Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare la tecnologia di consumo di ossigeno basata su micropiastre per valutare la funzione della catena di trasporto degli elettroni, della via di ossidazione beta del ciclo TCA e dei trasportatori del substrato. Ciò si ottiene preparando prima il substrato e le soluzioni di iniezione per il saggio. Il secondo passo consiste nell'aggiungere le soluzioni iniettabili in una cartuccia di saggio tric precedentemente idratata per calibrare la macchina per il consumo di ossigeno.

Successivamente, preparare le soluzioni del substrato mitocondriale e caricare queste soluzioni nella piastra di coltura cellulare. Ruotare la piastra di coltura cellulare per consentire l'aderenza mitocondriale alla piastra prima di caricare la piastra nel saggio metrico Respira. Si ottengono i risultati dello strumento che mostrano i tassi di consumo di ossigeno in base alla respirazione mitocondriale per ogni test metrico del respiro.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'elettrodo Clark, è che le tecnologie basate su micropiastre consentono un'acquisizione più efficiente e più elevata del consumo di ossigeno con quantità minori di mitocondri, generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa di tutte le parti mobili coinvolte nella preparazione delle soluzioni per il test La notte prima dell'esperimento Idratare la cartuccia del saggio tric in un millilitro di soluzione di calibrazione in un non Incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius il giorno successivo, estrarre tutti i gambi congelati e scongelarli in un bagno o in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Preparare tutte le soluzioni di substrato e le soluzioni di iniezione e conservarle in ghiaccio. Il passo successivo consiste nel programmare la macchina per la misurazione del consumo di ossigeno a più pozzetti in base ai parametri corretti di peso e misura della miscela.

Accedere al software di analisi e selezionare la modalità standard. Entra nel forum degli ospiti del cavalluccio marino e fai clic sulla procedura guidata del saggio. Una volta nella procedura guidata del saggio, fare clic su protocollo per modificare il peso della miscela e i parametri di misurazione.

Etichetta i pozzetti dello sfondo sotto la scheda di correzione posteriore e assicurati di evidenziare. Esegui la correzione dello sfondo. Etichetta le condizioni facendo clic prima sulla scheda Gruppi ed etichette, quindi sulla scheda Informazioni sul gruppo.

Dopo aver immesso questi parametri, fare clic su Fine e quindi su Salva modello. Per iniziare questa procedura, caricare le soluzioni iniettabili in una cartuccia di analisi. Fare attenzione a iniettare le soluzioni nelle porte appropriate.

Caricare la cartuccia del ciclo del test nella macchina con un angolo dentato in basso a sinistra. Avviare la calibrazione accedendo prima al software di analisi, quindi entrando nella modalità standard. Entra nel forum degli ospiti del cavalluccio marino.

Apri il modello salvato nell'unità XF nella scheda dei modelli. Una volta aperto, fare clic su Avvia per iniziare la calibrazione, che richiederà circa 30 minuti. I mitocondri per questa procedura sono stati isolati dal muscolo scheletrico rosso, mescolando delicatamente ma accuratamente il substrato dei mitocondri mescolando delicatamente la soluzione con un puntale per pipetta da 200 microlitri a cui sono stati tagliati circa tre millimetri dell'estremità.

Dopo aver determinato la concentrazione proteica del ceppo mitocondriale, sospendere 10 microgrammi di proteina mitocondriale per 200 microlitri della miscela di substrato nota del marciume succinato. Mescolare delicatamente ma accuratamente la soluzione del substrato mitocondriale mescolando delicatamente la soluzione con un puntale per pipetta da 200 microlitri a cui sono stati tagliati circa tre millimetri dell'estremità nello stesso modo. Banda di Reeses, 14 microgrammi di proteina mitocondriale per 200 microlitri di ciascuna delle restanti miscele di substrato posizionano tutte le miscele di substrato proteiche mitocondriali sul ghiaccio.

Posizionare una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti su ghiaccio e in triplice carico di 50 microlitri per pozzetto di ciascuna delle miscele di substrati mitocondriali. Gli sviluppatori del test tric basato su micropiastra raccomandano di lasciare un minimo di due pozzetti vuoti senza mitocondri, preferibilmente su entrambi i lati della piastra di coltura cellulare. Centrifugare la piastra di coltura cellulare a 2000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius per far aderire i mitocondri ai pozzetti mentre la piastra gira.

Riscaldare le soluzioni di substrato in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Al termine della centrifuga, caricare con cura 450 microlitri di ciascuna soluzione di substrato sopra i rispettivi pozzetti. Assicurati di caricare la piastra a temperatura ambiente.

