Name: Lisolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Impara a isolare mitocondri di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo per saggi respirometrici su micropiastre. Questo metodo consente di studiare il consumo di ossigeno mitocondriale e gli effetti di farmaci e proteine.

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Il Fralin Life Science Research Institute e il Metabolic Phenotyping Core del Virginia Tech hanno supportato questo lavoro.

Gli studi su animali sono stati effettuati nel quadro di un protocollo approvato dalla cura degli animali istituzionale e utilizzano Comitato al Virginia Polytechnic Institute e State University. 1. Setup (Tempo: ~ 45 min) <ol><li> Scongelare depositi congelati di 0,25% tripsina, isolamento tampone per mitocondri (IBM) 1 e IBM2 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Sciacquare vetreria e strumenti di dissezione in etanolo al 70% e poi con acqua ad elevata purezza. </li><li> Preparare la soluzione tripsina 0,05% dal 0,25% tripsina magazzino diluendo 1 parte di tripsina in 4 parti IBM1. </li><li> Mescolare proteasi e fosfatasi inibitore cocktail con tampone di lisi cellulare (1: 100 ratio) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga con tappo a vite. </li><li> Aliquote 5 ml (5 ml / topo) di 0,05% tripsina in un tubo di plastica da 15 ml. </li><li> Impostare motorizzato omogeneizzatore tessuto a 80 giri. </li></ol> 2. Isolamento del muscolo scheletrico mitocondri (Tempo: ~ 90 min) <ol><li> L&#39;eutanasia di un mouse da CO 2 </sub&gt; inalazione, seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Rimuovere muscolo rosso dal quadricipite e del muscolo gastrocnemio, che comprende il soleo (~ 75-100 mg totale) come descritto nei seguenti passaggi: <ol><li> Sbucciare la pelle verso il mouse. </li><li> Rimuovere il cuscinetto di grasso sopra il punto di origine del quadricipite. Tagliare il tendine del quadricipite che è collegato alla rotula con sottili forbici a punta. Nota: Il quadricipite è identificato dalla sua posizione anatomica sulla parte anteriore del femore prossimale. </li><li> Lentamente tagliare l&#39;aponeurosi tra l&#39;osso e il quadricipite, evitando l&#39;arteria femorale, per liberare i quadricipiti dall&#39;osso. Tagliare il tendine con sottili forbici a punta in corrispondenza del punto di origine sul femore per liberare il muscolo quadricipite e posizionare il muscolo quadricipite in refrigerate PBS. </li><li> Rimuovere il tessuto adiposo visibile sopra il quadricipite con le forbici. Vibrazione quadricipiti sopra in modo che la porzione del muscolo che è stato sovrapposto il femore sta affrontando up. Aprire il muscolo quadricipite con una pinza in un movimento rotatorio. Rimuovere le due porzioni muscolari rosse visibili da ogni lobo con ammenda forbici a punta e mettere in un bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1. Nota: muscolo quadricipite appaiono come due lobi con una striscia di muscolo rosso si trova vicino al bordo laterale di ciascun lobo. </li><li> Tagliare la pelle sovrastante il tendine di Achille con ammenda punta forbici e sbucciare la pelle verso il mouse. Tagliare il tendine di Achille esposto e staccare il muscolo verso il corpo del mouse. </li><li> Tagliare il tendine ai condili mediale e laterale del femore con sottili forbici a punta per liberare il gastrocnemio e collocare il gastrocnemio attaccato ai suoi tendini in refrigerata PBS. </li><li> Capovolgere il gastrocnemio sopra e staccare il muscolo soleo e mettere nel bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1. Fan aprire il gastrocnemio. Rimuovere le tre porzioni visive rosse muscolari (due strisce rosse laterali e uno mediale superficiale) con multa forbice a puntas e trasferirli al bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1. </li></ol></li><li> Rimuovere un&#39;altra ~ 75-100 mg di muscolo rosso dalla altra gamba del mouse (come descritto al punto 2.2) e posto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga con proteasi e fosfatasi inibitore cocktail e tampone di lisi cellulare (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, NaCl 150 mm, 1% dodecil solfato di sodio, 0,5% deossicolato di sodio, 1% Poliossietilene (9) nonylphenylether, ramificata. Subito lampeggiare-freeze questo secondo campione in azoto liquido per un uso successivo a assorbente occidentale (vedi punto 6.1). </li><li> Mettere una superficie di plastica piatta pre-raffreddata su ghiaccio in un grande secchio. Versare una goccia di IBM1 sulla superficie di plastica e utilizzare pinzette per mettere tutti del muscolo rosso sezionato (passo 2.2.4 e 2.2.7) in IBM1 goccia. Tritare il tessuto muscolare per 2 minuti utilizzando 3 singole lame di rasoio bordo cambiando rasoi ogni 40 sec. </li><li> Trasferire il tessuto tritato in un becher con 5 ml di IBM1 fresco tenendo superficie plastica sopra the becher e raschiare il muscolo nel becher con una lama di rasoio. Prendete questa soluzione e di scarico attraverso un colino cella di 100 micron collocato su un tubo da 50 ml. </li><li> Tamponare il tessuto con un tergicristallo compito delicato e poi trasferisce in 5 ml della soluzione di tripsina 0,05%. Utilizzare pinzette per rimuovere il tessuto dal tergicristallo compito. </li><li> Incubare il tessuto muscolare in ghiaccio per 30 minuti in soluzione tripsina 0,05%. </li><li> Gira le tubo da 15 ml miscela contenente tripsina / muscolo