Name: Misurare Tassi di erbicida Metabolismo in Dicot Erbacce con un saggio asportati Foglia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Impara a misurare il metabolismo degli erbicidi nelle erbe dicotiledoni con un saggio su foglie asportate. Questo metodo riduce la variabilità e permette di analizzare i meccanismi di resistenza con HPLC.

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Ringraziamo Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley e Brittany Janney per l'assistenza nella crescita e nell'estrazione delle piante, il Dr. Anatoli Lygin per l'assistenza nelle analisi cromatografiche e Syngenta Crop Protection per il finanziamento.

1. materiale vegetale, condizioni di crescita, e Vegetativo clonazione Nota: Tre popolazioni tuberculatus sono stati studiati in questa ricerca: MCR (da McLean County, IL), ACR (da Adams County, IL), e WCS (da Wayne County, IL) (Tabella 1). <ol><li> Raccogliere e sospendere semi tuberculatus a 0,1 g agar L -1: soluzione di acqua a 4 ° C per almeno 30 giorni per migliorare la germinazione. Nota: Alcune popolazioni tuberculatus sono dormienti, ma questo passaggio aiuta a superare dormienza e rendere seme germogliare più uniforme. </li><li> Germinare semi di ciascuna popolazione tuberculatus (come in Tabella 1) in 12 x 12 cm vassoi contenenti un mezzo di impregnazione nella serra. <ol><li> Mantenere condizioni di serra a 28/22 ° C le temperature giorno / notte in un fotoperiodo 16/8 ore 12. </li><li> Supplemento luce naturale in serra con luce di lampade ad alogenuri mercurio per fornire un minimo di 500 mmol m -2 </sup&gt; flusso sec -1 fotoni a livello di impianto baldacchino. </li></ol></li><li> Trapianto emerso piantine quando sono alti in 80 cm 3 vasi nella serra di 2 cm. </li><li> Trapiantare le piantine in 950 cm 3 vasi contenenti un 3: 1: 1: 1 miscela di invasatura mix: terreno: torba: sabbia quando piantine sono alti 4 cm. Aggiungere 5 g di lento rilascio granuli fertilizzanti per ogni pentola e mescolare con questa miscela suolo. </li><li> Tagliare e rimuovere il meristema apicale contenente le tre foglie più giovani da 7 cm piante alte per eliminare dominanza apicale. Nota: Questo passaggio garantisce che ogni pianta crescerà abbastanza tre centimetri ascellari germogli da clonare. </li><li> Accise cinque germogli ascellari (3 cm di lunghezza) quando piantine sono circa 14 cm di altezza da ciascuna popolazione tuberculatus (come nella tabella 1). Rimuovere la maggior parte delle foglie su questi germogli ascellari per ridurre la perdita di acqua su ulteriore manipolazione, ma mantenere le due foglie più giovani per consentire l&#39;ulteriore crescita al trapianto. <br/&gt; Nota: Maneggiare con cura e cercare di non danneggiare i germogli durante la rimozione delle foglie. Etichettare ogni pianta con un palo. </li><li> Trapianto ascellare spara in 80 cm 3 pentole (una piantina per piatto) in mezzo di impregnazione, che è lo stesso mezzo utilizzato per la germinazione. Mezzo di impregnazione deve essere saturo inizialmente fino al modulo radici nella camera di crescita, quindi mantenere costanti umidità e pentole posto nella stanza di crescita per 7 giorni di tempo per mettere radici. Nota: Le piante sono molto sensibili a questo punto e non devono essere sottolineato. <ol><li> Mantenere la crescita condizioni della camera a 28/22 ° C le temperature giorno / notte in un fotoperiodo 16/8 ore 12. </li><li> Una combinazione di lampadine a incandescenza e fluorescenti può essere utilizzato per fornire luce nella camera di crescita e dovrebbe fornire almeno 550 mmol m-2 sec -1 flusso di fotoni a livello di impianto baldacchino 12. </li></ol></li><li> Trapianto di nuovo in 950 cm 3 pentole (una piantina per piatto) containing un 3: 1: 1: 1 miscela di invasatura mix: terreno: torba: sabbia (includere anche 5 g lento rilascio granuli di fertilizzante) quando le piante clonate sono alti 4 cm, poi trasferire di nuovo alla serra. </li><li> Clonare le piante una seconda volta utilizzando lo stesso metodo descritto sopra (cioè, passi ripetizione da 1.5 a 1.8, e poi passare al punto 2.1). Per un tipico studio a tempo-corso, generare cloni di almeno sei impianti indipendenti di