VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare la composizione clonale di campioni di linfoma per l'identificazione dei modelli di evoluzione clonale della recidiva del linfoma. Questo metodo può aiutare ad affrontare domande chiave nel campo del linfoma, come ad esempio l'origine dei tumori recidivanti dai tumori originali. Il vantaggio principale di questo protocollo è che adatta la più recente tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento per consentire una mappatura più completa delle comunanze del linfoma.

In questo protocollo, il DNA sarà estratto da sezioni sottili di OCT congelato incorporato e da tessuto normale o maligno incorporato in paraffina formale e fissa per estrarre il DNA da tessuti incorporati in OCT congelato. Per prima cosa digerire da 10 a 30 sezioni sottili in quattro millilitri di tampone di lisi nucleica con protasi K e 0,625% di SDS in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, aggiungere un millilitro di cloruro di sodio saturo a cinque molari alla miscela di digestione e agitare energicamente per 15 secondi, centrifugare a 1, 100 volte G per 15 minuti.

A temperatura ambiente, trasferire il supinato in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere due volumi di etanolo al 100%, aggiungere la miscela capovolgendo la provetta da sei a otto volte, centrifugare a 5.000 volte G per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Per raccogliere il DNA precipitato, lavare il pellet di DNA due volte con centrifuga di etanolo al 70% a 5.000 volte G per 15 minuti ogni volta.

Per raccogliere il pellet, sciogliere il pellet di DNA in 100-400 microlitri di tampone TE a temperatura ambiente su un agitatore durante la notte per estrarre il DNA da sezioni sottili di tessuto incorporato in paraffina fissata con formina. Per prima cosa deparize incubando le sezioni di paraffina in un millilitro di xilene due volte a temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta. Raccogliere le sezioni di tessuto centrifugando a 13.000 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, rimuovere i residui incubando le sezioni in un millilitro di etanolo al 100% due volte a temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta. Raccogliere le sezioni di tessuto centrifugando a 13.000 volte G per cinque minuti. A temperatura ambiente, asciugare le sezioni all'aria a temperatura ambiente per 10-15 minuti.

Aggiungere ai campioni una soluzione di proteasi appena preparata in un volume finale da 50 a 100 microlitri e incubare per una notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti per inattivare la proteinasi. K. La resa del DNA dalle estrazioni dimostrate nel segmento precedente è compresa tra cinque e 200 microgrammi a seconda delle dimensioni del tessuto.

Il passo successivo consiste nel valutare la qualità di ciascun campione di DNA in una miscela di provette per PCR. Puntare 25 microlitri di TDNA polimerasi con 45 microlitri di master mix da un kit ladder commerciale. Aggiungere cinque microlitri di DNA nella provetta PCR e mescolare bene pipettando su e giù almeno cinque volte.

Amplificare il DNA seguendo le condizioni dettagliate nel testo del protocollo. Successivamente, mescolare 20 microlitri della reazione PCR con quattro microlitri di colorante di carico sei x e caricare su un gel al 2%aros. Quando l'elettroforesi è completa, colorare il gel AGROS con bromuro di Ethereum e rilevare i prodotti della PCR.

Con un sistema di imaging su gel, i campioni che producono cinque prodotti PCR alle dimensioni di 100, 200, 300, 400 e 600 coppie di basi saranno utilizzati solo per generare ampliconi VDJ. In questo video verrà dimostrata l'amplificazione del segmento I-G-H-V-D-J ricombinato dalla regione quadro uno o IGV HFR uno. L'amplificazione del segmento I-G-H-B-D-J ricombinato dalla regione quadro due segue una procedura simile ed è descritta nel testo del protocollo in una miscela di provette PCR.

45 microlitri di master mix dalla miscela marcata con provetta, due di un test di ipermutazione IGH somatico commerciale per il punto del kit di rilevamento del gel, 25 microlitri di TAC DNA polimerasi e cinque microlitri di DNA campione amplificano il DNA seguendo le condizioni descritte nel testo del protocollo: Per amplificare le condizioni D-N-A-P-C-R non ottimali possono essere regolate estendendo un tempo di inginocchiamento o aumentando il ciclo di amplificazione. Numeri. Risolvere l'intero prodotto PCR mediante elettroforesi e una colorazione in gel AGROS al 2%. Il gel AGROS con una soluzione di bromuro Ethereum da 0,5 microgrammi per millilitro e rileva i prodotti PCR.

Con un sistema di imaging su gel, è previsto un amplicone monoclonale con un intervallo di dimensioni compreso tra 310 e 380 coppie di basi. Esci la porzione di gel contenente l'amplicone monoclonale. Successivamente purificare il DNA dall'accisa al gel utilizzando un kit standard di estrazione del gel secondo il protocollo del produttore.

