Studiare comunità microbiche In Vivo: Un modello di interazione ospite-mediata tra Candida Albicans E Pseudomonas aeruginosa Nei Airways

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire un modello per studiare le interazioni tra un singolo batterio e un singolo fungo. Questo messaggio può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni tra patogeni, come ad esempio quali fattori sono coinvolti nel cross-talk e nel dialetto interspecie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i dati generati da questo modello in vivo hanno rilevanza clinica.

Per installare il fungo per via intranasale, diluire prima da due volte dieci alla sesta CFU di C. albicans per millilitro in PBS sterile. Successivamente, dopo aver confermato la perdita del riflesso di raddrizzamento in un topo ipotonico adulto, aspirare almeno 50 microlitri della sospensione fungina in una pipetta da 200 microlitri. Ora, afferra il topo con una mano e gira l'animale in modo che sia accoccolato sulla schiena con l'addome rivolto verso l'alto.

Quando il mouse è in posizione, usa l'indice della mano che tiene il mouse per sostenere la testa e il pollice per tenere chiusa la mascella e sposta la punta della pipetta vicino al naso dell'animale. Quindi, erogare con cura una goccia da 50 microlitri di fungo sulle narici, permettendo alla goccia di essere inalata dalla respirazione spontanea del topo. E metti il topo da solo in una gabbia fino a quando non si sarà completamente ripreso.

Quattro giorni dopo l'installazione di C.albicans, radere l'addome dell'animale soppresso, seguito dalla sterilizzazione con etanolo della pelle esposta. Quindi, usa le forbici per aprire la pelle dallo sterno a metà addome. Quindi, estendere l'incisione lungo la gabbia toracica su entrambi i lati della linea mediana e ripiegare la pelle su entrambi i lati del torace.

Quando la gabbia toracica è visibile, praticare un'incisione verticale su entrambi i lati del torace verso le clavicole e utilizzare lo sterno per reclinare l'intera parete toracica anteriore per visualizzare il cuore e i polmoni. Quindi, utilizzando una siringa pre-eparinizzata, pungere il cuore vicino all'arteria intraventricolare e prelevare un minimo di 500 microlitri di sangue. Mettere il campione di sangue sul ghiaccio.

Quindi, praticare un'incisione cervicale sulla linea mediana per rivelare la trachea. Sezionare con cura la fascia attorno alla trachea, seguita dal posizionamento di una sutura sotto la trachea. Quindi, utilizzare un ago da sonda gastrica modificato calibro 20 per cateterizzare la trachea, fissando la cannula con la sutura precedentemente posizionata.

Per eseguire un lavaggio broncoalveolare, erogare delicatamente 500 microlitri di PBS ghiacciato nel polmone. Quindi, aspirare il liquido di lavaggio e trasferire il fluido in una provetta da centrifuga da due millilitri con ghiaccio. Dopo aver raccolto altri due campioni da 500 microlitri, rimuovere i polmoni dal torace e posizionare un pezzo di polmone in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri per la conservazione immediata a meno 80 gradi Celsius.

Quindi, posizionare un altro pezzo di tessuto polmonare in una provetta per emolisi pre-pesata contenente PBS su ghiaccio. Infine, praticare un'incisione nella parte sinistra dell'addome. Raccogliere la milza in una seconda provetta per emolisi contenente un millilitro di PBS e posizionare la provetta sul ghiaccio.

Un modello di persistenza di quattro giorni è ottenuto mediante installazione intranasale di cinque volte dieci al quinto CFU di C.albicans per topo. Durante questi quattro giorni, i topi aumentano di peso, ma non mostrano lesioni polmonari. All'aumentare del CFU dell'inoculo, tuttavia, aumenta anche il danno polmonare.

Con il danno polmonare massimo osservato tra 24 e 36 ore dopo l'infezione. La carica batterica, al contrario, dimostra una diminuzione di un log CFU per millilitro ogni 24 ore, con un aumento cumulativo della disseminazione batterica osservato ogni giorno. Nel lavaggio broncoalveolare raccolto da topi infetti, i neutrofili sono ampiamente reclutati, con la conta cellulare differenziale che dimostra una popolazione di cellule immunitarie infiltranti il 90% di neutrofili e il 10% di linfociti macrofagici.

Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'analisi del lavaggio broncoalveolare per rispondere a ulteriori domande sulla caratterizzazione della risposta infiammatoria. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire una colonizzazione Pseudomonas. Non dimenticare che lavorare con la Candida luminescente può essere estremamente pericoloso e le precauzioni, come indossare indumenti protettivi per evitare la contaminazione da goccioline, dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.