Name: Turbativa Anti-virulento di patogeni biofilm utilizzando Engineered Quorum-tempra Lactonases (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Scopri come interrompere i biofilm batterici con enzimi quorum-quenching ingegnerizzati. Questo metodo utilizza A.baumannii S1 per valutare la riduzione della virulenza e sviluppare nuove terapie antibatteriche.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Fondo per la Ricerca Accademica del Ministero dell'Istruzione, dal National Medical Research Council e dalla National Research Foundation, Singapore.

1. cristallo viola Quantificazione di formazione di biofilm in A. baumannii S1 <ol><li> Grow una cultura 5 ml di A. baumannii S1 in lisogenia brodo (LB) (triptone 10 g / L, estratto di lievito 5 g / L) a 30 ° C in un incubatore scuotimento (220 rpm) per 16 ore. </li><li> Regolare la cultura della A. baumannii S1 ad una OD 600 di 0,8 desiderato. Utilizzando una piastra a 96 pozzetti, inoculare la coltura batterica (diluizione 1: 100) in fresco LB contenente 10 ml di enzima purificato GKL (40 mg / ml); volume finale della nuova cultura è 100 l. </li><li> Preparare una coltura di controllo pure; questo non conterrà alcun enzima. Ripetere condizioni simili a cedere il numero desiderato di repliche. </li><li> Coprire la piastra con un coperchio e metterlo in un contenitore di plastica 10 L sigillato. Incubare la piastra a 30 ° C per 3 ore prima di rimuovere delicatamente il supporto. </li><li> Aggiungere altri 100 ml di mezzo fresco LB al pozzetto ed incubare la piastra per 21 ore a 30 ° C. </li&gt; <li> Dopo il secondo periodo di incubazione, rimuovere delicatamente tutti i media. Lavare il cellulare dei batteri planctonici con 200 ml di acqua sterile. Assicurarsi che vi sia solo il minimo disturbo alle cellule durante il lavaggio. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione al cristalvioletto 1% ad ogni pozzetto ed incubare per 15 minuti a RT. Rimuovere la soluzione cristalvioletto lavando il bene con 200 microlitri di acqua sterile. Ripetere il lavaggio per altre due volte. </li><li> Aggiungere 100 ml di 33% di acido acetico ad ogni pozzetto e incubare per 15 minuti agitando delicatamente; questo si dissolverà il colorante. </li><li> Quantificare la quantità di biofilm formata misurando l&#39;assorbanza di cristalvioletto a 600 nm. La quantità di cristalvioletto è proporzionale alla quantità di biofilm formato. </li></ol> 2. Microscopia confocale a scansione laser di A. baumannii S1 biofilm <ol><li> Grow una cultura 5 ml di A. baumannii S1 in LB a 30 ° C in un incubatore scuotimento (220 rpm) per 16 ore. </li><li> Anno Dominisolo la cultura di A. baumannii S1 ad una OD 600 di 0,8 desiderato. Utilizzando un fondo di vetro μ-Dish 35 mm, inoculare la coltura batterica (diluizione 1: 100) in fresco LB contenente 30 ml di purificata GKL enzima (40 mg / ml); volume finale della nuova cultura è di 1 ml. </li><li> Coprire il μ-Piatto con un coperchio e metterlo in un contenitore di plastica sigillato 10 L. Incubare la μ-Dish a 30 ° C per 3 ore prima di rimuovere delicatamente il supporto. Aggiungere 30 ml di enzima purificato GKL e mezzo fresco, portando ad un volume totale di 1 ml. Incubare per 21 ore a un&#39;altra 30 ° C. </li><li> Ripetere il passaggio 2.3 e incubare la μ-Dish per un altro 24 ore a 30 ° C. Quindi, rimuovere il supporto delicatamente. </li><li> Aggiungere 500 pl di 5 mg / ml Alex Fluo 488-coniugato agglutinina di germe di grano (WGA) disciolto in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a μ-piatto e incubare a 37 ° C per 30 min; questo si macchia il biofilm formato. Rimuovere la soluzione colorante e lavare tegli μ-Piatto con 2 ml di HBSS. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> Aggiungere 500 ml di 3,7% di formaldeide sciolto in HBSS e incubare a 37 ° C per 30 min; questo risolverà il biofilm sul μ-Dish. Lavare il μ-piatto una volta con 2 ml di HBSS e quindi rimuovere completamente la soluzione. La μ-Dish fissa con biofilm può essere conservato al buio a 4 ° C prima di imaging CLSM. </li><li> Per CLSM di imaging e di analisi, utilizzare 63 ingrandimenti per generare 97 pile per immagine con un intervallo di 0,21 micron per stack. </li></ol>