Per iniziare questa procedura, trasferire il prodotto V-D-J-P-C-R purificato in una provetta PCR e aggiungere il tampone di sospensione Resus dal kit di preparazione del campione di DNA per portare il volume a 60 microlitri. Aggiungere 40 microlitri di miscela di riparazione finale dal kit di preparazione del campione di DNA e mescolare accuratamente, incubare la reazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti in un termociclatore preriscaldato con un coperchio preriscaldato a 100 gradi Celsius. Quindi, mescolare 136 microlitri di microsfere magnetiche e 24 microlitri di acqua di grado PCR in una provetta da 1,5 millilitri e trasferire l'intera reazione di riparazione finale nella provetta e mescolare bene con la soluzione di perline.

Posizionare i tubi su un supporto magnetico per due minuti per consentire la separazione delle perle dalla soluzione. Aspirare il surnatante e lavare due volte le perle con etanolo all'80% appena preparato. Aspirare completamente la soluzione di etanolo e lasciare asciugare le perle all'aria per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo 15 minuti, togliere i tubi dal supporto magnetico e risospendere le perle in 17,5 microlitri di Resus Suspension Buffer. Riposizionare le provette sul supporto magnetico per due minuti per separare le perline dal tampone di sospensione Resus. Trasferire il tampone di sospensione Resus, che ora contiene il prodotto per la riparazione finale, in una provetta PCR pulita.

Il prossimo passo è aggiungere la coda al prodotto di riparazione finale. Aggiungere 12,5 microlitri di una miscela di sterili nella provetta PCR contenente il prodotto per la riparazione finale e mescolare accuratamente. Incubare le provette per PCR a 37 gradi Celsius per 30 minuti in un termociclatore preriscaldato con un coperchio preriscaldato a 100 gradi Celsius.

Per la legatura dell'adattatore, aggiungere 2,5 microlitri di tampone di sospensione Resus, 2,5 microlitri di miscela di legatura e 2,5 microlitri di indice dell'adattatore di DNA nella reazione di coda a. Incubare la reazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti e un termociclatore preriscaldato con un coperchio preriscaldato a 100 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, aggiungere cinque microlitri di tampone di legatura stop in ogni reazione e mescolare accuratamente.

Aggiungere 42,5 microlitri di microsfere magnetiche ben miscelate a ciascuna reazione e lavare con etanolo all'80% come mostrato in precedenza. Aggiungere 50 microlitri di tampone di sospensione Resus per eluire il prodotto legato con adattatore. Pulire il prodotto legato con adattatore per la seconda volta utilizzando 50 microlitri di perle XPU ampu ben miscelate ed eluire il prodotto in 25 microlitri di tampone di sospensione Resus in una provetta PCR pulita.

Per amplificare il VDJ Amplicon, aggiungere cinque microlitri di cocktail di primer PCR e 25 microlitri di PCR master mix alla provetta PCR contenente il prodotto legato adattatore e mescolare accuratamente eseguire l'amplificazione in un termociclatore con le condizioni descritte nel testo del protocollo. Al termine dell'amplificazione, ripulire la reazione utilizzando 50 microlitri di biglie magnetiche ben miscelate, eluire il prodotto finale in 30 microlitri di tampone Resus. La libreria VTJ Amplicon viene successivamente convalidata, raggruppata e sequenziata come descritto nel testo del protocollo.

Poiché la complessità della libreria di sequenziamento VVG è bassa, si consiglia di aggiungere una specifica FI dal 20 al 50% nei campioni di sequenziamento approvati per consentire una chiamata basata su un'accuratezza. Queste immagini rappresentative del gel mostrano i prodotti V-D-J-P-C-R Amplicon dal DNA estratto da campioni di pazienti con linfoma. La qualità dell'amplicone V-D-J-P-C-R prima e dopo la costruzione della libreria è stata valutata da un bioanalizzatore.

Lo spostamento delle dimensioni da 334 paia di basi a 459 paia di basi indica l'aggiunta dell'adattatore per tracciare l'evoluzione clonale di un caso diffuso di recidiva di linfoma a grandi cellule B. Analisi filogenetica dell'ipermutazione somatica o dei profili SHM dei principali riarrangiamenti VDJ a catena pesante. Tra la diagnosi e i campioni di recidiva è stato eseguito.

È stata osservata la modalità di evoluzione clonale divergente tardiva. Sono stati sviluppati nuovi metodi grafici per visualizzare l'evoluzione clonale. I modelli mostrati sono grafici di scala multidimensionali di un modello di recidiva divergente tardiva e di un modello di recidiva divergente precoce.

Il raggio di ciascun cerchio indica il numero di subcloni corrispondenti a un particolare profilo SHM. Il blu corrisponde al campione diagnostico e il rosso corrisponde al campione di recidiva. Allo stesso modo, i grafici non orientati mostrano la distribuzione del conteggio dei sottocloni nel caso divergente tardivo differisce dal caso divergente iniziale.

I bordi corrispondono a due profili SHM aventi una distanza tra le stringhe di una lettera di separazione e la barra della scala dei colori indica la proporzione delle sequenze che si mappano su un particolare profilo SHM corrispondente al campione di diagnosi rosso o al campione di recidiva giallo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante evitare contaminazioni incrociate tra i campioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare l'alità dei campioni di tumore del linfoma.

Questo approccio può essere utilizzato anche per tracciare la malattia residua minerale e sondare la risposta di sorveglianza immunitaria ai tumori. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.