Name: VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Scopri il sequenziamento profondo VDJ per analizzare l'evoluzione clonale del linfoma B cellulare. Questo metodo utilizza campioni di tessuto congelato e incluso in paraffina per tracciare i pattern di ricaduta tumorale.

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Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Rita Shaknovich e i membri di Elemento lab, Melnick lab e Tam lab per le discussioni ponderate. Vorremmo anche ringraziare la Genomics Resources Core Facility del Weill Cornell Medical College per aver eseguito il sequenziamento VDJ. YJ è stato sostenuto dall'ASH Scholar Award. WT e OE sono supportati dal Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE è supportato dal premio NSF CAREER, dallo Starr Cancer Consortium e dall'Hirschl Trust. Vorremmo anche ringraziare Katherine Benesch, JD, MPH per il suo generoso sostegno a questo progetto.

1. VDJ Amplificazione 1.1) Estrazione del DNA da campioni tumorali <ol><li> Estrarre il DNA da sezioni sottili (10-20 micron) di congelati PTOM incorporati tessuti normali e maligni. <ol><li> Digest 10-30 sezioni sottili di tessuto incorporato tagliato da un microtomo criostato in 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M Na 2 EDTA) con Proteinasi K (0,5 mg / ml, concentrazione finale ) e 0,625% SDS in una provetta da centrifuga da 15 ml in un bagno d&#39;acqua per una notte a 37 °. </li><li> Aggiungere 1 ml di NaCl satura (5 M) alla miscela di digestione e agitare vigorosamente per 15 secondi. </li><li> Centrifugare a 1100 xg per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere due volumi di 100% di etanolo. </li><li> Miscelare invertendo la provetta 6-8 volte. Centrifugare a 5.000 xg per 60 min a 4 ° C per raccogliere il DNA precipitato. </li><li> Lavare il pellet di DNA due volte con il 70% di etanolo. Centrifuge a 5.000 xg per 15 min ogni tempo per raccogliere il pellet. </li><li> Sciogliere DNA in 100-400 microlitri tampone TE a temperatura ambiente su un agitatore overnight stanza. La resa del DNA è 5 a 200 mg (concentrazione finale tra 50-500 ng / ml) a seconda delle dimensioni del tessuto </li></ol></li><li> Estrarre il DNA da sezioni sottili (10-20 micron) di, incorporato (FFPE) tessuto normale o maligni paraffinato fissati in formalina. <ol><li> Incubare sezioni di paraffina in 1 ml due volte xilene a temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a Sparaffinare. Raccogliere le sezioni di tessuto facendo girare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare sezioni in 1 ml di etanolo al 100% per due volte a temperatura ambiente, 10 min ogni volta per rimuovere residui xileni. Raccogliere le sezioni di tessuto facendo girare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. La paraffina è completamente sciolto a questo punto e solo la sezione di tessuto è restanti. </li><li> Asciugare sezioni in camera temperature per 10-15 minuti. </li><li> Fare un / soluzione di 0,5 mg ml proteinasi K con 1x tampone PCR (diluito da 10x tampone PCR con acqua priva di nucleasi). Aggiungere la soluzione proteinasi K per i campioni in un volume finale di 50-100 microlitri e incubare una notte a 37 ° C. </li><li> Riscaldare i campioni a 95 ° C per 10 minuti per inattivare proteinasi K. Nota: In questo passaggio, il DNA campione viene sciolto in tampone PCR e può essere utilizzato nei passaggi 1.2 e 1.3 direttamente. La resa del DNA è da 0,5 a 20 mg (concentrazione finale tra 10-200 ng / ml) a seconda delle dimensioni del tessuto. </li></ol></li></ol> 1.2) valutazione della qualità del DNA <ol><li> Mescolare 0.25 microlitri DNA polimerasi Taq con 45 ml di master mix dal kit scala commerciale in un tubo di PCR. </li><li> Aggiungere 5 microlitri DNA preparati da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 nella provetta PCR e mescolare bene pipettando su e giù per almeno 5 volte. </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per7 min; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; poi 72 ° C per 10 minuti e tenere a 15 ° C. </li><li> Preparare un gel di agarosio 2% in TBE (Tris / borato / EDTA). </li><li> Mescolare 20 microlitri PCR con 4 ml 6x colorante di caricamento, e caricare su un gel di agarosio 2%. </li><li> Macchia gel di agarosio con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione e individuare prodotti di PCR con un sistema di gel immaginare. Nota: i campioni che producono 5 prodotti PCR con dimensioni di 100, 200, 300, 400, e 600 bp sarà continuato a generare ampliconi VDJ. ATTENZIONE: etidio bromuro è un potente mutageno. Si prega di trattare con estrema cautela, indossando indumenti protettivi, cioè guanti, e smaltire in contenitori specifici per le linee guida dell&#39;istituzione. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) Amplifica ricombinato IgH VDJ Segmento dalla Regione quadro 1 (IgVHFR1) <ol><li> Mescolare 45 microlitri master mix dall&#39;etichetta tuboEd come &quot;Mix 2&quot; di una somatica IGH ipermutazione test per il rilevamento del gel kit commerciale, 0,25 ml Taq DNA polimerasi, e il DNA del campione 5 ml preparata da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 in un tubo di PCR. </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per 7 minuti; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; poi 72 ° C per 10 minuti e tenere a 15 ° C. </li><li> Risolvere l&#39;intero prodotto di PCR in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi. </li><li> Macchia gel di agarosio con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione e individuare prodotti di PCR con un sistema di imaging gel. Un amplicon monoclonale è previsto con la gamma di dimensioni di 310-380 bp. </li><li> Accise la porzione gel contenente l&#39;amplicone monoclonale tra 310-380 bp. </li><li> Purificare DNA da gel asportato utilizzando un kit di Gel Extraction standard secondo il protocollo del produttore. Nota: per i campioni che i frammenti FR1 potrebbero essere ottenuti, non c&#39;è bisogno di ampiamente IGVHFR2 e IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Amplifica ricombinato IgH VDJ Segmento dalla Regione Framework 2 (IgVHFR2) <ol><li> Mescolare 45 microlitri master mix dal tubo etichettato come &quot;Tube B&quot; di un gene IGH commerciale clonalità test per kit di rilevamento del gel, 0,25 ml Taq DNA polimerasi, e campione di DNA 5 microlitri preparati da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 in un tubo di PCR . </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per 7 minuti; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; quindi 72 ° C per 10 minuti e lasciare a 15 ° C. </li><li> Risolvere l&#39;intero prodotto di PCR in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi. </li><li> Visualizza prodotto di PCR (s) di 0,5 mg / ml colorazione con etidio bromuro. Un amplicone monoclonale può essere osservato all&#39;interno della gamma di dimensioni di 250-295 bp. </li><li> Accise la porzione gel contenente l&#39;amplicone monoclonale tra 250-295 bp. </li><li> Purificare DNA da gel asportato utilizzando un estratto di normale Gelion Kit secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 1.4) Ottimizzare VDJ PCR <ol><li> Utilizzare le seguenti condizioni di PCR modificate per amplificare IgVHFR1 e IgVHFR2 usando DNA non ottimale: 95 ° C per 7 minuti, 40 cicli di 95 ° C per 60 sec, 60 ° C per 60 sec e 72 ° C per 90 sec, estensione finale a 72 ° C per 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparazione e Sequencing 2.1) Biblioteca Preparazione 2.1.1) Fine-riparazione <ol><li> Trasferire VDJ prodotto di PCR da 1.3 in un tubo di PCR e aggiungere Risospensione tampone da campione di DNA kit di preparazione per portare il volume a 60 ml. </li><li> Aggiungere 40 ml di Fine Riparazione Mix da campione di DNA Kit di preparazione e mescolare accuratamente. </li><li> Incubare la reazione a 30 ° C per 30 minuti in un termociclatore pre-riscaldato (30 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C. </li><li> Mescolare 136 ml sfere magnetiche e 24 microlitri PCR gacqua rade primo di una provetta da 1,5 ml, quindi trasferire l&#39;intera reazione finale di riparazione da 2.1.1.3 nel tubo 1,5 ml e mescolare bene con la soluzione perline. </li><li> Porre le provette su un supporto magnetico per 2 minuti per consentire la separazione delle sfere dalla soluzione. Aspirare il surnatante, e lavare le perline con l&#39;80% fresco preparato EtOH due volte mentre il tubo è sul supporto magnetico. </li><li> Aspirare la soluzione di etanolo