L'isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

L'obiettivo generale di questo articolo video è isolare mitocondri di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo per l'uso in saggi tric basati su micropiastre. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca biomedica, come la descrizione di come alcuni farmaci e proteine modulano il muscolo scheletrico e il consumo di ossigeno mitocondriale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i mitocondri di alta qualità possono essere isolati da quantità minori di muscolo scheletrico di topo rispetto a quanto precedentemente riportato.

Eseguire l'eutanasia del topo in conformità con le linee guida dell'istituto. Quindi posiziona il mouse su un lato e usa le forbici a punta fine per praticare un'incisione nella pelle. Sovrapposizione dell'epicondilo laterale del femore.

Sbucciare la pelle verso il mouse, quindi rimuovere il cuscinetto adiposo posizionato sopra il punto di origine del quadricipite. Quindi, taglia il tendine del quadricipite che è attaccato alla rotula. Tagliare lentamente l'aponevrosi tra l'osso e il quadricipite evitando l'arteria femorale.

Quindi tagliare il tendine nel punto di origine sul femore per liberare il muscolo quadricipite e posizionare il muscolo quadricipite in PBS raffreddato. Rimuovere il tessuto adiposo visibile sopra i quadricipiti utilizzando un paio di forbici. Una volta puliti, capovolgi i quadricipiti in modo che la parte del muscolo che sovrastante il femore sia rivolta verso l'alto.

Apri il muscolo quadricipite con una pinza con un movimento a ventaglio. Rimuovi le due parti muscolari rosse visibili da ciascun lobo e mettile in un becher contenente cinque millilitri di mitocondri refrigerati. Buffer di isolamento.

Successivamente, taglia la pelle sovrastante il tendine d'Achille con le forbici a punta fine e sbuccia la pelle verso il topo. Taglia il tendine d'Achille esposto e sbuccia il muscolo verso il corpo del topo. Tagliare il tendine in corrispondenza dei condili laterali e mediali del femore per liberare il gastrocnemio e posizionare il gastrocnemio attaccato ai suoi tendini in un piatto pieno di PBS raffreddato.

Capovolgere il gastrocnemio e staccare il muscolo soleo. Posizionare il muscolo soleo nel becher contenente cinque millilitri di mitocondri raffreddati. Buffer di isolamento.

Un ventilatore successivo ha aperto il gastroc e ha rimosso le tre porzioni visive del muscolo rosso. Ci saranno due porzioni laterali e una striscia rossa superficiale mediale. Una volta isolato, trasferire il muscolo rosso nel becher contenente cinque millilitri di mitocondri raffreddati.

Buffer di isolamento uno. Rimuovere altri 75-100 milligrammi di muscolo rosso dall'altra gamba del topo. Ripetendo il processo appena mostrato.

Posizionare il muscolo sezionato dalla seconda gamba in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri con il cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi e il tampone di lisi cellulare preparati come descritto nel protocollo di testo allegato. Immediatamente lampeggiare, congelare il secondo campione in azoto liquido per l'uso in western blotting. Metti una superficie di plastica piatta pre-guarita sul ghiaccio in un grande secchio.

Quindi versare una goccia di tampone di isolamento dei mitocondri sulla superficie di plastica e utilizzare una pinzetta per posizionare tutto il muscolo rosso sezionato in una gocciolina di isolamento. Buffer. Tritare il tessuto muscolare per due minuti utilizzando lame di rasoio a filo singolo, passare a un nuovo rasoio affilato ogni 40 secondi. Trasferire il tessuto macinato in un nuovo becher con cinque millilitri di mitocondri freschi.

Buffer di isolamento uno. Quindi prendere la soluzione e scolarla attraverso un colino cellulare da 100 micron, posto su un tubo conico da 50 millilitri. Tamponare il tessuto con un panno delicato, quindi trasferirlo in cinque millilitri di una soluzione di tryin allo 0,05%.