ogni popolazione tuberculatus e li registra come linee MCR 1-6, ACR 1-6 e 1-6 WCS. <ol><li> Stabilire almeno sei &quot;madri&quot; linee clonali distinte per ripetere l&#39;esperimento e adeguatamente rappresentare la variabilità genetica all&#39;interno di ciascuna popolazione tuberculatus. </li><li> A seconda di quanto tempo punti verranno analizzati, generare abbastanza sub-cloni da ogni &quot;genitore&quot; linea clonale di condurre uno studio temporale corso. </li></ol></li></ol> 2. conducendo uno studio del metabolismo con asportati Waterhemp Foglie <ol><li> Accise le terze più giovani foglie (da 2 a 3 cm di lunghezza, 0,5 cm di includere picciolo attaccato) quando le piante tuberculatus clonate sono da 10 a 12 cm di altezza per il metabolismo di erbicidi e DT 50 analisi. </li><li> Piccioli fogliari taglio di ciascun impianto tuberculatus una seconda volta (in modo che 0.3 cm del picciolo rimane) sotto l&#39;acqua, e mettere questi estremità tagliate in 1,5 ml fiale di plastica (una foglia per flaconcino) 15. Nota: Tagliare una seconda volta sotto l&#39;acqua impedisce la formazione di bolle d&#39;aria e collegare vasi xilematici. <ol><li> In primo luogo, in parte immergere foglie escisse con il taglio picciolo nel buffer di pre-incubazione (200 ml) di 0,1 M Tris-HCl (pH 6) per 1 ora. </li><li> In secondo luogo, spostare ogni foglio in un flacone contenente 1,5 ml di tampone di incubazione (200 ml) di 0,1 M Tris-HCl (pH 6) più 150 pM [URL- 14 C] erbicidi, e incubare a 28 ° C per 1 ora a consentire l&#39;assorbimento erbicidi nelle foglie. Nota: Entrambi i 14 C-mesotrione e <sup&gt; 14 C-primisulfuron-metile sono stati utilizzati nei nostri studi a specifiche attività di circa 20 mCi mmol -1. Sia diffusione e assorbimento attraverso il flusso xilematica traspirabilità contribuiscono alla quantità di erbicida ripreso per foglia. Nota: L&#39;effetto di inibitori metabolici sul metabolismo erbicida può essere determinata modificando passi 2.2.1 e 2.2.2. Aggiungere 100 mM dell&#39;inibitore al buffer pre-incubazione e lasciate incubare per 2 ore, poi il trasferimento a tampone di incubazione con erbicida ed ancora aggiungere 100 pM inibitore. Ad esempio, malathion e tetcyclacis inibiscono alcune attività del citocromo P450 in impianti di 15-17. </li><li> Lavare la parte immersa di foglie asportati con acqua deionizzata e trasferire foglie escisse per un quarto di forza Murashige e Skoog (MS) sali soluzione (500 ml) per 0 ore, 5 ore, 11 ore, 23 ore o 35 ore, rispettivamente, nella camera di crescita per lo studio del metabolismo tempo portate. </li></ol></li><li> Vendemmia rimuovendo congedos dalla soluzione di incubazione al punto di tempo appropriato e macinare manualmente ogni tessuto fogliare in azoto liquido utilizzando un tubo di polipropilene (15 ml) e pestello di vetro. </li><li> Estrarre erbicidi radiomarcato e dei suoi metaboliti di ciascun foglio con 7 ml di 90% acetone con un omogeneizzatore tessuto laboratorio nella stessa provetta di polipropilene come sopra. Risciacquare omogeneizzatore tessuto con un ulteriore 7 ml di 90% di acetone, e continuare per omogeneizzare fino tessuto è completamente polverizzato (di solito circa 2 min). Nota: 90% acetone può essere utilizzato per l&#39;estrazione della maggior erbicidi dai tessuti vegetali. Tuttavia, se questo metodo non è in grado di estrarre più del 90% dei composti radiomarcati assorbite, poi metanolo al 90% o 90% acetonitrile possono essere sostituiti come solvente di estrazione. </li><li> Label 90% estratti acetone (14 ml totali) e conservare a -4 ° C per 16 ore per consentire l&#39;estrazione supplementare a verificarsi. Nota: Seguendo questa estrazione di foglie trattate, la quantità di rad estraibiliioactivity è tipicamente almeno il 98% di composti radiomarcati assorbite dalla foglia trattata. La radioattività non estraibili (residui legati) nelle foglie asportato in media solo dello 0,3% in tutti i punti di tempo nel nostro precedente studio di 12, ma questa cifra può variare a seconda all&#39;erbicida utilizzato e punto di tempo esaminato. </li><li> Centrifugare i campioni a 5.000 xg per 10 minuti e concentrarsi supernatanti a 40 ° C con un evaporatore rotante