a 200 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Versare il surnatante tripsina in un contenitore per rifiuti e risospendere il pellet con 3 ml di ghiaccio freddo IBM1. Trasferire il tessuto 45 ml tubo omogeneizzatore vetro. Sciacquare i tubo da 15 ml con un altro 1,5 ml IBM1 raccogliere qualsiasi campione rimanente e aggiungere questo al tubo omogeneizzatore vetro. </li><li> Posizionare il tubo di omogeneizzatore vetro in un bicchiere o contenitore di plastica pieno di ghiaccio a metà strada quindi l&#39;omogeneizzatore vetro si muove minimamente all&#39;interno del bicchiere. </li><li&gt; Omogeneizzare la miscela di tessuti / IMB1 con il pestello in PTFE collegati ad un comando a motore omogeneizzatore tessuto con 10 passaggi a 80 giri al minuto. Tenere la parte inferiore di ogni pass per ~ 2 sec. </li><li> Trasferire il tessuto omogenato di un nuovo tubo da 15 ml conica e sciacquare il tubo omogeneizzatore vetro con 6,5 ml di IBM1. Versare il IBM1 nel tubo da 15 ml contenente tessuto omogenato. </li><li> Spin tubo conico da 15 ml a 700 g per 10 minuti a 4 ° C. Delicatamente versare il surnatante in una provetta da centrifuga ad alta resistenza vetro e scartare il pellet. </li><li> Spin il supernatante dal passo a 8000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante IBM1 e risospendere il pellet aggiungendo lentamente 500 ml di IBM2. Tagliare la fine di un puntale e omogeneizzare delicatamente il pellet in IBM2 con miscelazione e agitazione movimenti. Aggiungere altri 4,5 ml di IBM2 alla miscela dopo il pellet è completamente sospesa. Nota: Evitare l&#39;eccessiva triturazione mentre rompendo pezzi pellet più grandi come tla sua può danneggiare le membrane mitocondriali. </li><li> Spin l&#39;omogeneizzato / tessuto IBM2 a 8000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Nota: Questo passaggio può essere ripetuto in una provetta pulita centrifuga ad alta resistenza per più precisa quantificazione delle proteine ​​di mitocondri isolati al punto 4 dal residuo BSA può contribuire al contenuto totale di proteine. </li><li> Rimuovere il surnatante e delicatamente, ma completamente risospendere il pellet con l&#39;aggiunta di due incrementi 25 microlitri di IBM2 con un puntale con il suo punto di taglio. Mescolare delicatamente e miscelare il pellet dopo ogni aggiunta di 25 ml di IBM2. Mettere questo stock mitocondriale su ghiaccio. </li></ol> 3. omogeneizzazione di tutto il tessuto lisato (Tempo: ~ 45 min; può essere effettuato durante Passo 7) <ol><li> Rimuovere il muscolo da che è stato posto in azoto liquido dal punto 2.3 e incubare a temperatura ambiente fino completamente scongelati. </li><li> Tritare il tessuto per ~ 30 secondi sul ghiaccio con pregiati forbici a punta. </li><li> Aggiungere due cucchiai 100 microlitri di ZircoPerline in ossido di zirconio alla provetta da 1,5 ml microcentrifuga con tappo a vite dal punto 3.2 che contiene il tessuto tritato. Omogeneizzare il tessuto in un omogeneizzatore tessuto mulino tallone con due o tre cicli di 5 min ad una impostazione di velocità di 4-6 (regolazione media). </li><li> Spin la miscela dal punto 3.3 a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta 1000 ml punta dopo lo spin e il trasferimento in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Eliminare il pellet e posizionare il surnatante su ghiaccio. </li></ol> 4. Determinazione delle proteine ​​(Tempo: ~ 30 min) <ol><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​di tutto il lisato tissutale (punto 3.4) e magazzino mitocondriale (passo 2.17) utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​BCA secondo le specifiche del costruttore. </li></ol> 5. I mitocondri Membrana di integrità; Citrato sintasi (CS) Attività (Tempo: ~ 15 min) <ol><li> Fare due separati 1: 20 diluizioni dello stock mitocondriale in acqua ad elevata purezza. Aggiungere0,1% di Triton 100-X per un campione e sonicare è a un livello basso (765 watt, l&#39;ampiezza di 2). Lasciare l&#39;altra soluzione sul ghiaccio. Riportare il campione ghiaccio dopo sonicazione. </li><li> Eseguire un test citrato sintasi sia con il non-sonicato e sonicato diluizioni mitocondriali utilizzando un saggio spettrofotometrico precedentemente descritto 11,12. </li><li> Determinare la percentuale delle membrane mitocondriali intatte in base alle seguenti equazioni: (Attività CS non sonicato ÷ sonicato CS attività) * 100 </li></ol> 100- N (cento raggiunto da sopra) 6. I mitocondri isolamento di qualità; Western Blotting (Tempo: Secondo Lab Protocol) <ol><li> Eseguire Western blotting su tutta lisato tissutale e mitocondri isolati come descritto in precedenza 12. Nota: Utilizzare anticorpi primari per GAPDH (1: 1.000 diluizione 5% BSA / TBS-T) e COXIV (1: 1.000 diluizione 5% senza grassiLatte / TBS-T), seguita da anti-capra, e anticorpi secondari di coniglio, rispettivamente, (1: 10.000). </li></ol> 7. respirometrici Assay Run (Tempo: ~ 90 min) <ol><li> Effettuare test respirometrici desiderati usando basato O 2 tecnologia di misurazione del consumo di micropiastre come descritto in precedenza (vedi articolo correlato e Rogers et al 8). </li><li> Determinare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) dividendo Stato 3 per Stato 4o (RCR) o dividere 3u Stato per Stato 4o. Utilizzare il mezzo (media) il punto, o il più alto (Stato 3) e tariffe più basse (4o Stato) dal punto a punto le tracce per determinare RCR. </li></ol>