<ol><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+are+we+in+the+post-antibiotic+era%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?</a> Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).</li>
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<li>Chow, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+thermostable+quorum-quenching+lactonase+from+the+amidohydrolase+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).</li>
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<li>Pour, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Acinetobacter+baumannii+strains+isolated+from+urinary+tract+infection+and+urinary+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+immunology+and+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters.</a> FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In entrambe le serie di esperimenti, A. baumannii S1 è stato coltivato in LB media senza NaCl come concentrazione di sali può ridurre la quantità di biofilm formato dai batteri 15. La presenza di tale manufatto potrebbe sottovalutare la quantità di biofilm formato, nonché gli effetti degli enzimi-quorum tempra attraverso diverse condizioni di trattamento. L&#39;uso di un enzima cataliticamente inattiva è importante come controllo negativo per eliminare i possibili effetti di enzima sequestro. <strong...

Le opzioni di trattamento per le malattie infettive sono state complicate dal rapido aumento di batteri multiresistenti che sono immuni a una vasta gamma di farmaci antibiotici 1. Con l&#39;alta morbilità e mortalità da infezioni batteri mediata resistenti, vi è la necessità di intensificare i processi di sviluppo di droga e / o esplorare alternative migliori antibatterici per migliorare le opzioni terapeutiche. Ultimamente, l&#39;approccio anti-virulenza sta guadagnando interesse dato il suo potenziale nella prevenzione virulenza attraverso media non battericida, quindi mitigare i rischi del meccanismi di resistenza 2. Quorum-sensing è un &#39;interruttore generale&#39; nella virulenza batterica e la rottura di questo fenomeno di segnalazione è un metodo anti-virulenza promettente contro patogenesi 3. L&#39;insorgenza della virulenza richiede l&#39;accumulo di molecole quorum nell&#39;ambiente extracellulare dopo aver raggiunto una densità di popolazione batterica critica. Come quomolecole rum diffondono nella matrice intracellulare, legandosi con i loro recettori cognate porta all&#39;attivazione di fattori di virulenza e geni associati con resistenza agli antibiotici e formazione di biofilm 4. In generale, l&#39;interruzione del quorum sensing comporta inibendo molecola quorum e recettore senza influenzare le principali vie metaboliche. Quindi, non ha alcuna implicazione diretta sulla crescita cellulare. Dal momento che il fitness non è compromessa, c&#39;è minima pressione selettiva per i batteri ad evolversi e acquisire resistenza contro tali trattamenti 5. Inoltre, l&#39;interruzione quorum-sensing può interferire con i meccanismi di protezione batterici intrinseci, come nel caso della formazione del biofilm, che fornisce protezione dagli agenti antibatterici e risposta immunitaria. Si stima che il 99% dei microbi sulla Terra esiste in matrici complesse come biofilm, le conferisce dei vantaggi di sopravvivenza fondamentali per i microrganismi che vivono all&#39;interno thstrutture ESE 6. Ancora più importante, la formazione di questi domini sessili è la causa della maggior parte delle infezioni persistenti e croniche nosocomiali 7. Acinetobacter baumannii è uno dei principali agenti patogeni umani che è associato a infezioni contratte in ospedale globali e la sua virulenza è in gran parte attribuito al quorum sensing formazione di biofilm mediata 8. Enzimi tempra quorum sono stati utilizzati con successo in interrompere quorum mediata trasduzione del segnale di mira un gruppo di composti noti come N -acyl lattoni Homoserine (AHLs) che sono prodotte da batteri Gram-negativi 9. Diversi studi hanno inoltre ampliato sull&#39;uso di questi enzimi per bloccare patogenesi batterica attraverso la riduzione dei numeri di espressione fattore di virulenza e di cella in biofilm 10,11. Purtroppo, permane una mancanza di manifestazione palpabile di un uso efficace di enzimi-quorum tempra contro la formazione di biofilm da batteri patogeni. Ilre sono stati tentativi di utilizzare gli inibitori del quorum (analoghi AHL), invece di enzimi quorum-tempra, di interrompere A. baumannii biofilm formazione 12. Anche se questo metodo di utilizzo di piccole molecole inibitori è un valido approccio, sostenendo la sua biodisponibilità negli usi traslazionali può essere una sfida. Al contrario, l&#39;utilizzo di enzimi quorum tempra catalitici potrebbe aggirare il problema biodisponibilità come enzimi sono più suscettibili verso l&#39;immobilizzazione su superfici di dispositivi biomedicali per effetti terapeutici. Qui, descriviamo una valutazione degli effetti della ingegnerizzati-quorum tempra lactonases da Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 sulla formazione di biofilm batterico, utilizzando colorazione cristallo viola e microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Questo studio è il primo dimostrazione riuscita di interruzione biofilm in una clinicamente rilevante A. ceppo baumannii S1 utilizzando enzimi quorum-tempra. I metodi descrittiin questo studio sono utili per valutare l&#39;efficacia di altri enzimi quorum tempra nei successivi sforzi di sviluppo terapeutici contro i batteri Gram-negativi patogeni.