Usa le pinzette per rimuovere il tessuto rimanente dal tergicristallo e aggiungilo alla tripsina. Incubare il tessuto muscolare nella soluzione di tripsina con ghiaccio per 30 minuti. Quindi centrifugare il campione a 200 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, versare la tripsina supinato in un contenitore per rifiuti e risospendere il pellet con tre millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri ghiacciato. Quindi trasferire il fazzoletto in una provetta omogeneizzatrice di vetro da 45 millilitri. Sciacquare la provetta conica da 15 millilitri con altri 1,5 millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri per raccogliere il campione rimanente e aggiungerlo alla provetta dell'omogeneizzatore di vetro.

Quindi, metti il tubo dell'omogeneizzatore di vetro in un bicchiere o in un contenitore di plastica riempito a metà di ghiaccio. Quindi l'omogeneizzatore di vetro si muove minimamente all'interno del becher. Omogeneizzare il campione con un pestello in politetrafluoroetilene attaccato a un tessuto motorizzato.

Omogeneizzatore con 10 a 80 giri/min. Mantieni la parte inferiore di ogni passaggio per circa due secondi. Quindi trasferire l'omogeneizzato di tessuto in una nuova provetta conica da 15 millilitri.

E sciacquare la provetta dell'omogeneizzatore di vetro con 6,5 millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri uno. Versare il tampone nel tubo conico da 15 millilitri contenente il resto del tessuto. Omogeneato. Centrifugare il campione a 700 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi versare delicatamente il supinato in una provetta da centrifuga di vetro ad alta resistenza e scartare il pellet.

Quindi, ruota il rullante a 8.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per pellettare i mitocondri, rimuovere la staffetta e risospendere il pellet aggiungendo lentamente 500 microlitri di tampone di isolamento dei mitocondri due, tagliare l'estremità di un puntale di pipetta e omogeneizzare delicatamente il pellet nel tampone con movimenti di miscelazione e agitazione. Quindi aggiungere altri 4,5 millilitri di isolamento dei mitocondri.

Tamponare due nella miscela Dopo che il pellet è completamente sospeso, centrifugare l'omogeneizzato a 8.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare nuovamente i mitocondri. Rimuovere il surnatante S e risospendere delicatamente ma completamente il pellet aggiungendo 2 incrementi di 25 microlitri di isolamento dei mitocondri. Tamponare due, utilizzando una punta di pipetta con la punta tagliata, mescolare delicatamente e mescolare il pellet dopo ogni edizione di 25 microlitri di tampone.

Al termine, metti questo brodo mitocondriale sul ghiaccio. Effettuare due diluizioni separate da una a 20 del ceppo mitocondriale in acqua ad alta purezza. Aggiungere lo 0,1% di Triton 100 x a un campione e sonicare per 10 secondi a un'impostazione bassa.

Lasciare l'altra diluizione sul ghiaccio e riportare il campione sonicato nel ghiaccio. Dopo la sonicazione, eseguire un saggio della citrato sintasi con la diluizione mitocondriale sia non sonicata che sonicata utilizzando un test fotometrico utilizzando tecniche standard, determinare la percentuale di membrane mitocondriali intatte utilizzando le equazioni fornite nel protocollo di testo allegato. Il sindacato dei mitocondri provoca un aumento statisticamente significativo dell'attività della sintasi citrato.

L'attività della sintasi di citrato in campioni mitocondriali non sonicati rispetto ai campioni sonicati mostra che il 92,5% dei mitocondri era intatto dopo l'espressione isolata di ga. DH e COX quattro sono evidenti nell'intero lisato tissutale nell'espressione mitocondriale isolata di Cox quattro. Sebbene siano evidenti solo deboli bande di GA DH, questi risultati indicano buoni isolamenti mitocondriali con poca contaminazione da componenti non mitocondriali durante la procedura di isolamento.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare il ceppo mitocondriale con cura, senza mai agitarlo o mescolarlo energicamente seguendo questa procedura. Altri metodi, come la misurazione della produzione di specie ad azione reattiva, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se un intervento influenza la produzione di specie reattive dell'ossigeno nei mitocondri isolati.