fino ad un volume finale di 0,5 ml si ottiene. Trasferire questo volume di un tubo di plastica 2,0 ml. </li><li> Aggiungere acetonitrile: acqua (1: 1 in volume) per regolare il volume finale della pianta estratti 1,25 ml e ri-centrifugare a 10.000 xg per 10 minuti per rimuovere eventuali particelle. </li><li> Misurare la radioattività totale in un&#39;aliquota prelevata su ogni campione (dpm microlitri -1) mediante spettroscopia scintillazione liquida (LSS) 12 e normalizzare quantità di [14 C-marcato] composti iniettati per l&#39;analisi HPLC (per esempio, 10,000 totale dpm / campione / run) in modo da assi Y sarà uniforme tra campioni durante la rappresentazione grafica dei risultati. </li></ol> 3. Analisi HPLC di erbicidi metabolismo in fogli escisse Nota: Risolvere totale radioattività estraibile in erbicidi genitore e erbicidi metaboliti utilizzando le seguenti condizioni RP-HPLC 12. <ol><li> Eseguire RP-HPLC con una colonna C 18 (4,6 x 250 mm, 5 micron dimensione delle particelle per HPLC analitico) ad un flusso di 1 ml min -1 per la maggior parte degli erbicidi non polari. Nota: colonne C 4 o C 12 RP-HPLC possono anche essere utilizzati per ottimizzare la separazione dell&#39;erbicida madre dai suoi metaboliti. Un filtro precolonna e / o precolonna possono anche essere usati per proteggere e prolungare la durata della colonna RP. <ol><li> Utilizzare la seguente fase mobile per RP-HPLC: Eluente A, 0,1% di acido formico (v / v) in acqua, e Eluente B 100% HPLC acetonitrile. Nota: HPLC-grade metanolo può essere utilizzato anche come Elconfluente B per la risoluzione di composti più polari e metaboliti, ma essere consapevoli del fatto che i tempi di ritenzione possono anche cambiare. Nota: Il profilo di eluizione utilizzato per risolvere mesotrione o primisulfuron-metil dai loro metaboliti polari nella nostra ricerca 12 è: Fase 1, A: B (4: 1, v / v) di A: B (3: 2, v / v ) in un gradiente lineare (12 min); Fase 2, A: B (3: 2, v / v) di A: B (3: 7, v / v) in un gradiente lineare (5 min); Fase 3, A: B (3: 7, v / v) di A: B (1: 9, v / v) in un gradiente lineare per 2 min (per un totale di 19 min). Nota: Le sfumature e passaggi isocratiche possono avere bisogno di essere regolato in base alle proprietà fisiche del materiale di base, al fine di ottimizzare la risoluzione. </li><li> Seguire la procedura sopra gradiente lineare con A: B (1: 9, v / v) a A: B (4: 1, v / v) in un gradiente lineare (3 min) e A: B (4: 1, v / v) step isocratica (per almeno 2 minuti) per riequilibrare colonna RP prima di iniettare il successivo 12 estratto. </li></ol></li><li> Rilevare e visualizzare composti radiomarcati con un flusso Scintillation Analyzer. Registrare la quantità di genitore erbicidi rimanente in ciascun campione come percentuale della radioattività totale in ciascun campione (rilevati e quantificati dalla portata scintillazione Analyzer secondo le istruzioni del produttore) per determinare i tassi di metabolismo erbicidi in ciascuna popolazione tuberculatus durante il corso del tempo. </li></ol> 4. Procedure statistiche <ol><li> Disporre trattamenti in un design completamente randomizzati (o dispositivo adatto per l&#39;analisi statistica). </li><li> Eseguire due esperimenti indipendenti con ogni trattamento, composto da tre repliche biologiche per ogni esperimento. I due esperimenti indipendenti includono sei repliche biologiche in totale. Se l&#39;effetto esperimento non è significativo (α = 0,05), combinare e analizzare dati da ciascun esperimento indipendente. Se l&#39;effetto è significativo esperimento, quindi analizzare ogni esperimento separatamente. Nota: Includere i primi tre repliche biologiche in Esperimento 1 e per i prossimi tre repliche biologiche in Esperimento 2. Ogni replica biologica rappresenta un &quot;genitore&quot; distinta linea clonale derivata da ciascuna popolazione (MCR 1-6, 1-6 ACR, e WCS 1-6) in modo che ogni tempo- Analisi corso utilizza piante geneticamente identici. I due esperimenti indipendenti includono sei repliche biologiche in totale, che permette per una rappresentanza adeguata della variabilità genetica e la determinazione di un valore mediano DT 50 per ogni popolazione tuberculatus. </li><li> Analizzare i dati con almeno analisi di regressione non lineare e inserirli con una curva semplice del primo ordine al fine di stimare DT 50 s. L&#39;equazione che segue descrive il modello: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> dove in questo modello y rappresenta la percentuale dell&#39;erbicida genitore rimanente al tempo t, μ i è il DT 50 per ciascuntuberculatus popolazione i, e il parametro C 0 è la quantità stimata di genitore erbicida presente at = 0 12. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo espunto-foglia qui descritto è stato utilizzato in precedenza nella ricerca metabolismo primisulfuron nel mais lascia 15, ma i nostri risultati dimostrano che questo protocollo è anche efficace, preciso e riproducibile per misurare il metabolismo erbicidi in una specie infestanti dicotiledoni 12. Un importante vantaggio della tecnica foglio asportato rispetto studi intero impianto è che un foglio asportato è indipendente intero impianto modelli traslocazione di postemergence, erbicidi sis...

Resistenza agli erbicidi in erbacce presenta una grave minaccia per la produzione mondiale di cibo e fibre 1,2. Attualmente, migliaia di popolazioni e biotipi resistenti provenienti da oltre un centinaio di specie infestanti in tutto il mondo sono stati documentati e studiati 3. Un meccanismo importante che conferisce resistenza agli erbicidi nelle piante è l&#39;alterazione di erbicidi geni e proteine ​​bersaglio del sito, tra cui le mutazioni genetiche che colpiscono erbicida di proteine ​​cinetica vincolanti o l&#39;amplificazione del target loco gene 2. Disintossicazione metabolica attraverso attività elevati di citocromo P450 monoossigenasi (P450) o glutatione S -transferase (GST) enzimi è un altro meccanismo che conferisce resistenza agli erbicidi in piante infestanti, che è distinto in diversi modi dai meccanismi bersaglio posto a base 2. Resistenza a base metabolica ha ramificazioni significative per se i costi dell&#39;impianto di fitness (aka sanzioni fitness) possono derivare dalle mechanis erbicidi resistenzam, nonché per quanto riguarda il potenziale di un singolo meccanismo di disintossicazione per conferire resistenza incrociata o multiplo erbicidi nelle popolazioni infestanti 1,2,4. Generalmente, il metabolismo erbicidi nelle piante può essere suddiviso in tre fasi distinte 5. Fase I implica la conversione erbicidi o l&#39;attivazione come idrossilazione P450-mediata di anelli aromatici o gruppi alchilici, o da N - o reazioni dealchilazione O-, con conseguente aumento di polarità e erbicida parziale disintossicazione 5,6. Recentemente introdotto gruppi funzionali in fase I in grado di fornire i siti di collegamento per la coniugazione di glutatione ridotto da GST o di glucosio da parte glicosiltransferasi UDP-dipendenti in fase II 5,7. Ad esempio, il principale metabolita iniziale di primisulfuron-metile in mais è idrossi-primisulfuron-metil 8, che può essere ulteriormente metabolizzato a idrossi-primisulfuron-glucoside (Fase II) e poi trasportato al vacuolo per l&#39;archiviazione a lungo termine o ulteriori metabolica professionistaelaborazione 5,6 (fase III). Tuberculatus (Amaranthus tuberculatus) è un difficile da controllare, dicotiledoni specie infestanti annuali che ostacola la produzione di mais (Zea mays), soia (Glycine max), e cotone (Gossypium hirsutum) negli Stati Uniti. L&#39;elevato grado di diversità genetica delle tuberculatus è facilitata dalla sua biologia dioica e lunga distanza l&#39;impollinazione vento, e un singolo impianto tuberculatus femmina può produrre fino a un milione di semi 9. Questi semi sono piccoli e facilmente diffondersi, che naturalmente dotare tuberculatus con un meccanismo di dispersione efficace. Tuberculatus mostra la germinazione continua per tutta la stagione di crescita 9, ei suoi semi sono in grado di germinare dopo diversi anni di dormienza. Tuberculatus è una pianta C 4 che possiede un tasso di crescita superiore alla maggior parte infestanti a foglia larga nei sistemi a seminativo 10. Inoltre, numerose popolazioni tuberculatus sono resistenti alla fam multiplailies di erbicidi 3. Una popolazione di tuberculatus (designato MCR) da Illinois è resistente 