<table><tbody><tr><td>Triptone&nbsp;</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico Scansione</td> di <td>laboratorio</td><td>PLA00654X</td><td>Attenzione: Piatto infiammabile</td></tr> <tr><td></td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluo 488-coniugato WGA</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s soluzione salina bilanciata&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>141475095</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Attenzione: Corrosivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre Synergy HT</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X-81 Microscopio a fluorescenza invertita</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

turbativa anti-virulento di patogeni biofilm utilizzando engineered quorum-tempra lactonases

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

La rapida comparsa di batteri multiresistenti ai farmaci ha accelerato la necessità di nuovi approcci terapeutici per contrastare le infezioni potenzialmente letali. La persistenza dell'infezione batterica è spesso associata alla formazione di biofilm mediata dal quorum-sensing. Pertanto, l'interruzione di questo circuito di segnalazione presenta un'interessante strategia anti-virulenza. È stato riportato che le lattonasi che estinguano il quorum sono efficaci interferenti dei circuiti quorum-sensing. Tuttavia, ci sono state pochissime segnalazioni dell'uso efficace di questi enzimi nell'interrompere la formazione del biofilm batterico. Questo protocollo descrive un metodo per interrompere la formazione di biofilm in un ceppo clinicamente rilevante di A. baumannii S1 attraverso l'uso di una lattonasi ingegnerizzata per estinguere il quorum. L'Acinetobacter baumannii è un importante patogeno umano implicato in gravi infezioni nosocomiali a livello globale e la sua virulenza è attribuita principalmente alla tenacia del suo biofilm. Il trattamento ingegnerizzato con lattonasi ha ottenuto una significativa riduzione del biofilm di A. baumannii S1. Questo studio ha anche mostrato la possibilità di utilizzare enzimi ingegnerizzati per l'estinzione del quorum nel futuro trattamento delle malattie batteriche mediate da biofilm. Infine, il metodo può essere utilizzato per valutare la competenza di promettenti enzimi di estinzione del quorum.

Nell&#39;esperimento quantificazione cristallo viola, due enzimi quorum-tempra sono stati usati per dimostrare la fattibilità a interrompere la formazione di biofilm: wild-type GKL e una migliore doppio mutante GKL (E101G / R230C). Entrambi gli enzimi sono stati indicati per dimostrare l&#39;attività lactonase contro 3-idrossi-L-decanoil-omoserina lattone (3-OH-C 10 -HSL), la principale molecola quorum utilizzato da A. baumannii S1 14. Per valida la valutaz...

Gli enzimi di estinzione del quorum sono opzioni anti-virulente e anti-batteriche che possono mitigare la patogenesi senza il rischio di incorrere in resistenza, impedendo l'espressione di fattori di virulenza e geni associati alla resistenza agli antibiotici e alla formazione di biofilm. In questo studio, riportiamo un metodo che dimostra l'efficacia degli enzimi quorum-quenching nella disgregazione del biofilm batterico.

Turbativa Anti-virulento di patogeni biofilm utilizzando Engineered Quorum-tempra Lactonases