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</ol>

George Rogers è un dipendente di Seahorse Bioscience che produce lo strumento per il quale questo protocollo è stato modificato.

I metodi qui presentati forniscono una descrizione dettagliata di una procedura di isolamento mitocondriale da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscoli scheletrici. Questa procedura di isolamento è in grado di produrre ad alto funzionamento, i mitocondri puro (~ 450 mg) come evidenziato da O 2 tassi di consumo, valori RCR, la massima attività citrato sintasi e di espressione proteica da immunoblotting. È importante sottolineare che i mitocondri isolati da questa procedura può essere utilizzato per più sa...

La funzione primaria dei mitocondri è quella di produrre ATP dalla fosforilazione ossidativa. Tuttavia, i mitocondri hanno molte altre importanti funzioni cellulari tra cui, ma non solo: la produzione e la detossificazione di specie reattive dell'ossigeno, la regolazione del calcio citoplasmatico e mitocondriale, il traffico degli organelli, l'omeostasi ionica e il coinvolgimento nell'apoptosi1,2. Pertanto, non sorprende che i mitocondri disfunzionali svolgano un ruolo in molte patologie, come l'invecchiamento, le malattie neurodegenerative, le malattie cardiovascolari, il cancro, l'obesità e il diabete3,4. È importante sottolineare che i mitocondri del muscolo scheletrico sono specificamente coinvolti in molte di queste patologie3-5.
I saggi di respirazione mitocondriale che utilizzano mitocondri isolati consentono di valutare la catena di trasporto degli elettroni e la funzione di fosforilazione ossidativa e la determinazione dei meccanismi d'azione di farmaci e proteine che modulano il metabolismo. Esistono procedure di isolamento mitocondriale per più tipi di tessuti e cellule per una varietà di specie6,7. Tuttavia, queste procedure richiedono spesso grandi quantità di tessuto/cellule per una resa mitocondriale di alta qualità necessaria per i classici saggi respirometrici. 
I saggi respirometrici basati su micropiastre consentono misurazioni ad alta produttività utilizzando quantità minime di mitocondri isolati, spesso solo pochi μg per pozzetto8. Pertanto, presentiamo una modifica dei metodi7 precedentemente pubblicati per consentire l'isolamento di mitocondri di alta qualità da quantità minori di muscolo scheletrico di topo per l'uso in saggi respirometrici basati su micropiastre. Inoltre, vengono forniti metodi per stabilire la qualità della preparazione all'isolamento mitocondriale e l'integrità delle membrane mitocondriali. Dato che i mitocondri del muscolo scheletrico sono coinvolti in molte condizioni patologiche, la misurazione del consumo di O2 in studi meccanicistici sta diventando sempre più diffusa nella ricerca biomedica9,10.