completamente e consentire alle sfere di asciugare all&#39;aria per 15 min a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Prendete il tubo dal supporto e risospendere magnetici perle a 17,5 ml Resuspension Buffer. </li><li> Porre le provette di nuovo sul supporto magnetico per 2 minuti a perline separati dal Resuspension Buffer. Rimuovere la Resuspension Buffer (prodotto finale di riparazione è risospeso nel buffer Resuspension ora) in una provetta PCR clean. </li></ol> 2.1.2) A-tailing <ol><li> Aggiungere 12,5 ml mix A-tailing nel tubo di PCR contenente prodotto end-riparazione e mescolare accuratamente. </li&gt; <li> Incubare la provetta PCR a 37 ° C per 30 minuti in un termociclatore pre-riscaldato (37 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adattatore legatura <ol><li> Aggiungere 2,5 microlitri Risospensione tampone, 2,5 microlitri legatura Mix, e 2,5 microlitri DNA adattatore Indice nella reazione A-tailing. </li><li> Incubare la reazione a 30 ° C per 30 minl in un termociclatore pre-riscaldato (30 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C. </li><li> Aggiungere 5 ml di arresto legatura tampone in ogni reazione e mescolare accuratamente. </li><li> Mescolare 42,5 ml ben mescolato sfere magnetiche per pulire la reazione seguente procedura 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Aggiungere 50 microlitri Risospensione tampone per eluire il prodotto adattatore ligato. </li><li> Pulire il prodotto adattatore legatura per la seconda volta con 50 microlitri ben mescolato perline AMPure XP, ed eluire il prodotto in 25 microlitri Risospensione tampone in una provetta pulita PCR. </li></ol> 2.1.4) frammenti di DNA Amplify <ol><li> Aggiungere 5 microlitri PCR Primer Cocktail e 25 microlitri PCR Master Mix nella provetta PCR prodotto contenente adattatore-legatura e mescolare accuratamente. </li><li> Eseguire amplificazione in un termociclatore pre-programmato con le seguenti condizioni: 98 ° C per 30 sec; 10 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec; poi 72 ° C per 5 minuti e tenere a 10 ° C. </li><li> Pulire la reazione con 50 sfere magnetiche microlitri ben mescolato, ed eluire il prodotto finale in 30 microlitri Resuspension Buffer. </li></ol> 2.1.5) Biblioteca convalida <ol><li> Quantificare il prodotto finale con un fluorimetro utilizzando il protocollo del produttore. Concentrazione biblioteca finale è compresa tra 2,5 e 20 ng / ml. </li><li> Valutare la qualità del prodotto finale utilizzando uno strumento di analisi con DNA chip alta sensibilità secondo il protocollo del produttore. Aspettatevi una singola banda con il formato previsto per entrambi IGVHFR1, IGVHFR2 o IGVHFR3. Tidimensioni xpected del prodotto biblioteca è uguale alla dimensione del VDJ amplicone originale più le dimensioni degli adattatori (~ 125 bp). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling e Sequencing <ol><li> Calcolare la molarità di ciascuna frazione libreria utilizzando la seguente formula: nM = [(ng / 1000) / * 660 bp] x 10 9 dove ng è la concentrazione della biblioteca VDJ-PCR misurata nel passaggio 2.1.5.1 e bp è il picco dimensione della libreria VDJ-PCR misurata al punto 2.1.5.2. </li><li> Diluire la libreria di 2 Nm (totale 10 ml) con acqua priva di DNasi. </li><li> Combinare i 10 ml di 2 librerie nM insieme diluito in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere un volume uguale di Phix controllo spike-in nel tubo 1,5 ml. </li><li> Caricare la piscina a una concentrazione 07:00 su una cella a flusso. </li><li> Sequenziare le librerie utilizzando un sequencer ciclo accoppiato-end 150 secondo il protocollo del produttore. </li></ol> Analisi 3. Dati Nota: Un summary degli script bioinformatica utilizzati in questa sezione si trova un file Codice supplementare. 