione enzimatica e dissociazione meccanica, il processo produce un tubo intatto con cellule endoteliali.

Preparazione dei tubi endoteliali cerebrali dalle arteriole parenchimali di topo

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono interconnesse da specifiche proteine giunzionali che formano una barriera altamente regolata che separa il sangue e il sistema nervoso centrale (SNC), la cosiddetta barriera emato-encefalica (BBB). L'isolamento delle cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello murino, come discusso in questo protocollo, consente studi dettagliati in vitro della BEE.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

Descriviamo qui un protocollo riproducibile per isolare la cerchia dei topi di Willis.

Protocollo per isolare il circolo di Willis mouse

Vi presentiamo un protocollo per l'estrazione di murini periciti cerebrali. Basato su un'estrazione pericito orientata all'arricchimento senza antibiotici, questo protocollo è uno strumento prezioso per gli studi in vitro che forniscono un'elevata purezza e un'alta resa, diminuendo così il numero di animali sperimentali utilizzati.

Un metodo ad alta uscita per isolare i periciti cerebrali dal mouse

La preparazione intensiva di "tubi" endoteliali cerebrali di topo intatti da arteriole parenchimali cerebrali è illustrata per lo studio della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, dimostriamo i punti di forza sperimentali di questo modello di studio endoteliale per l'imaging a fluorescenza e la misurazione elettrofisiologica delle principali vie di segnalazione cellulare, compresi i cambiamenti nel potenziale intracellulare [Ca2+] e di membrana.

Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

Dimostriamo l'induzione chimica della dilatazione dei grandi vasi sanguigni nei topi come modello per lo studio della disfunzione cerebrovascolare, che può essere utilizzato per la demenza vascolare e la modellazione del morbo di Alzheimer. Dimostriamo anche la visualizzazione del sistema vascolare iniettando un composto di gomma siliconica e fornendo una chiara guida visiva per misurare i cambiamenti nelle dimensioni dei vasi sanguigni.

Un approccio visivo per indurre la dolicoectasia nei topi per modellare la disfunzione cerebrovascolare mediata da grandi vasi

Scopri come purificare i vasi cerebrali di topo preservandone l'integrità strutturale mediante centrifugazioni a bassa velocità e filtrazioni, senza anticorpi specifici o ceppi transgenici. Questo metodo semplice e rapido consente studi cellulari, molecolari e farmacologici sulla barriera ematoencefalica.

Purificazione delle navi cervello di topo

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