<table><tbody><tr><td>Essenzialmente grasso</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N/A</td></tr><tr><td>senza acidi- BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris/HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6511</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-Mannitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio cristalli bianchi o polvere cristallina &ge; 99,0 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771&nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750&nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Poliossietilene (12) nonilfenil etere, ramificato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Lame di rasoio a taglio singolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Falcon- 100 uM Nylon Filtri cellulari</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Halt Proteasi & Cocktail di inibitori dei fosfati</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml con tappo a vite</td><td>Thermo Scientific</td><td>3474</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perle di ossido di zirconio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (1D4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-59540</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Anti-COXIV anticorpo</td><td>Cell Signaling</td><td>4844s</td><td>Qualsiasi proteina della membrana interna mitocondriale sarà sufficiente</td></tr><tr><td>Perossidasi coniugata affinipure Donkey, Anti coniglio IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearh</td><td>711-035-152</td><td>N / A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perossidasi coniugato affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>115-001-003</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pierce Kit di analisi delle proteine BCA&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acido piruvico, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Conservare a 4 gradi C, pH a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico</td></tr><tr><td>Acido succinico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Conservare a temperatura ambiente, pH a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico</td></tr><tr><td>Acido malico L(-), BioXtra, &ge; 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Conservare a temperatura ambiente, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico</td></tr><tr><td>Acido L-glutammico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Conservare a temperatura ambiente, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel test</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> respirometrico <tr><td>Palmitoyl L-carnitina cloruro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Conservare a -20 °C</td></tr><tr><td>Oligomicina A, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Conservare a -20 C</td></tr><tr><td>Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Negozio a 2-8 gradi C</td></tr><tr><td>fenilidrazone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge; 98% (TLC), polvere [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A da streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Negozio a -20 C</td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-difosfato sale monopotassico disidratato [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Conservare a -20 &deg; C, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel test</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> respirometrico <tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni high throughput micropiastre respiratorie

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Disfunzionali mitocondri dei muscoli scheletrici hanno un ruolo nel metabolismo alterato osservata con l&#39;invecchiamento, l&#39;obesità e il diabete di tipo II. Saggi respirometrici mitocondriali da isolate preparati mitocondriali consentono la valutazione della funzione mitocondriale, nonché la determinazione del meccanismo (s) d&#39;azione dei farmaci e proteine ​​che modulano il metabolismo. Procedure di isolamento attuali richiedono spesso grandi quantità di tessuto per produrre mitocondri di alta qualità necessari per le analisi respirometrici. I metodi qui presentati descrivono come di alta qualità mitocondri purificato (~ 450 mg) può essere isolato da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscolo scheletrico per l&#39;uso in misure respiratorie throughput elevato. Abbiamo determinato che il nostro metodo di isolamento si ottiene il 92,5 ± 2,0% mitocondri intatti misurando l&#39;attività citrato sintasi spettrofotometricamente. Inoltre, l&#39;analisi Western Blot in mitocondri isolati portato alla debole espressione del cytosoproteine ​​lic, GAPDH, e il robusto espressione della proteina mitocondriale, COXIV. L&#39;assenza di una banda di GAPDH prominente nei mitocondri isolati è indicativo di poco la contaminazione da fonti non-mitocondriali durante la procedura di isolamento. Soprattutto, la misura di O 2 tasso di consumo con tecnologia basata micropiastra e determinare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) per saggi respirometrici accoppiati mostra altamente accoppiate (RCR;&gt; 6 per tutti i saggi) e mitocondri funzionali. In conclusione, l&#39;aggiunta di una fase di macinazione separata e riducendo significativamente motorizzato velocità omogeneizzazione di un metodo riportato in precedenza ha permesso l&#39;isolamento di alta qualità e mitocondri purificati da piccole quantità di topo muscoli scheletrici che si traduce nei mitocondri altamente accoppiate che respirano con alta funzione durante micropiastra saggi respirometirc.