3.1) Allineamento e QC <ol><li> Mappa accoppiato-end sequenziamento legge contro un IGH V umana, D e J regione del database scaricato dal sito IMGT 11 utilizzando un algoritmo esplosione nucleotide adattato in base al &#39;BLASTN&#39; disponibile da NCBI con divario penale aperto di 2, divario penale estensione di 1, lunghezza della parola di 7, e la soglia e-valore di 10 -4. Eliminare la coppia lettura non mappare sia l&#39;IGH V e una regione J. </li><li> Contare le restanti coppie di lettura che hanno IGH V e J mappature per ottenere le frequenze di corrispondenza combinazioni VJ in tutti leggere coppie ottenuti dal sequenziamento corsa sul campione. Count una lettura coppia se è mappato sia l&#39;IGH V e J gene, e quindi aggiungere il suo allele al conteggio corrispondente per la particolare combinazione VJ. </li><li> Classificare i conteggi per ogni regione VDJ ricombinato ottenuto dalla 3.1.2 dall&#39;altoest al più basso. La regione VDJ ha la più alta legge conteggio viene definito come combinazione riarrangiamento principale. </li><li> Scartare sequenze allineate che coprono meno del 35% del dominio principale riarrangiamento identificato nel 3.1.3. </li></ol> 3.2) SHM profilo di identificazione <ol><li> Contare tutti i modelli SHM attraverso la legge dal punto 3.1.3. Definire ogni modello SHM come sottoclone. </li><li> Contare il numero dei subcloni che sono corrispondenti a differenti modelli unici SHM, e il numero di letture che vengono mappati alle singole sottocloni. </li></ol> 3.3) Rappresentazione grafica dei risultati <ol><li> Eseguire l&#39;analisi filogenetica sulle subcloni utilizzando i loro corrispondenti modelli SHM utilizzando un quartiere metodo dal pacchetto R &quot;ape&quot; giunzione secondo il protocollo del produttore. Calcolare una matrice di distanza dai singoli schieramenti distinti per ricreare la filogenesi subclone radicato alla sequenza germinale del VJ combinazione in questione per ogni set di campioni appaiati. </li><li> Utilizzare la sequenza nucleotidica di ogni subclone come carattere vettoriale e calcolare la distanza approssimativa corda tra tutti i subcloni in maggiore riarrangiamento VJ sia per la diagnosi e campioni ricaduta corrispondenti utilizzando una misura di distanza Levenshtein dove matematicamente la distanza tra due allineamenti è dato da d x, y (i, j), dove d x, y (i, j) = 1 se i ≠ j e 0 altrimenti, e poi riassumere questa funzione per tutta la lunghezza della stringa corrispondente al nucleotide sequenze ie j. </li><li> Graficamente visualizzare la matrice risultante delle distanze e dei loro corrispondenti subclone conteggi subclone nei seguenti due modi: <ol><li> Utilizzare pacchetto R &quot;massa&quot;, secondo il protocollo del produttore di applicare scaling multidimensionale alla matrice distanza subclone e generare un principio bidimensionale coordinate della mappa, che viene poi tracciata con il logaritmodi conteggi subclonal come il raggio del cerchio. </li><li> Costruire un grafo non orientato in base alla distanza Levenshtein, dove i vertici corrispondono a ogni subclone distinta derivante dal maggiore riarrangiamento VJ. Nota: Se la distanza tra due cloni distinti è uguale a uno allora esiste un arco tra i due vertici. Se la distanza è maggiore di uno, allora vi è un fronte che li collega. </li><li> Tracciare il grafico del 3.3.3.2 usando la funzione tkplot nel pacchetto R &quot;IGRAPH&quot; con il layout Kamada Kawai secondo il protocollo del produttore. Il raggio dei vertici è proporzionale alla radice al cubo del numero totale di cloni mappati ad esso e l&#39;ombreggiatura utilizza un intervallo rosso e blu per indicare la proporzione di cloni che o appartengono alla diagnosi (blu) o recidiva (rosso) campioni . </li></ol></li></ol> 3.4) eterogeneità (Entropy) Misura <ol><li> Esaminare i numeri e conteggi sottoclone delmodelli individuali di mutazione somatica che si verificano nella principale riarrangiamento VJ per ogni set di campioni appaiati. </li><li> Calcolare l&#39;entropia empirica e l&#39;entropia empirica residuo corretto per il numero di cloni distinti in ciascun campione usando la stima entropia basato istogramma standard. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

A causa del numero quasi illimitato di iterazioni di informazioni sequenza codificata da VDJ riarrangiamento e SHM al locus IGH delle cellule B umane, l&#39;esame di tutto il repertorio IGH da high-throughput deep-sequenziamento ha dimostrato di essere un modo efficace e completo per delineare clonale e le popolazioni di cellule B sub-clonali. Inoltre, questa strategia può essere usato per studiare il percorso evoluzione clonale di sviluppo delle cellule B tumorali, remissione e ricaduta confrontando le architetture clo...

