Modello in vitro di fisiologiche e patologiche flusso sanguigno con applicazione di indagini di rimodellamento vascolare cellulare

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare gli effetti di diverse patologie del flusso pulsatile sulle cellule endoteliali in vitro. Questo viene ottenuto trattando innanzitutto con sostanze chimiche le lamelle di vetro e rivestendole con proteine per garantire l'adesione cellulare durante l'esposizione al flusso.

Come secondo passaggio, viene determinato l'indice di pulsatilità del flusso, che consente il confronto del flusso in vitro con i valori descritti in letteratura. Successivamente, i preparati cellulari su vetrino vengono collegati al sistema di flusso al fine di misurare la risposta cellulare alle patologie del flusso. I risultati mostrano variazioni nella morfologia e nell'espressione proteica in base ai profili di flusso, analizzati mediante microscopia ottica e colorazione immunofluorescente.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alla pompa peristaltica o pulsatile è la capacità di regolare la pulsazione del flusso per imitare una risposta patologica o sana. Questo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie arteriose. Per iniziare, posizionare nuovi vetrini di dimensioni 75 millimetri per 50 millimetri per 1 millimetro in una coppetta pulita per la colorazione dei vetrini.

Quindi aggiungere una quantità sufficiente di una soluzione di acido solforico al 20% per immergere completamente i vetrini e incubarli nella soluzione acida per tutta la notte il giorno successivo. Lavare i vetrini tre volte immergendoli in acqua deionizzata fresca per cinque minuti ogni volta. Dopo il risciacquo, immergere i vetrini in acetone per 30 minuti, quindi per tutta la notte in una soluzione di 6% di trietossisililpropilammina in acetone.

Successivamente, risciacquare i vetrini tre volte in acetone puro per cinque minuti, cambiando l'acetone dopo ogni lavaggio. Quindi lavare i vetrini tre volte in acqua deionizzata per cinque minuti, cambiando l'acqua deionizzata dopo ogni lavaggio. Successivamente immergere i vetrini in glutaraldeide al 1,5% e lasciarli in immersione per 60 minuti.

Dopo il cross-linking, lavare i vetrini due volte in acqua deionizzata, cambiando l'acqua deionizzata dopo ogni lavaggio, quindi immergere i vetrini in etanolo al 70% per 30 minuti per sterilizzarli. Rimuovere l'etanolo e lasciare evaporare eventuali residui dai vetrini. Una volta asciutti, reidratare i vetrini immergendoli brevemente in acqua deionizzata sterile.

Successivamente, rimuovere il supporto per vetrino e posizionarlo in una piastra di Petri quadrata da 100 millimetri per 100 millimetri. All'interno della cappa a flusso laminare, ricoprire il vetrino funzionalizzato con un millilitro di una soluzione di fibronectina a 25 microgrammi per millilitro, coprendo l'area approssimativa che sarà esposta alla camera di coltura cellulare. Quindi coprire la piastra e incubare i vetrini a 37 gradi Celsius per uno-due ore. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione rimanente e seminare 600.000 cellule endoteliali in un millilitro di DMEM con 10% FBS sul lato ricoperto del vetrino.

Coprire la camera e quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 120 minuti. Successivamente, ricoprire le cellule con ulteriore mezzo di coltura e continuare l'incubazione fino a quando non raggiungono una confluenza del 70-80%. Collegare il circuito di flusso come descritto nel protocollo testuale allegato e mostrato qui, assicurandosi che la camera smorzante e il flussimetro ad ultrasuoni siano posizionati nella corretta direzione del flusso.

Successivamente, riempire il circuito, il flusso e il serbatoio con acqua deionizzata. Assicurarsi che il tubo di uscita del serbatoio sia immerso all'interno del volume del serbatoio. Quindi, visualizzare l'onda di flusso utilizzando un flussimetro.

Aprire la valvola di sfiato dell'aria nella camera di smorzamento per modificare il rapporto tra il volume del fluido e quello dell'aria. Chiudere la valvola di sfiato dell'aria a diversi intervalli di livello del fluido e calcolare l'indice di pulsatilità. Per calcolare l'indice, valutare l'onda di flusso in cui il picco rappresenta la velocità massima (VM max).

Il minimo rappresenta il v min e la V media è la media del tracciato del segnale. I valori dell'indice pulsatile in un taccuino. Contrassegnare il livello del fluido risultante e l'indice di pulsatilità sulla camera di smorzamento utilizzando una penna a punta di feltro con inchiostro permanente per utilizzi futuri.

Determinare i livelli desiderati dell'indice di pulsatilità sulla base della letteratura patologica citata nel protocollo testuale allegato, mentre si prepara il preriscaldamento della camera di flusso. DMEM integrato con 1% FBS in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Prelevare una delle lamelle rivestite con cellule dal mezzo di coltura quando le cellule hanno raggiunto una confluenza del 70-80% e posizionare una guarnizione sulla faccia della lamella dove sono aderite le cellule.

Successivamente, allineare il canale del vuoto della camera di flusso con i fori nella guarnizione. Quindi collegare il tubo del vuoto ai raccordi per il vuoto, assicurandosi che nessun mezzo fuoriesca verso il vuoto. Posizionare un foglio di policarbonato sotto il vetrino e fissare l'insieme della camera di flusso con una pinza a molla su ciascun lato corto e due pinze a molla lungo i lati lunghi della camera di flusso.

Successivamente, collegare la camera di flusso, l'ingresso e l'uscita al circuito di flusso. Posizionare il sistema di flusso in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e riempire il circuito con il mezzo preriscaldato riempiendo il serbatoio con il mezzo e pompandolo con bassa pulsatilità. Mantenere questo flusso per quattro ore per precondizionare le cellule.

Quindi regolare il volume del fluido nella camera di smorzamento fino al livello predefinito dell'indice di pulsatilità e coltivare le cellule per il periodo desiderato. Le cellule endoteliali mostrate in questo caso sono state coltivate in assenza di flusso, con flusso costante e con flusso pulsatile.

Variazioni nella morfologia possono essere osservate dopo 24 ore di esposizione a un flusso pulsatile elevato, passando dalla tipica morfologia delle cellule endoteliali a una morfologia più simile a quella a fuso. Al contrario, sia le condizioni statiche che il flusso costante mostrano scarse o nulle differenze nella morfologia. Le cellule muscolari lisce sono inoltre influenzate dalla co-coltura con cellule endoteliali esposte a flusso pulsatile elevato, come indicato qui dai diversi livelli di actina alfa delle cellule muscolari lisce e della catena pesante della miosina.

In tutte le condizioni di flusso variabili, le cellule esposte a flusso pulsatile hanno mostrato le maggiori quantità di entrambe le proteine, un indicativo di ipertrofia e contrattilità. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutte le tenute ermetiche e assicurare che i livelli di fluido rimangano costanti al termine della procedura. Altri metodi, come la coltura cellulare endoteliale o la co-coltura di cellule vascolari, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sulle interazioni tra cellula e cellula.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare il circuito di flusso, controllare l'indice ed esporre le cellule endoteliali a un flusso pulsatile.