Caricare i pozzetti vuoti con 500 microlitri di substrato grezzo. I pozzetti designati per il saggio a flusso di elettroni devono essere caricati con il substrato a flusso di elettroni, mentre i pozzetti bianchi del saggio accoppiato possono essere caricati con qualsiasi substrato del saggio di accoppiamento. Dopo aver aggiunto 450 microlitri di substrato a ciascuno, osservare bene lo strato di mitocondri nel pozzetto con un ingrandimento di 20 volte per garantire che i mitocondri siano dispersi uniformemente in un unico monostrato.

Come mostrato in questo esempio, i pozzetti dell'immagine che non sembrano avere un monostrato distribuito uniformemente possono essere rimossi dopo l'oc. Dopo aver confermato l'aderenza mitocondriale, portare la piastra di coltura cellulare allo strumento di saggio metrico Respir. Fare clic su OK.

La macchina espellerà la piastra di utilità utilizzata in precedenza per la calibrazione. Rimuovere la piastra di servizio e posizionare la piastra per colture cellulari che contiene i mitocondri sul vassoio. La tacca blu sulla piastra per colture cellulari deve essere posizionata nell'angolo in basso a sinistra del vassoio.

Fare clic su continua per avviare l'esecuzione del saggio, che dura circa 40 minuti. Al termine della seduta, premere eject sullo schermo per espellere la piastra di coltura cellulare. Una volta espulsa la piastra, rimuovere ed eliminare la piastra per coltura cellulare e la cartuccia.

Premi continua sullo schermo. L'esecuzione verrà salvata automaticamente come file XLS nel file di dati. Apri questo file e cambia la visualizzazione da O2 a OCR premendo la freccia verso il basso sotto l'indicatore Y uno.

Quindi, modificare le tariffe da punto a punto in punto a punto sotto i dati della velocità visualizzati come opzione. Fare clic su OK. Per applicare queste modifiche, fare clic sulla scheda della modalità di raggruppamento dei pozzetti in basso a sinistra dello schermo per raggruppare i pozzetti con condizioni simili.

Infine, fai clic sulla scheda dell'errore standard medio di esempio verso il centro dello schermo a sinistra. Questi comandi potrebbero anche essere impostati prima del saggio. Questi tracciati rappresentano i tassi di consumo di ossigeno o OCR rispetto al tempo per quattro saggi di accoppiamento.

Il primo pannello rappresenta lo stato due, respirazione o respirazione in assenza di un DP. Il secondo pannello dopo l'iniezione di A DP rappresenta la respirazione accoppiata massimale, chiamata anche respirazione di terzo stato. Il terzo pannello dopo l'iniezione di oligomicina. A rappresenta la respirazione dovuta alla perdita di protoni, chiamata anche respirazione oh stato quattro.

Il quarto pannello dopo l'iniezione di FCCP rappresenta la respirazione massima non accoppiata, chiamata anche respirazione a U di stato tre. Il quinto pannello dopo l'iniezione di antimicina A rappresenta l'inibizione della respirazione ossidativa. Tutti gli stati mitocondriali hanno una deviazione standard minima a causa dell'accurata miscelazione del ceppo mitocondriale e delle miscele di substrati mitocondrali e del raggiungimento di un singolo monostrato di mitocondri dopo lo spin di aderenza.

Al contrario, il caricamento di mitocondri disuguali in ciascun pozzetto e il mancato raggiungimento di un singolo monostrato di mitocondri porta a un aumento della deviazione standard in ogni stato, come indicato dalla traccia blu, che mostra valori OCR superiori a 1.500 ole al minuto, nonché a una diminuzione della frequenza respiratoria nel corso del periodo di misurazione, esemplificata dal calo dei valori di frequenza da punto a punto. Si noti che la traccia rossa mostra velocità da punto a punto coerenti e che i valori OCR massimi sono inferiori a 1.500 ole al minuto. Il sovraccarico di proteine mitocondriali può anche portare all'esaurimento dell'ossigeno all'interno della microcamera del pozzetto, impedendo così una misurazione accurata dell'OCR per ogni misurazione successiva, come indicato dalla Blue Trace, che mostra valori di O2 vicini allo zero durante il periodo di misurazione, nonché valori iniziali di O2 significativamente ridotti dopo ogni misurazione successiva.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di avere pazienti quando si mescolano i mitocondri e le soluzioni di substrato. Una volta padroneggiati questi metodi, è possibile deformare ulteriori esperimenti per rispondere a ulteriori domande come: in che modo i trattamenti mirati ai farmaci di un determinato trasportatore del substrato influenzano il consumo di ossigeno mitocondriale?