4-idrossi-phenylpyruvate diossigenasi (HPPD) erbicidi -inhibiting 11, come mesotrione, nonché atrazina e acetolattato sintetasi (ALS) -inhibiting erbicidi, compresi primisulfuron-metil , a causa della non-bersaglio-site meccanismi basati 12,13. Una diversa popolazione di tuberculatus designato ACR 14, che è primisulfuron-metil-resistenti (a causa di una mutazione nel gene ALS) e atrazina resistente ma sensibile al mesotrione, e una popolazione tuberculatus designato WCS 14 che è sensibile alla primisulfuron-metile, mesotrione, atrazina e sono stati utilizzati in confronto con MCR nella nostra ricerca anteriore 12 ed esperimenti correnti (riassunti nella Tabella 1). Gli studi iniziali non hanno rilevato alterazioni nei livelli di sequenza genica HPPD o di espressione, o ridotto mesotrione captazione, nel MCRpopolazione se confrontato con le popolazioni mesotrione sensibili 12. Tuttavia, studi sul metabolismo con piante intere dimostrato significativamente più bassi di mesotrione genitore erbicidi in MCR rispetto al ACR e WCS, che correlata con le risposte fenotipiche precedenti per mesotrione 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tuberculatus Popolazione </td><td> Abbreviazione </td><td> Fenotipo a Mesotrione </td><td> Resistenza mesotrione Meccanismo </td><td> Fenotipo a primisulfuron </td><td> Resistenza primisulfuron Meccanismo </td></tr><tr><td> McLean County-resistente </td><td> MCR </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo * </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo </td></tr><tr><td> Adams County-resistente </td><td> ACR </td><td> Sensitive </td><td> - </td><td> Resistente </td><td> Obiettivo-site mutazione in SLA 14 </td></tr><tr><td> Wayne County-Sensitive </td><td> WCS </td><td> Delicato </td><td> - </td><td> Delicato </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Meccanismi di resistenza non-bersaglio-site, diversi metabolismo potenziato, può anche conferire resistenza mesotrione nella popolazione MCR 12. Tabella 1: Descrizione delle popolazioni tuberculatus da Illinois utilizzati in questo studio. Oltre a determinare i tassi di metabolismo erbicida piantine tuberculatus intatti, un approccio sperimentale diverso è stato sviluppato e impiegato nella nostra precedente ricerca per indagare il metabolismo utilizzando un tuberculatus asportato foglia saggio 12, nonché vari inibitori P450 (ad esempio, tetcyclacis e malathion). Questo metodo è stato adattato appositamente per tuberculatus da un previinvestigazione unità organizzative del metabolismo primisulfuron-metile in mais asportato lascia 15, dal momento che il test foglia asportato non era ancora stata segnalata per condurre ricerche metabolismo diserbante in un impianto dicot. L&#39;insetticida malathion organophophosate è stato spesso utilizzato per in vivo e in vitro, la ricerca erbicidi metabolismo per indicare il coinvolgimento P450 16. Per esempio, la tolleranza e rapido metabolismo del mesotrione nel mais sono dovuti a idrossilazione anello P450-catalizzata, che è stata verificata quando malathion maggiore sensibilità mais mesotrione 17. Allo stesso modo, malathion inibito il metabolismo della SLA inibitore primisulfuron-metile in mais asportato lascia 15. Un importante vantaggio della tecnica foglio asportato è che i dati generati sono indipendenti modelli traslocazione intero impianto, un fattore importante da considerare quando si valuta metabolismo sistemico, erbicidi postemergence nelle piante. Di conseguenza, questo metodo consente quantitativa emetabolica analisi qualitative di concentrarsi su una singola foglia trattata 12. Una strategia di clonazione vegetativa, in combinazione con il protocollo foglio asportato, è stato precedentemente utilizzato in tuberculatus condurre studi sul metabolismo 12. A causa della natura outcrossing di tuberculatus (separati per uomini e piante femminili), e alto grado di diversità genetica all&#39;interno delle specie dioica Amaranthus 9, questo protocollo ha assicurato che piantine tuberculatus geneticamente identici sono stati analizzati entro gli esperimenti time-corso. Questo articolo illustra l&#39;utilità del metodo di foglia asportato per misurare i tassi di metabolismo