Attività citrato sintasi serve come misura per l&#39;integrità della membrana dal citrato sintasi si trova nella membrana mitocondriale interna, e quindi non dovrebbero essere presenti nelle sospensioni di mitocondri con membrane intatte. La Figura 1 rappresenta l&#39;attività citrato sintasi in campioni non sonicato mitocondriali rispetto sonicato campioni dello stesso isolamento. Sonicating i risultati dei mitocondri in un aumento statisticamente significativo nell&#39;attività citrat...

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

L'obiettivo generale di questo articolo video è isolare mitocondri di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo per utilizzarli in saggi tric basati su micropiastre. Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca biomedica, ad esempio descrivendo come determinati farmaci e proteine modulano il consumo di ossigeno mitocondriale nel muscolo scheletrico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che mitocondri di alta qualità possono essere isolati da quantità minori di muscolo scheletrico di topo rispetto a quanto precedentemente riportato.Eseguire l'eutanasia del topo in conformità con le linee guida dell'istituto. Successivamente, posizionare il topo su un lato e utilizzare forbici a punta fine per praticare un'incisione nella pelle sovrastante l'epicondilo laterale del femore.Sviluppare la pelle verso il muso del topo, quindi rimuovere il cuscinetto adiposo posizionato sopra il punto di origine del quadricipite. Successivamente, tagliare il tendine del quadricipite che è attaccato alla rotula. Tagliare lentamente l'aponeurosi tra l'osso e il quadricipite, evitando l'arteria femorale.Quindi recidere il tendine nel punto di origine sul femore per liberare il muscolo quadricipite e posizionare il muscolo quadricipite in PBS freddo. Rimuovere eventuali tessuti adiposi visibili presenti sul quadricipite utilizzando un paio di forbici. Una volta pulito, girare il quadricipite in modo che la parte che era situata sopra il femore risulti ora rivolta verso l'alto.Aprire il muscolo quadricipite con una pinza con movimento a ventaglio. Rimuovere le due porzioni muscolari rosse visibili da ciascun lobo e posizionarle in un becher contenente cinque millilitri di buffer di isolamento mitocondriale freddo.Successivamente, tagliare la pelle sovrastante il tendine di Achille con forbici a punta fine e staccare la pelle verso il topo. Tagliare il tendine di Achille esposto e staccare il muscolo verso il corpo del topo. Recidere il tendine ai condili laterale e mediale del femore per liberare il gastrocnemio e posizionare il gastrocnemio, ancora attaccato ai suoi tendini, in una piastra riempita con PBS freddo.Ribaltare il muscolo gastrocnemio ed estrarre il muscolo soleo. Posizionare il muscolo soleo nel becher contenente cinque millilitri di mitocondri.Un ulteriore operatore ha aperto il gastrocnemio ed ha rimosso le tre porzioni di muscolo rosso visibili. Ci saranno due porzioni laterali e una striscia superficiale mediale rossa. Una volta isolate, trasferire il muscolo rosso nel becher contenente cinque millilitri di mitocondri freddi.Tampone di isolamento uno. Rimuovere altri 75-100 milligrammi di muscolo rosso dall'altra zampa del topo. Ripetere il processo appena illustrato.Posizionare il muscolo dissezionato dalla seconda gamba in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri con il cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi e il buffer per la lisi cellulare preparati come descritto nel protocollo testuale allegato. Congelare immediatamente mediante immersione in azoto liquido il secondo campione per l'utilizzo nel western blotting. Posizionare una superficie piana in plastica preriscaldata sul ghiaccio all'interno di un contenitore grande.Quindi versare una goccia di buffer per l'isolamento dei mitocondri sulla superficie di plastica ed utilizzare pinze per posizionare tutta la sezione di muscolo rosso in una goccia di buffer di isolamento. Triturare il tessuto muscolare per due minuti usando lame da rasoio a spigolo singolo, sostituendo ogni 40 secondi la lama con una nuova e affilata. Trasferire il tessuto tritato in un nuovo becher contenente cinque millilitri di buffer fresco per mitocondri.Tampone di isolamento uno. Quindi prelevare la soluzione e farla defluire attraverso un setaccio cellulare da 100 micron, posizionato su un tubo conico da 50 millilitri. Asciugare il tessuto con un fazzoletto assorbente delicato e poi trasferirlo in cinque millilitri di una soluzione di tripsina allo 0,05%.Utilizzare pinzette per rimuovere eventuali tessuti residui dall'asciugatore