Il cancro è una malattia clonale. Da trenta anni fa, quando Peter C. Nowell ha proposto il cancro clonale evoluzione del modello 1, molti studi hanno cercato di sezionare popolazioni clonali in campioni di tumore e ricostruire espansione ed evoluzione modelli clonali che sono alla base del processo di tumorigenesi 2. Recentemente, tutto il sequenziamento del genoma ha permesso agli investigatori di dare uno sguardo profondo alla eterogeneità clonale e l&#39;evoluzione 3,4. Tuttavia, a causa della mancanza di marcatori trattabili in molti tipi cellulari, è difficile dedurre la precisa architettura clonale e percorso evolutivo. Fortunatamente c&#39;è un marcatore clonalità naturale in cellule B mature da cui molti tumori maligni linfoidi, tra cui DLBCL, sono originari. In risposta alla stimolazione antigenica, ogni B-cella può formare una singola produttivo sequenza IgH VDJ unendo un V H (variabile), un D (diversità), e un J H (giunzione) segmento insieme da una grande piscina di questi segmenti. Durante questo process, piccole porzioni di sequenza originale possono essere cancellati e ulteriori nucleotidi non-templated possono essere aggiunti per creare un riarrangiamento VDJ unico. Questa riorganizzazione VDJ specifico può essere ereditata in tutta la progenie di questo B-cellule, quindi la codifica B-cellula matura individuale e la sua prole 5. Inoltre, SHM verifica sulle sequenze VDJ ricombinati nella reazione successiva centro germinativo (GC) per introdurre mutazioni aggiuntive per l&#39;espansione del pool di anticorpi e la valorizzazione di anticorpi affinità 6. Pertanto, confrontando e contrastanti VDJ e SHM modelli di linfoma campioni che hanno subito questi processi, intra-tumorale eterogeneità potrebbe essere delineato e clonale percorso evolutivo della malattia può essere desunta. In precedenza, VDJ riassetto e SHM potrebbero essere identificati mediante PCR amplificando le regioni ricombinati, clonazione dei prodotti di PCR, e successivamente sequenziamento Sanger per ottenere informazioni sulla sequenza. Questo mi avvicinos basso throughput e bassa resa, il recupero di solo una piccola parte di tutto il repertorio VDJ ricombinato, e ostacolando la caratterizzazione della rappresentazione complessiva della popolazione clonale in un dato campione. Un approccio modificato è stato creato mediante la generazione di NGS indicizzati librerie sequenziamento dai prodotti VDJ PCR e l&#39;esecuzione di PE 2x150 bp sequenziamento di ottenere più di mezzo milione di sequenze VDJ ricombinate per campione. Inoltre, una pipeline personalizzata è stato sviluppato per eseguire il controllo di qualità (QC), allineare, filtro VDJ sequenziamento legge per identificare riarrangiamenti e SHMS di ogni lettura, ed eseguire analisi filogenetica sull&#39;architettura clonale di ogni campione. Inoltre, è stato stabilito un nuovo approccio per caratterizzare ulteriormente i modelli di evoluzione clonali per i campioni raccolti a vari stadi della malattia. Abbiamo applicato questa tecnica per i campioni dei pazienti DLBCL. DLBCL è una forma aggressiva di linfoma non-Hodgkin con frequenti recidive in un massimo di un thIRD dei pazienti 7. Ricadute DLBCL normalmente si verificano presto, entro 2 o 3 anni dalla diagnosi iniziale, anche se alcuni si verificano dopo 5 anni 8. La prognosi per i pazienti con recidiva è scarsa, con solo il 10% che raggiungeva 3 anni la sopravvivenza libera da progressione a causa di limitate opzioni di trattamento. Questa è la base per l&#39;urgente necessità di nuovi approcci per il trattamento di DLBCL ricaduta 9,10. Tuttavia, i meccanismi molecolari associati con DLBCL recidive sono ancora in gran parte sconosciute. In particolare, il ruolo di eterogeneità clonale al momento della diagnosi e l&#39;evoluzione clonale durante lo sviluppo ricaduta DLBCL sono attualmente indefinita, il che rende difficile la definizione di un biomarcatore accurate e utili per prevedere le ricadute. Per rispondere a queste domande, abbiamo applicato il nostro approccio VDJ-sequenza su più coppie di corrispondenti primario diagnosi-recidiva coppie di campioni DLBCL. Due distinti scenari evolutivi clonali di ricaduta emerse dal confronto delle architetture clonali tra la diagnosi e la samp ricadutales che suggerisce molteplici meccanismi molecolari può essere coinvolta in DLBCL ricaduta.