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare l'efficacia degli enzimi quorum-quenching nella distruzione dei biofilm batterici. Questo metodo contribuirà a rispondere a domande fondamentali nel campo della terapia antibatterica e a comprendere l'effetto delle lattonasi quorum-quenching sui batteri patogeni in un ambiente a biofilm. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le lattonasi quorum-quenching possono essere aggiunte direttamente in un ambiente in vitro.Pertanto, il suo effetto sulla rottura del biofilm può essere facilmente quantificato. A dimostrare questa procedura è Terrence Tay, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare, coltivare una cultura di 5 millilitri di A.baumannii S1 in LB a 30 gradi Celsius in un incubatore agitato per 16 ore.Regolare la coltura a un OD 600 di 0,8. Quindi utilizzare LB fresco contenente 4 miligrammi per millilitro di enzima GKL purificato per diluire la coltura di uno a 100. Aggiungere 100 microlitri nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.Utilizzare i coperchi per coprire le piastre e posizionarle in un contenitore di plastica da 10 litri. Sigillare il contenitore e incubare a 30 gradi Celsius per tre ore, quindi rimuovere delicatamente il mezzo. Aggiungere altri 100 microlitri di mezzo LB fresco nei pozzetti e incubare la piastra a 30 gradi Celsius per 21 ore.Dopo aver rimosso delicatamente il mezzo, utilizzare 200 microlitri di acqua sterile per lavare delicatamente le cellule batteriche planctoniche. Posizionare la punta della pipetta in fondo alla pozzetta ed eliminare con attenzione il mezzo liquido per garantire il minimo disturbo al biofilm presente all'interfaccia tra aria e liquido. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di violetto di cristallo all'1% in ogni pozzetta e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere la soluzione di violetto cristallino utilizzando 200 microlitri di acqua sterile per lavare i pozzetti per tre volte. Aggiungere 100 microlitri di acido acetico al 33% in ciascun pozzetto e incubare con agitazione delicata per 15 minuti al fine di sciogliere il colorante. Quantificare la quantità di biofilm misurando l'assorbanza del violetto cristallino a 600 nanometri.La quantità di violetto cristallino è proporzionale alla quantità di biofilm formatosi. Per eseguire la microscopia confocale a scansione laser, o CLSM, dei biofilm di A.baumannii S1, coltivare una cultura di cinque millilitri di A.baumannii S1 in LB a 30 gradi Celsius in un incubatore agitato per 16 ore. Regolare la cultura di A.baumannii S1 a un OD 600 di 0.8.Quindi utilizzare LB fresco contenente 1,2 milligrammi per millilitro di enzima GKL purificato per diluire la coltura di 1 a 100 e aggiungere un millilitro in una micropiastra in vetro da 35 millilitri. Coprire la micropiastra con un coperchio e posizionarla in un contenitore di plastica da 10 litri, sigillandolo prima di incubare la piastra a 30 gradi Celsius per tre ore. Dopo aver rimosso delicatamente il mezzo, aggiungere un millilitro di mezzo fresco contenente 30 microlitri di enzima GKL purificato, quindi incubare a 30 gradi Celsius per altre 21 ore.Rimuovere delicatamente il mezzo per la seconda volta e sostituirlo con un altro millilitro di enzima GKL in mezzo fresco. Incubare a 30 gradi Celsius per 24 ore. Al termine dell'incubazione, rimuovere delicatamente il mezzo e aggiungere 500 microlitri di cinque microgrammi per millilitro di wheat germ agglutinin coniugata con Alexa Fluor 488 disciolta in HBSS.Incubare la piastra microscopica a 37 gradi Celsius per 30 minuti per colorare i biofilm. Per fissare i biofilm, aggiungere 500 microlitri di formaldeide al 3,7% disciolta in HBSS e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzare due millilitri di HBSS per lavare la piastra microscopica una volta, quindi rimuovere completamente la soluzione.Conservare la piastra al buio a quattro gradi Celsius prima dell'acquisizione con microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Per l'acquisizione e l'analisi con CLSM, utilizzare un obiettivo da 63X per generare 97 stack per immagine con un intervallo di 0,21 micrometri per stack. Nell'esperimento di quantificazione del violetto cristallo, sono stati utilizzati il GKL di tipo selvaggio e un enzima quorum-quenching GKL doppio mutante migliorato per l'attività lactonasi contro l'omoserina lattone triidrossidecanoil o 3OHC10HSL, la principale molecola del quorum utilizzata da A. baumanii S1. Come mostrato qui, entrambi gli enzimi sono stati in grado di ridurre significativamente la formazione di biofilm nel ceppo A. baumanii S1 di tipo selvaggio pretrattato. L'entità della perturbazione dei biofilm da parte di entrambi gli enzimi non è proporzionale alla loro efficacia contro il 3OHC10HSL.Come si può osservare in questa tabella, la velocità di turnover della GKL mutante è sei volte maggiore rispetto alla GKL di tipo selvatico contro il 3OHC10HSL. Tuttavia, la differenza nell'entità della rottura dei biofilm tra i due enzimi è solo del doppio. In questo esperimento, l'enzima mutante GKL migliorato e il suo enzima privo di attività catecolica sono stati utilizzati per il confronto.L'immagine DIC mostra che il trattamento con l'enzima mutante GKL migliorato ha determinato una riduzione delle dimensioni del biofilm rispetto all'enzima inattivo. L'analisi delle immagini di fluorescenza ha inoltre rivelato una diminuzione dell'area superficiale, della biomassa e dello spessore medio dei biofilm quando trattati con l'enzima mutante GKL migliorato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore, escluso il tempo di incubazione, se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di minimizzare la rimozione e la perturbazione del biofilm durante i passaggi di lavaggio. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il conteggio delle cellule e i saggi di stabilità enzimatica. Questo permetterà di rispondere ad ulteriori domande, come gli effetti delle lattonasi quorum-quenching sulla popolazione cellulare all'interno del biofilm e la loro durata d'azione.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del trattamento delle malattie infettive per esplorare gli effetti di potenziali lattonasi in grado di interferire con il quorum sensing nei biofilm prodotti da batteri patogeni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come quantificare la rottura del biofilm mediante colorazione con violetto di cristallo e su come valutare i cambiamenti morfologici nel biofilm tramite imaging confocale. Non dimenticare che lavorare con materiali patogeni può essere estremamente pericoloso.Precauzioni, come l'utilizzo di adeguate strutture per il contenimento dei rischi biologici, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Immunology and Infection