erbicidi in una pianta infestante dicot (tuberculatus). La quantità di erbicida genitore restante è stato determinato in ogni momento (Figura 1) da almeno analisi di regressione non lineare, e si forma con una curva semplice primo ordine per stimare il tempo per il 50% di erbicidi assorbita a degradare ( DT 50). Rappresentantecromatogrammi di fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) vengono visualizzati per la SLA-resistenti e delle popolazioni tuberculatus sensitive, che indicano la scomparsa di erbicidi genitore e formazione concomitante del metabolita polare (s) nel corso di un periodo di studio-corso (Figura 2). Il focus del nostro articolo è quello di descrivere e dimostrare l&#39;utilità del test foglia asportato in combinazione con un metodo di clonazione vegetativo per determinare i tassi di precise e riproducibili del metabolismo erbicidi nelle piante dicotiledoni, utilizzando uniformemente anello marcato (URL- 14 C) erbicidi tre popolazioni tuberculatus che si differenziano per le loro risposte integrali vegetali HPPD- e SLA-inibitori erbicidi (Tabella 1).

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>per semi pre-germinazione</td></tr><tr><td>Terriccio Substrato</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>49040233</td><td>per la crescita delle piante</td></tr><tr><td>Nutricote</td><td>Agrivert&nbsp;</td><td>TOTAL BLEND 13-13-13 Fertilizzante</td><td>a lenta cessione</td>T100</tr><tr><td>Camera di crescita E15</td><td>Controlled Environments Limited</td><td>20207</td><td>Coltura di piante</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>tampone per foglie asportate</td></tr><tr><td>HCl (concentrato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144500 regolare il</td><td>pH dei sali tampone</td></tr><tr><td>Murashige e Skoog (MS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404</td><td>incubazione di foglie asportate</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>lavaggi fogliari dopo incubazione</td></tr><tr><td></td><td>Acetone Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td>estratti vegetali</td></tr><tr><td>Acetonitrile (grado HPLC)</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MKH07610</td><td>HPLC fase mobile</td></tr><tr><td>Acido formico&nbsp;</td><td>Mallinckrodt Analitico</td><td></td><td>MK259205 acidificare la fase mobile pH</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Provette da 1,5 o 2,0 ml</td></tr><tr><td>Centrifuga (a temperatura controllata)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Provette da 15 o 50 ml Provetta</td></tr><tr><td>da centrifuga in polipropilene</td><td>Corning Inc.</td><td>430790</td><td>15 ml, sterile</td></tr><tr><td>Evaporatore rotante</td><td>B&Uuml; Campioni</td><td>di piante concentrate</td>CHI <td>R200</td></tr><tr><td>Spettrometria a scintillazione liquida (LSS)</td><td>Packard Instruments</td><td>104470</td><td>quantifica 14C</td></tr><tr><td>Cromatografia liquida ad alte prestazioni</td><td>Perkin Elmer</td><td>N2910401</td><td>risolvere i metaboliti dell'erbicida Analizzatore</td></tr><tr><td>a scintillazione di flusso&nbsp;</td><td>LabLogic System</td> 1103303 <td>per l'analisi HPLC della colonna 14C</td><td></td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18</td><td>Termo-Scientifico</td><td>03-050-522&nbsp;</td><td>fase inversa</td></tr><tr><td>Ultima-Flo M cocktail</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013579</td><td>per analizzatore a scintillazione</td></tr><tr><td>di flusso Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18</td><td>per LSS; omogeneizzatore da laboratorio biodegradabile</td></tr><tr><td></td><td>Kinematica</td><td>CH-6010&nbsp;</td><td>omogeneizzare i campioni di foglie</td></tr></tbody></table>

misurare tassi di erbicida metabolismo in dicot erbacce con un saggio asportati foglia