<table><tbody><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200 proof, per biologia molecolare</td></tr><tr><td>tampone TE</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris&middot; Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>xileni</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>proteinasi K</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Deossinucleotide trifosfato (dNTP) Soluzione Miscela</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>10 mM per nucleotide</td></tr><tr><td>10x tampone PCR&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11699105001</td><td>senza MgCl2</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA polimerasi d'oro con tampone d'oro e MgCl2</td><td>Life Technonogies</td><td>4311806</td><td>50 &; l a 5 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Scala di controllo delle dimensioni dei campioni</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>2-096-0020</td><td>33 reazioni</td></tr><tr><td>Saggio di ipermutazione somatica IGH v2.0 - Gel Detection</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>5-101-0030</td><td>33 reazioni, Mix 2 per la rilevazione IGVHFR1</td></tr><tr><td>Saggio di clonalità genica IGH - Rilevamento di gel</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>1-101-0020</td><td>33 reazioni, Provetta B per la rilevazione IGVHFR2</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 &; l a 5 U/&micro; l</td></tr><tr><td>10X tampone Tris-Borato-EDTA (TBE)</td><td>Corning (cellgro)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50x TAE BUFFER&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Soluzione di bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>25 bp DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10597011</td><td>1 &; g/&micro; l</td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>15628-019</td><td>1 &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide/Bis al 40%</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>50 colonne</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit di test ad alta sensibilità</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Kit DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizzatore</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorimetro</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di risospensione (Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di riparazione finale (Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)</td>Miscela di coda <td>A Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Miscela</td> di legatura Illumina <td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Indice dell'adattatore del DNA (Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di legatura di arresto (Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)</td>Cocktail di primer PCR <td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Miscela</td> master PCR Illumina <td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Life Technologies</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>170-8370</td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale evoluzione modelli di linfoma b cellulare

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

La comprensione clonalità tumore è fondamentale per comprendere i meccanismi coinvolti nella tumorigenesi e la progressione della malattia. Inoltre, comprendere i cambiamenti composizione clonali che si verificano all&#39;interno di un tumore in risposta a determinati microambiente o trattamenti possono portare alla progettazione di approcci più sofisticati ed efficaci per eliminare le cellule tumorali. Tuttavia, tumori clonali inseguimento sottopopolazioni è stato difficile a causa della mancanza di marcatori distinguibili. Per risolvere questo problema, un protocollo VDJ-ss è stato creato per tracciare i modelli di evoluzione clonali di linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) recidiva sfruttando VDJ ricombinazione e mutazione somatica (SHM), due caratteristiche uniche di linfomi a cellule B. In questo protocollo, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) librerie con potenziale di indicizzazione sono stati costruiti da amplificato immunoglobuline riarrangiato catena pesante (IgH) regione VDJ da coppie di diagnosi primaria e la recidiva DLBCL samples. In media più di mezzo milione di sequenze VDJ per campione sono stati ottenuti dopo il sequenziamento, che contengono sia VDJ riassetto e informazioni SHM. Inoltre, le condutture bioinformatica personalizzati sono stati sviluppati per utilizzare pienamente le informazioni di sequenza per la caratterizzazione di IgH-VDJ repertorio all&#39;interno di questi campioni. Inoltre, il gasdotto permette la ricostruzione e confronto dell&#39;architettura clonale dei tumori individuali, che consente l&#39;esame della eterogeneità clonale nei tumori diagnosi e la deduzione di modelli di evoluzione clonali fra la diagnosi e le coppie di recidiva del tumore. Quando si applica questa analisi a diverse coppie di diagnosi-recidiva, abbiamo scoperto le prove chiave che più tumorali distintivo modelli evolutivi potrebbero portare a DLBCL ricaduta. Inoltre, questo approccio può essere esteso ad altri aspetti clinici, come l&#39;identificazione della malattia minima residua, monitorare i progressi recidiva e la risposta al trattamento, e ricerca di repertorio immunitarioes in contesti non linfoma.

La procedura complessiva di VDJ sequenziamento (VDJ-seq), compresa l&#39;estrazione del DNA, ricombinato VDJ regione amplificazione e purificazione, la costruzione della libreria sequenziamento, legge elaborazione e analisi filogenetica, è rappresentato in figura 1. Ordinariamente 5-200 mg DNA può essere recuperato da sezioni di tessuto solido congelato o 0,5-20 mg DNA da sezioni di tessuto incluso in paraffina fissati in formalina. A seconda della qualità, modello riarrangiamento e SHM grado di singoli...

Questo protocollo descrive un approccio per interrogare le regioni VDJ della catena pesante delle immunoglobuline ricombinate dei linfomi mediante sequenziamento profondo e recuperare il riarrangiamento VDJ e lo stato di ipermutazione somatica per delineare l'architettura clonale del singolo tumore. Il confronto dell'architettura clonale tra la diagnosi accoppiata e i campioni di recidiva rivela le modalità di evoluzione clonale della recidiva del linfoma.

VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare la composizione clonale di campioni di linfoma al fine di identificare i modelli di evoluzione clonale nel linfoma ricorrente. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del linfoma, ad esempio come i tumori ricorrenti derivino dai tumori originali. Il principale vantaggio di questo protocollo è che adatta le più recenti tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, consentendo una mappatura più completa delle caratteristiche comuni nei linfomi.In questo protocollo, il DNA verrà estratto da sezioni sottili di tessuti normali o maligni congelati inclusi in OCT, così come da tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina, al fine di estrarre il DNA da tessuti congelati inclusi in OCT. Per prima cosa, digerire da 10 a 30 sezioni sottili in quattro millilitri di tampone di lisi per acidi nucleici con proteasi K e SDS allo 0,625% in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, aggiungere un millilitro di cloruro di sodio saturato 5 M alla miscela di digestione e agitare vigorosamente per 15 secondi, quindi centrifugare a 1.100 ×g per 15 minuti.A temperatura ambiente, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere due volumi di etanolo al 100% e mescolare capovolgendo il tubo da sei a otto volte, quindi centrifugare a 5.000 ×g per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Per raccogliere il DNA precipitato, lavare il pellet di DNA due volte con etanolo al 70%, centrifugando ogni volta a 5.000 ×g per 15 minuti.Per raccogliere il pellet, sciogliere il pellet di DNA in 100-400 microlitri di tampone TE a temperatura ambiente su un agitatore per tutta la notte per estrarre il DNA da sezioni sottili di tessuto fissato in formalina e inclusi in paraffina. Rimuovere innanzitutto la paraffina incubando le sezioni di paraffina in un millilitro di xilene due volte a temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta. Raccogliere le sezioni di tessuto centrifugando a 13.000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.Successivamente, rimuovere i residui di elene incubando le sezioni in un millilitro di etanolo al 100% due volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuna. Raccogliere le sezioni di tessuto centrifugando a 13.000 ×g per cinque minuti. A temperatura ambiente, lasciare asciugare le sezioni all'aria per 10-15 minuti.Aggiungere una soluzione di proteasi case appena preparata ai campioni in un volume finale di 50-100 µL e incubare tutta la notte a 37 °C il giorno successivo. Riscaldare i campioni a 95 °C per 10 minuti per inattivare la proteinasi. K. Il rendimento di DNA ottenuto dalle estrazioni mostrate nel segmento precedente è compreso tra 5 e 200 µg, a seconda delle dimensioni del tessuto.Il passo successivo consiste nel valutare la qualità di ciascun campione di DNA in una miscela per provetta PCR. Aggiungere 25 microlitri di polimerasi TDNA a 45 microlitri di master mix proveniente da un kit commerciale di marcatori. Aggiungere cinque microlitri di DNA nella provetta PCR e mescolare accuratamente aspirando e dispensando almeno cinque volte.Amplificare il DNA seguendo le condizioni descritte nel testo del protocollo. Successivamente, mescolare 20 microlitri della reazione PCR con quattro microlitri di colorante di caricamento 6x e caricare su un gel di agarosio al 2%. Al termine dell'elettroforesi, colorare il gel di agarosio con bromuro di etidio e rilevare i prodotti della PCR.Mediante un sistema di imaging per gel, i campioni che producono cinque prodotti di PCR di dimensioni pari a 100, 200, 300, 400 e 600 paia di basi verranno utilizzati esclusivamente per generare ampliconi VDJ. In questo video verrà illustrata l'amplificazione del segmento I-G-H-V-D-J ricombinato a partire dalla regione di quadro uno o IGV HFR uno. L'amplificazione del segmento I-G-H-B-D-J ricombinato a partire dalla regione di quadro due segue una procedura analoga ed è descritta nel testo del protocollo in una miscela per tubo PCR.45 microlitri di mix master dal tubo etichettato come mix due di un kit commerciale per saggio di IGH IPERMUTAZIONE somatica con rilevamento in gel, 25 microlitri di DNA polimerasi TAC e 5 microlitri di DNA del campione per amplificare il DNA seguendo le condizioni descritte nel testo del protocollo. Per amplificare in condizioni subottimali di PCR sul DNA, è possibile regolare i parametri estendendo il tempo di annealing o aumentando il numero di cicli di amplificazione. Separare tutti i prodotti della PCR mediante elettroforesi su un gel di AGAROSIO al 2%. Colorare il gel di AGAROSIO con una soluzione di bromuro di ETIDIO a 0,5 microgrammi per millilitro e rilevare i prodotti della PCR.Con un sistema di imaging per gel, ci si aspetta un amplicone monoclonale con una dimensione compresa tra 310 e 380 paia di basi. Estrarre la porzione di gel contenente l'amplicone monoclonale. Successivamente, purificare il DNA dal frammento di gel utilizzando un kit standard di estrazione da gel seguendo il protocollo del produttore.Per iniziare questa procedura, trasferire il prodotto purificato V-D-J-P-C-R in una provetta PCR e aggiungere il tampone di sospensione Resus del kit di preparazione del campione di DNA per portare il volume a 60 microlitri. Aggiungere 40 microlitri di mix di riparazione dei capi estremi del kit di preparazione del campione di DNA, mescolare accuratamente e incubare la reazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti