VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare la composizione clonale di campioni di linfoma al fine di identificare i modelli di evoluzione clonale nel linfoma ricorrente. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del linfoma, ad esempio come i tumori ricorrenti derivino dai tumori originali. Il principale vantaggio di questo protocollo è che adatta le più recenti tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, consentendo una mappatura più completa delle caratteristiche comuni nei linfomi.

In questo protocollo, il DNA verrà estratto da sezioni sottili di tessuti normali o maligni congelati inclusi in OCT, così come da tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina, al fine di estrarre il DNA da tessuti congelati inclusi in OCT. Per prima cosa, digerire da 10 a 30 sezioni sottili in quattro millilitri di tampone di lisi per acidi nucleici con proteasi K e SDS allo 0,625% in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, aggiungere un millilitro di cloruro di sodio saturato 5 M alla miscela di digestione e agitare vigorosamente per 15 secondi, quindi centrifugare a 1.100 ×g per 15 minuti.

A temperatura ambiente, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere due volumi di etanolo al 100% e mescolare capovolgendo il tubo da sei a otto volte, quindi centrifugare a 5.000 ×g per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Per raccogliere il DNA precipitato, lavare il pellet di DNA due volte con etanolo al 70%, centrifugando ogni volta a 5.000 ×g per 15 minuti.

Per raccogliere il pellet, sciogliere il pellet di DNA in 100-400 microlitri di tampone TE a temperatura ambiente su un agitatore per tutta la notte per estrarre il DNA da sezioni sottili di tessuto fissato in formalina e inclusi in paraffina. Rimuovere innanzitutto la paraffina incubando le sezioni di paraffina in un millilitro di xilene due volte a temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta. Raccogliere le sezioni di tessuto centrifugando a 13.000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, rimuovere i residui di elene incubando le sezioni in un millilitro di etanolo al 100% due volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuna. Raccogliere le sezioni di tessuto centrifugando a 13.000 ×g per cinque minuti. A temperatura ambiente, lasciare asciugare le sezioni all'aria per 10-15 minuti.

Aggiungere una soluzione di proteasi case appena preparata ai campioni in un volume finale di 50-100 µL e incubare tutta la notte a 37 °C il giorno successivo. Riscaldare i campioni a 95 °C per 10 minuti per inattivare la proteinasi. K. Il rendimento di DNA ottenuto dalle estrazioni mostrate nel segmento precedente è compreso tra 5 e 200 µg, a seconda delle dimensioni del tessuto.

Il passo successivo consiste nel valutare la qualità di ciascun campione di DNA in una miscela per provetta PCR. Aggiungere 25 microlitri di polimerasi TDNA a 45 microlitri di master mix proveniente da un kit commerciale di marcatori. Aggiungere cinque microlitri di DNA nella provetta PCR e mescolare accuratamente aspirando e dispensando almeno cinque volte.

Amplificare il DNA seguendo le condizioni descritte nel testo del protocollo. Successivamente, mescolare 20 microlitri della reazione PCR con quattro microlitri di colorante di caricamento 6x e caricare su un gel di agarosio al 2%. Al termine dell'elettroforesi, colorare il gel di agarosio con bromuro di etidio e rilevare i prodotti della PCR.

Mediante un sistema di imaging per gel, i campioni che producono cinque prodotti di PCR di dimensioni pari a 100, 200, 300, 400 e 600 paia di basi verranno utilizzati esclusivamente per generare ampliconi VDJ. In questo video verrà illustrata l'amplificazione del segmento I-G-H-V-D-J ricombinato a partire dalla regione di quadro uno o IGV HFR uno. L'amplificazione del segmento I-G-H-B-D-J ricombinato a partire dalla regione di quadro due segue una procedura analoga ed è descritta nel testo del protocollo in una miscela per tubo PCR.

45 microlitri di mix master dal tubo etichettato come mix due di un kit commerciale per saggio di IGH IPERMUTAZIONE somatica con rilevamento in gel, 25 microlitri di DNA polimerasi TAC e 5 microlitri di DNA del campione per amplificare il DNA seguendo le condizioni descritte nel testo del protocollo. Per amplificare in condizioni subottimali di PCR sul DNA, è possibile regolare i parametri estendendo il tempo di annealing o aumentando il numero di cicli di amplificazione. Separare tutti i prodotti della PCR mediante elettroforesi su un gel di AGAROSIO al 2%. Colorare il gel di AGAROSIO con una soluzione di bromuro di ETIDIO a 0,5 microgrammi per millilitro e rilevare i prodotti della PCR.

Con un sistema di imaging per gel, ci si aspetta un amplicone monoclonale con una dimensione compresa tra 310 e 380 paia di basi. Estrarre la porzione di gel contenente l'amplicone monoclonale. Successivamente, purificare il DNA dal frammento di gel utilizzando un kit standard di estrazione da gel seguendo il protocollo del produttore.