e aggiungerli alla tripsina. Incubare il tessuto muscolare nella soluzione di tripsina su ghiaccio per 30 minuti. Successivamente, centrifugare il campione a 200 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, versare il surnatante di tripsina in un contenitore per rifiuti e risospendere il pellet con tre millilitri di tampone di isolamento delle mitocondri freddo su ghiaccio numero uno. Trasferire quindi il tessuto in un tubo di omogeneizzazione in vetro da 45 millilitri. Risciacquare il tubo conico da 15 millilitri con altri 1,5 millilitri di tampone di isolamento delle mitocondri numero uno per raccogliere ogni eventuale campione residuo e aggiungere il tutto al tubo di omogeneizzazione in vetro.Successivamente, posizionare il tubo del maceratore di vetro in un becher o contenitore di plastica riempito per metà di ghiaccio, in modo che il maceratore di vetro si muova il meno possibile all'interno del becher. Omogeneizzare il campione utilizzando una pestello in politetrafluoroetilene collegato a un omogeneizzatore meccanico.Omoterminatore a 10 a 80 giri al minuto. Mantenere la parte inferiore di ogni passaggio per circa due secondi. Successivamente, trasferire l'omogenato di tessuto in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.E risciacquare il tubo del maceratore di vetro con 6,5 millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri uno. Versare il tampone nel tubo conico da 15 millilitri contenente il resto del tessuto macerato. Centrifugare il campione a 700 × g per 10 minuti a 4 °C, quindi versare delicatamente il soprannatante in un tubo da centrifuga in vetro ad alta resistenza e scartare il pellet.Successivamente, centrifugare il surnatante a 8.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per ottenere il pellet di mitocondri, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo lentamente 500 microlitri di tampone di isolamento dei mitocondri due, tagliare l'estremità di una punta da pipetta ed omogeneizzare delicatamente il pellet nel tampone mediante movimenti di miscelazione e agitazione. Quindi aggiungere altri 4,5 millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri.Aggiungere il buffer due alla miscela. Una volta che il pellet è completamente sospeso, centrifugare l'omogenato a 8.000 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per riottenere il pellet di mitocondri. Rimuovere il soprannatante S e risospendere delicatamente ma completamente il pellet aggiungendo 2 aggiunte da 25 microlitri di soluzione di isolamento dei mitocondri. Utilizzando una punta di pipetta con la punta tagliata, mescolare delicatamente il pellet dopo ciascun aggiunta di 25 microlitri di buffer due.Una volta terminato, mettere questa soluzione madre mitocondriale sul ghiaccio. Preparare due diluizioni separate da uno a 20 della soluzione madre mitocondriale in acqua ad alta purezza. Aggiungere lo 0,1% di Triton 100 x a un campione e sottoporlo a sonicazione per 10 secondi a bassa intensità.Lasciare l'altra diluizione sul ghiaccio e riportare il campione sonnicato sul ghiaccio. Dopo la sonnicazione, eseguire un saggio della citrato sintasi su entrambe le diluizioni mitocondriali, non sonnicata e sonnicata, utilizzando un saggio fotometrico con tecniche standard e determinare la percentuale di membrane mitocondriali integre usando le equazioni fornite nel protocollo testuale allegato. La sonnicazione dei mitocondri determina un aumento statisticamente significativo dell'attività della citrato sintasi.L'attività della citrato sintasi in campioni mitocondriali non sottoposti a sonica rispetto ai campioni sonificati mostra che il 92,5% dei mitocondri erano integri al termine della procedura di isolamento. L'espressione di GA DH e COX4 è evidente nel lisato totale del tessuto e nei mitocondri isolati, dove si osserva l'espressione di COX4. Sebbene siano visibili solo deboli bande di GA DH, questi risultati indicano un buon isolamento mitocondriale con scarsa contaminazione da componenti non mitocondriali durante la procedura di isolamento.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di manipolare la soluzione mitocondriale con attenzione, evitando sempre di vortexarla o di mescolarla energeticamente dopo questa procedura. Altri metodi, come la misurazione della produzione di specie reattive, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se un intervento influisce sulla produzione di specie reattive dell'ossigeno nei mitocondri isolati.

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L'isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

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