Studiare comunità microbiche

L'obiettivo generale di questa procedura è costruire un modello per studiare le interazioni tra un singolo batterio e un singolo fungo. Questo approccio può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle interazioni tra patogeni, come ad esempio quali fattori siano coinvolti nel dialogo interspecifico e nel dialetto interspecie. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i dati ottenuti da questo modello in vivo hanno rilevanza clinica.

Per inoculare il fungo per via intranasale, diluire inizialmente due volte dieci alla sesta UFC di C.albicans per millilitro in PBS sterile. Successivamente, dopo aver verificato la perdita del riflesso di raddrizzamento in un topo adulto ipotonico, aspirare almeno 50 microlitri della sospensione fungina in una pipetta da 200 microlitri. A questo punto, afferrare il topo con una mano e ruotare l'animale in modo che si trovi disteso sulla schiena con l'addome rivolto verso l'alto.

Quando il topo è in posizione, utilizzare l'indice della mano che impugna il topo per sostenere la testa e il pollice per mantenere la mascella chiusa, quindi avvicinare la punta della pipetta al naso dell'animale. Successivamente, rilasciare con attenzione una goccia di 50 microlitri di fungo sulle narici, permettendo alla goccia di essere inalata con la respirazione spontanea del topo. Quindi, posizionare il topo da solo in una gabbia fino a quando non si sarà completamente ripreso.

Quattro giorni dopo l'installazione di C.albicans, rasare l'addome dell'animale sacrificato, seguito dalla sterilizzazione con etanolo della cute esposta. Successivamente, utilizzare le forbici per aprire la cute dallo sterno fino alla regione addominale media. Poi, estendere l'incisione lungo la gabbia toracica su entrambi i lati della linea mediana e ripiegare la cute lateralmente rispetto al torace.

Quando si rende visibile la gabbia toracica, effettuare un'incisione verticale su ciascun lato del torace in direzione delle clavicole e utilizzare lo sterno per ribaltare l'intera parete toracica anteriore al fine di visualizzare il cuore e i polmoni. Successivamente, utilizzando una siringa pre-eparinizzata, perforare il cuore accanto all'arteria interventricolare ed estrarre un minimo di 500 microlitri di sangue. Collocare il campione di sangue sul ghiaccio.

Quindi, effettuare un'incisione cervicale mediana per esporre la trachea. Dissezionare con attenzione la fascia intorno alla trachea, quindi posizionare un punto di sutura sotto la trachea. Successivamente, utilizzare un ago da gavaggio modificato da 20 gauge per cateterizzare la trachea, fissando la cannula con il punto di sutura precedentemente posizionato.

Per eseguire una lavanda broncoalveolare, dispensare delicatamente 500 microlitri di PBS freddo su ghiaccio nel polmone. Successivamente, aspirare il liquido di lavaggio e trasferirlo in una provetta da centrifuga da due millilitri posta sul ghiaccio. Dopo aver raccolto altri due campioni da 500 microlitri, rimuovere i polmoni dalla cavità toracica e inserire un frammento di polmone in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri per la conservazione immediata a meno 80 gradi Celsius.

Quindi, posizionare un altro pezzo di tessuto polmonare in un tubo per emolisi pre-pesato contenente PBS su ghiaccio. Infine, praticare un'incisione nel lato sinistro dell'addome. Prelevare la milza e inserirla in un secondo tubo per emolisi contenente un millilitro di PBS e porre il tubo sul ghiaccio.

Un modello di persistenza di quattro giorni si ottiene mediante instillazione intranasale di cinque volte dieci alla quinta UFC di C.albicans per topo. Durante questi quattro giorni, i topi aumentano di peso, ma non presentano lesioni polmonari. Tuttavia, all'aumentare delle UFC dell'inoculo, aumenta anche la lesione polmonare.

Con il danno polmonare massimo osservato tra le 24 e le 36 ore dopo l'infezione. Il carico batterico, al contrario, mostra una diminuzione di un logaritmo di UFC per millilitro ogni 24 ore, con un aumento cumulativo della disseminazione batterica osservato ogni giorno. Nell'analisi del lavaggio broncoalveolare prelevato da topi infetti, i neutrofili sono ampiamente reclutati, con il conteggio differenziale delle cellule che evidenzia una popolazione di cellule immunitarie infiltranti composta per il 90 percento da neutrofili e per il 10 percento da macrofagi e linfociti.

Al termine di questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi della lavaggio broncoalveolare, per rispondere ad ulteriori domande sulla caratterizzazione della risposta infiammatoria. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come realizzare una colonizzazione da Pseudomonas. Non dimenticare che lavorare con Candida luminescente può essere estremamente pericoloso, e le precauzioni, come indossare dispositivi di protezione per evitare la contaminazione da droplet, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.