Per iniziare questa procedura, trasferire il prodotto purificato V-D-J-P-C-R in una provetta PCR e aggiungere il tampone di sospensione Resus del kit di preparazione del campione di DNA per portare il volume a 60 microlitri. Aggiungere 40 microlitri di mix di riparazione dei capi estremi del kit di preparazione del campione di DNA, mescolare accuratamente e incubare la reazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti in un termociclatore preriscaldato con coperchio preriscaldato a 100 gradi Celsius. Successivamente, mescolare 136 microlitri di microsferette magnetiche e 24 microlitri di acqua di grado PCR in una provetta da 1,5 millilitri e trasferire l'intera reazione di riparazione dei capi estremi nella provetta, mescolando bene con la soluzione di microsferette.

Posizionare i tubi su un supporto magnetico per due minuti per consentire la separazione delle perle dalla soluzione. Aspirare il sopranatante e lavare le perle due volte con etanolo all'80% appena preparato. Aspirare completamente la soluzione di etanolo e lasciare asciugare le perle all'aria per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo 15 minuti, rimuovere le provette dal supporto magnetico e risospendere le perle in 17,5 microlitri di tampone di risospensione. Rimettere le provette sul supporto magnetico per due minuti per separare le perle dal tampone di risospensione. Trasferire il tampone di risospensione, che ora contiene il prodotto della riparazione degli estremi, in una provetta PCR pulita.

Il passaggio successivo consiste nell'aggiungere una coda a al prodotto della riparazione dei capi. Aggiungere 12,5 µL della miscela di tailing A nel tubo PCR contenente il prodotto della riparazione dei capi e mescolare accuratamente. Incubare i tubi PCR a 37 °C per 30 minuti in un termociclatore preriscaldato con coperchio preriscaldato a 100 °C.

Per la ligazione degli adattatori, aggiungere 2,5 microlitri di tampone di sospensione Resus, 2,5 microlitri di mix di ligazione e 2,5 microlitri di indice dell'adattatore di DNA nella reazione di tailing. Incubare la reazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti in un termociclatore preriscaldato con coperchio preriscaldato a 100 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, aggiungere cinque microlitri di tampone di arresto della ligazione in ogni reazione e mescolare accuratamente.

Aggiungere 42,5 microlitri di microsferette magnetiche ben miscelate a ciascuna reazione e lavare con etanolo al 80% come mostrato in precedenza. Aggiungere 50 microlitri di tampone di sospensione Resus per eluire il prodotto legato all'adattatore. Pulire il prodotto legato all'adattatore per la seconda volta utilizzando 50 microlitri di microsferette Ampu XP ben miscelate ed eluire il prodotto in 25 microlitri di tampone di sospensione Resus in una provetta PCR pulita.

Per amplificare l'amplicone VDJ, aggiungere cinque microlitri di cocktail di primer PCR e 25 microlitri di mix master PCR al tubo PCR contenente il prodotto con adattatore ligato e mescolare accuratamente; eseguire l'amplificazione in un termociclatore con le condizioni descritte nel testo del protocollo. Al termine dell'amplificazione, purificare la reazione utilizzando 50 microlitri di microsferette magnetiche ben miscelate ed eluire il prodotto finale in 30 microlitri di tampone Resus. La libreria dell'amplicone VTJ viene successivamente convalidata, raggruppata e sequenziata come descritto nel testo del protocollo.

Poiché la complessità della libreria di sequenziamento VVG è bassa, si raccomanda di aggiungere un 20-50% di FI come spaziatura nei campioni di sequenziamento approvati per consentire una chiamata accurata delle basi. Queste immagini rappresentative di gel mostrano i prodotti dell'amplicone V-D-J-P-C-R ottenuti da DNA estratto da campioni di pazienti con linfoma. La qualità dell'amplicone V-D-J-P-C-R prima e dopo la costruzione della libreria è stata valutata mediante bioanalizzatore.

Lo spostamento di dimensione da 334 paia di basi a 459 paia di basi indica l'aggiunta dell'adattatore per tracciare l'evoluzione clonale di un caso di recidiva di linfoma diffuso a grandi cellule B. È stata eseguita l'analisi filogenetica dei profili di mutazione iper-somatica o SHM delle principali riarrangiamenti VDJ della catena pesante tra i campioni di diagnosi e di recidiva.

È stato osservato il modo di evoluzione clonale divergente tardivo. Sono stati sviluppati nuovi metodi grafici per visualizzare l'evoluzione clonale. I modelli mostrati sono grafici di scalatura multidimensionale di un modello di recidiva divergente tardivo e di uno divergente precoce.

Il raggio di ogni cerchio indica il numero di sottocloni corrispondente a un particolare profilo di mutazione somatica (SHM). Il blu corrisponde al campione di diagnosi, mentre il rosso corrisponde al campione di recidiva. Analogamente, i grafi non orientati mostrano come la distribuzione dei conteggi dei sottocloni nel caso di divergenza tardiva differisca da quella del caso di divergenza precoce.

I bordi corrispondono a due profili di mutazione somatica (SHM) con una distanza di stringa pari a un carattere, e la barra della scala cromatica indica la proporzione di sequenze associate a un particolare profilo SHM, corrispondente al campione diagnostico rosso o al campione di recidiva giallo. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante evitare contaminazioni incrociate tra i campioni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare la qualità dei campioni tumorali di linfoma.

Questo approccio può essere utilizzato anche per tracciare la malattia residua minima e analizzare la risposta della sorveglianza immunitaria ai tumori. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.