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Al fine di isolare e determinare con precisione i tassi di metabolismo degli erbicidi in un'erbaccia dicotiledone di outcrossing obbligato, la canapa d'acqua (Amaranthus tuberculatus), abbiamo sviluppato un saggio delle foglie asportate combinato con una strategia di clonazione vegetativa per normalizzare l'assorbimento degli erbicidi e rimuovere la traslocazione come fattori che contribuiscono alle popolazioni di canapa acquatica resistenti agli erbicidi (R) e sensibili (S). Le analisi biocinetiche dei pesticidi organici nelle piante includono tipicamente la determinazione dell'assorbimento, della traslocazione (consegna al sito bersaglio), del destino metabolico e delle interazioni con il sito bersaglio. Il metabolismo degli erbicidi è un parametro importante da misurare nelle erbe infestanti resistenti agli erbicidi e nelle colture tolleranti agli erbicidi e viene tipicamente realizzato con test su piante intere utilizzando erbicidi radiomarcati. Tuttavia, una difficoltà nell'interpretazione dei parametri biocinetici derivati dai metodi dell'intera pianta è che la traslocazione è spesso influenzata dai tassi di metabolismo degli erbicidi, poiché i metaboliti polari di solito non sono mobili all'interno della pianta dopo le reazioni di disintossicazione degli erbicidi. I vantaggi del protocollo descritto in questo manoscritto includono la determinazione riproducibile, accurata e rapida dei tassi di degradazione degli erbicidi nelle popolazioni R e S, una sostanziale diminuzione della quantità di erbicida radiomarcato consumato, una grande riduzione dei materiali vegetali radiomarcati che richiedono un'ulteriore manipolazione e smaltimento e la capacità di eseguire esperimenti di erbicidi radiomarcati in laboratorio o in camera di crescita invece che in serra. Poiché la resistenza agli erbicidi continua a svilupparsi e diffondersi nelle popolazioni di dicotiledoni in tutto il mondo, il metodo di analisi delle foglie asportate sviluppato e descritto nel presente documento fornirà una tecnica inestimabile per studiare la resistenza basata sul sito non bersaglio a causa di tassi aumentati di metabolismo degli erbicidi e disintossicazione.

Grandi differenze nei tassi di metabolismo mesotrione sono stati rilevati tra una WCS o ACR e MCR (Figura 1). Ad ogni punto di tempo, MCR ha metabolizzato mesotrione più rapidamente delle due popolazioni mesotrione sensibili, WCS e ACR, che è correlato con precedenti intero impianto risposte fenotipiche 11. Clonando abbastanza piante da una pianta parentale singolo da ciascuna popolazione, metabolismo erbicida analisi volta portate sono uniformi e riproducibili a causa della mancanza di varia...

Questo manoscritto descrive come i tassi di metabolismo degli erbicidi possano essere efficacemente quantificati con foglie asportate da un'erbaccia dicotiledone, riducendo così la variabilità e rimuovendo qualsiasi possibile effetto confondente dell'assorbimento o della traslocazione dell'erbicida tipicamente osservato nei saggi su piante intere.

Misurare Tassi di erbicida Metabolismo in Dicot Erbacce con un saggio asportati Foglia

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è misurare il metabolismo dell'erbicida in una malerba dicotiledone utilizzando un saggio su foglie asportate. Questo viene realizzato innanzitutto piantando e clonando popolazioni di amaranto acquatico in serra e in camera di crescita. Il secondo passaggio consiste nell'incubare foglie asportate di amaranto acquatico con un erbicida marcatto radioattivamente e nell'eseguire uno studio in funzione del tempo.Successivamente, l'erbicida e i suoi metaboliti vengono estratti dalle foglie incubate. L'ultimo passaggio consiste nell'analisi dell'erbicida e dei suoi metaboliti mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa. In definitiva, questo saggio su foglie escisse viene utilizzato per determinare con precisione le velocità di metabolismo dell'erbicida in diverse popolazioni o specie di infestanti.Il vantaggio principale di questa tecnica o di metodi esistenti come il posizionamento di radio, erbicida marcato sulle foglie o sulla pianta intera, è che vengono analizzati seedling geneticamente identici o intatti in una traslocazione indipendente o della pianta intera. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondame

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Misurare Tassi di erbicida Metabolismo in Dicot Erbacce con un saggio asportati Foglia

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