Modello in vitro di fisiologiche e patologiche flusso sanguigno con applicazione di indagini di rimodellamento vascolare cellulare

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di osservare gli effetti di diverse patologie del flusso pulsatile sulle cellule endoteliali. In vitro. Ciò si ottiene trattando prima chimicamente i vetrini e rivestendoli con proteine per garantire l'adesione delle cellule durante l'esposizione al flusso.

In una seconda fase, viene determinato l'indice di pulsatilità del flusso, che consente di confrontare il flusso in vitro con i valori descritti in letteratura. Successivamente, i vetrini a sede cellulare sono collegati al sistema di flusso per misurare la risposta cellulare alle patologie del flusso. I risultati mostrano cambiamenti nella morfologia e nell'espressione proteica in base ai profili di flusso utilizzando la microscopia ottica e la colorazione immunofluorescente.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla pompa peristaltica o pulsatile è la capacità di regolare la pulsatilità del flusso per imitare la risposta malata o sana. Questo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle arteriopatie. Per iniziare, posizionare nuovi vetrini di 75 millimetri per 50 millimetri per un millimetro in una capsula di vetro pulita.

Quindi aggiungere una quantità sufficiente di una soluzione di acido solforico al 20% per immergere completamente i vetrini e incubarli nella soluzione acida durante la notte del giorno successivo. Lavare i vetrini tre volte immergendoli in acqua fresca deionizzata per cinque minuti ogni volta. Una volta risciacquati, immergere i vetrini in acetone per 30 minuti, e poi per una notte in una soluzione di 6% di tre amminopropil trixi seline in acetone.

Successivamente, sciacquare i vetrini tre volte in acetone puro per cinque minuti cambiando l'acetone dopo ogni lavaggio. Quindi lavare gli scivoli tre volte in acqua deionizzata per cinque minuti, cambiando l'acqua deionizzata dopo ogni lavaggio. Successivamente immergere i vetrini in glutaraldeide all'1,5% e lasciarli immersi per 60 minuti.

Una volta reticolati, lavare i vetrini due volte in acqua deionizzata, cambiando l'acqua deionizzata Dopo ogni lavaggio, quindi posizionare i vetrini in etanolo al 70% per 30 minuti per sterilizzarli. Rimuovere l'etanolo e lasciare evaporare eventuali residui dai vetrini. Una volta asciutti, reidratare i vetrini ponendoli brevemente in acqua deionizzata sterile.

Quindi, rimuovere il supporto del vetrino e posizionarlo in una piastra di Petri quadrata da 100 millimetri per 100 millimetri. Nella cappa a flusso laminare rivestire il vetrino funzionalizzato con un millilitro di una soluzione di fibronectina da 25 microgrammi per millilitro, coprendo l'area approssimativa che sarà esposta alla camera di coltura cellulare. Quindi coprire il piatto e incubare i vetrini a 37 gradi Celsius per una o due ore Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione rimanente e seminare 600.000 cellule endoteliali in un millilitro di DMEM con il 10% di FBS sul lato rivestito del vetrino.

Coprire la camera e poi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 120 minuti. Quindi coprire le cellule con altro terreno e continuare a incubarle fino a quando non sono confluenti al 70-80%. Collegare il circuito di flusso come descritto nel protocollo di testo allegato e, come mostrato qui, assicurarsi che la camera di smorzamento e il flussometro a ultrasuoni siano disposti nella direzione di flusso corretta.

Quindi, riempire il flusso, il circuito e il serbatoio con acqua deionizzata. Assicurarsi che il tubo di uscita del serbatoio sia immerso nel volume del serbatoio. Quindi visualizzare la forma d'onda del flusso utilizzando un flussometro.

Aprire la valvola di sfiato dell'aria sulla camera di smorzamento per modificare il rapporto tra fluido e volume d'aria. Chiudere la valvola di sfiato dell'aria a diversi intervalli di livello del fluido e calcolare l'indice di pulsatilità. Per calcolare l'indice, valutare la forma d'onda del flusso in quanto il picco rappresenta il massimo della VM.

La depressione rappresenta il min v e la media V è la media del record del segnale. I valori dell'indice puls in un notebook. Contrassegnare il livello del fluido e l'indice di pulsatilità risultanti sulla camera di smorzamento utilizzando una penna a inchiostro permanente con punta in feltro per un uso futuro.

Determinare i livelli di indice di pulsatilità desiderati dalla letteratura patologica a cui si fa riferimento nel protocollo di testo allegato durante la preparazione del riscaldamento della camera di flusso. DMEM integrato con l'1% di FBS in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Estrarre uno dei vetrini rivestiti dalle celle dal supporto una volta che sono confluenti al 70-80% e posizionare una guarnizione sopra il lato della cella in sede.

Quindi, allineare il canale del vuoto della camera di flusso con i fori nella guarnizione. Quindi collegare il tubo del vuoto alle porte del vuoto, assicurandosi che non vi siano perdite di fluidi nel vuoto. Posizionare una lastra di policarbonato sotto il vetrino e bloccare il gruppo della camera di flusso con un morsetto a molla su ciascuno dei lati corti e due morsetti a molla lungo i lati lunghi della camera di flusso.

Quindi, collegare la camera di flusso, l'ingresso e l'uscita al circuito di flusso. Posizionare il sistema di flusso in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e riempire il circuito con il mezzo di preriscaldamento riempiendo il serbatoio con il fluido e pompandolo a bassa pulsatilità. Mantenere questo flusso per quattro ore per precondizionare le cellule.

Quindi regolare il volume del fluido nella camera di smorzamento al livello dell'indice di pulsatilità e alla coltura pre-marcati. Le celle per la durata desiderata. Le cellule endoteliali mostrate qui sono state coltivate senza flusso, flusso costante e flusso pulsatile.

Cambiamenti nella morfologia possono essere osservati dalla tipica morfologia delle cellule endoteliali a una morfologia più simile a quella del fuso dopo 24 ore di esposizione ad un flusso pulsatile elevato. Mentre sia il flusso statico che quello stazionario mostrano poca o nessuna differenza nella morfologia. Le cellule muscolari lisce sono anche influenzate dalla co-coltura con cellule endoteliali esposte a un elevato flusso pulsatile, come indicato qui da diversi livelli di alfa actina muscolare liscia e catena pesante della miosina.

Durante le diverse condizioni di flusso, le cellule che sono state esposte al flusso pulsatile hanno mostrato le maggiori quantità di entrambe le proteine, il che è indicativo di ipertrofia e contrattilità. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutte le guarnizioni e assicurarsi che i livelli del fluido rimangano costanti dopo questa procedura. Altri metodi, come la co-coltura di cellule endoteliali e cellule vascolari, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come le interazioni cellula-cellula.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare il circuito di flusso, controllare l'indice ed esporre le cellule endoteliali al flusso pulsatile.