in un termociclatore preriscaldato con coperchio preriscaldato a 100 gradi Celsius. Successivamente, mescolare 136 microlitri di microsferette magnetiche e 24 microlitri di acqua di grado PCR in una provetta da 1,5 millilitri e trasferire l'intera reazione di riparazione dei capi estremi nella provetta, mescolando bene con la soluzione di microsferette.Posizionare i tubi su un supporto magnetico per due minuti per consentire la separazione delle perle dalla soluzione. Aspirare il sopranatante e lavare le perle due volte con etanolo all'80% appena preparato. Aspirare completamente la soluzione di etanolo e lasciare asciugare le perle all'aria per 15 minuti a temperatura ambiente.Dopo 15 minuti, rimuovere le provette dal supporto magnetico e risospendere le perle in 17,5 microlitri di tampone di risospensione. Rimettere le provette sul supporto magnetico per due minuti per separare le perle dal tampone di risospensione. Trasferire il tampone di risospensione, che ora contiene il prodotto della riparazione degli estremi, in una provetta PCR pulita.Il passaggio successivo consiste nell'aggiungere una coda a al prodotto della riparazione dei capi. Aggiungere 12,5 µL della miscela di tailing A nel tubo PCR contenente il prodotto della riparazione dei capi e mescolare accuratamente. Incubare i tubi PCR a 37 °C per 30 minuti in un termociclatore preriscaldato con coperchio preriscaldato a 100 °C.Per la ligazione degli adattatori, aggiungere 2,5 microlitri di tampone di sospensione Resus, 2,5 microlitri di mix di ligazione e 2,5 microlitri di indice dell'adattatore di DNA nella reazione di tailing. Incubare la reazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti in un termociclatore preriscaldato con coperchio preriscaldato a 100 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, aggiungere cinque microlitri di tampone di arresto della ligazione in ogni reazione e mescolare accuratamente.Aggiungere 42,5 microlitri di microsferette magnetiche ben miscelate a ciascuna reazione e lavare con etanolo al 80% come mostrato in precedenza. Aggiungere 50 microlitri di tampone di sospensione Resus per eluire il prodotto legato all'adattatore. Pulire il prodotto legato all'adattatore per la seconda volta utilizzando 50 microlitri di microsferette Ampu XP ben miscelate ed eluire il prodotto in 25 microlitri di tampone di sospensione Resus in una provetta PCR pulita.Per amplificare l'amplicone VDJ, aggiungere cinque microlitri di cocktail di primer PCR e 25 microlitri di mix master PCR al tubo PCR contenente il prodotto con adattatore ligato e mescolare accuratamente; eseguire l'amplificazione in un termociclatore con le condizioni descritte nel testo del protocollo. Al termine dell'amplificazione, purificare la reazione utilizzando 50 microlitri di microsferette magnetiche ben miscelate ed eluire il prodotto finale in 30 microlitri di tampone Resus. La libreria dell'amplicone VTJ viene successivamente convalidata, raggruppata e sequenziata come descritto nel testo del protocollo. Poiché la complessità della libreria di sequenziamento VVG è bassa, si raccomanda di aggiungere un 20-50% di FI come spaziatura nei campioni di sequenziamento approvati per consentire una chiamata accurata delle basi. Queste immagini rappresentative di gel mostrano i prodotti dell'amplicone V-D-J-P-C-R ottenuti da DNA estratto da campioni di pazienti con linfoma. La qualità dell'amplicone V-D-J-P-C-R prima e dopo la costruzione della libreria è stata valutata mediante bioanalizzatore. Lo spostamento di dimensione da 334 paia di basi a 459 paia di basi indica l'aggiunta dell'adattatore per tracciare l'evoluzione clonale di un caso di recidiva di linfoma diffuso a grandi cellule B. &Egrave; stata eseguita l'analisi filogenetica dei profili di mutazione iper-somatica o SHM delle principali riarrangiamenti VDJ della catena pesante tra i campioni di diagnosi e di recidiva.È stato osservato il modo di evoluzione clonale divergente tardivo. Sono stati sviluppati nuovi metodi grafici per visualizzare l'evoluzione clonale. I modelli mostrati sono grafici di scalatura multidimensionale di un modello di recidiva divergente tardivo e di uno divergente precoce.Il raggio di ogni cerchio indica il numero di sottocloni corrispondente a un particolare profilo di mutazione somatica (SHM). Il blu corrisponde al campione di diagnosi, mentre il rosso corrisponde al campione di recidiva. Analogamente, i grafi non orientati mostrano come la distribuzione dei conteggi dei sottocloni nel caso di divergenza tardiva differisca da quella del caso di divergenza precoce.I bordi corrispondono a due profili di mutazione somatica (SHM) con una distanza di stringa pari a un carattere, e la barra della scala cromatica indica la proporzione di sequenze associate a un particolare profilo SHM, corrispondente al campione diagnostico rosso o al campione di recidiva giallo. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante evitare contaminazioni incrociate tra i campioni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare la qualità dei campioni tumorali di linfoma.Questo approccio può essere utilizzato anche per tracciare la malattia residua minima e analizzare la risposta della sorveglianza immunitaria ai tumori. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare (Video) | JoVE Journal

VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

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