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Fonte: Tay, S. B., et al. Interruzione antivirulenta dei biofilm patogeni tramite lattonasi ingegnerizzate che stingono il quorum.  J. Vis. Esp. (2016)Il video mostra un metodo per quantificare la biomassa di biofilm in un batterio patogeno, confrontando controlli non trattati con campioni trattati con un enzima quorum-quenching. L'enzima interrompe la segnalazione batterica durante l'incubazione precoce, riducendo l'adesione cellulare. Dopo il lavaggio e un'ulteriore incubazione, i pozzi di...

Quantificazione della soppressione del biofilm indotta da enzimi nei batteri patogeni

Fonte: Tay, S. B., et.al. Interruzione antivirulenta dei biofilm patogeni tramite lattonasi ingegnerizzate che stingono il quorum.  J. Vis. Esp. (2016)Questo video dimostra il processo di inibizione della formazione di biofilm introducendo un enzima che interrompe la segnalazione cellulare batterica. L'enzima impedisce ai batteri di produrre sostanze polimeriche extracellulari, riducendo così lo sviluppo di biofilm su un micropiatto con fondo di vetro. Infine, la struttura del biofilm viene...

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Le alterazioni indotte da antimicrobici dell'architettura del biofilm di Pseudomonas aeruginosa differiscono tra gli isolati clinici coltivati da pazienti con fibrosi cistica e infezione polmonare cronica. Dopo la microscopia confocale, il software COMSTAT può essere utilizzato per quantificare le variazioni nell'architettura del biofilm (ad esempio, area superficiale, spessore, biomassa) per i singoli isolati per valutare l'efficacia degli agenti anti-infettivi.

Quantificazione degli effetti degli antimicrobici sull'architettura del biofilm in vitro utilizzando il software COMSTAT

Questo protocollo presenta la metodologia per eseguire misurazioni della crescita del biofilm e della biomassa utilizzando dispositivi PCR-plate a pozzo profondo autoassemblati per lo screening statico del biofilm a coperchio ancorato a 96 pozzetti ad alta produttività.

Generazione di biomassa di biofilm batterico maggiore utilizzando dispositivi a micropiastra profonda a piastra PCR

Questo protocollo descrive un approccio che combina metodi statici e dinamici per valutare l'efficacia dei perossiacidi organici per l'eradicazione dei biofilm nell'industria lattiero-casearia. Questo approccio può anche essere utilizzato per testare l'efficacia di nuove formulazioni biologiche o chimiche per il controllo dei biofilm.

Valutazione dell'efficacia dei perossiacidi organici per l'eradicazione dei biofilm lattiero-caseari utilizzando un approccio che combina metodi statici e dinamici

I composti tiofenesulfonammidici sono potenti e specifici inibitori dei regolatori del quorum sensing del vibrione LuxR/HapR che ne bloccano l'attività in vivo, impedendo così la trascrizione dei geni per la virulenza, la motilità e i biofilm. Questo protocollo descrive in dettaglio come questi composti vengono sintetizzati, modellati in silico e analizzati in vivo per l'attività contro LuxR/HapR.

Sintesi e dosaggio di inibitori del quorum sensing del vibrione

L'obiettivo di questo protocollo è quantificare la produzione di violaceina da parte del Chromobacterium violaceum ATCC 12472 come proxy per valutare l'inibizione del quorum sensing da parte di composti bioattivi.

Quantificazione della violaceina nel Chromobacterium violaceum e sua inibizione da parte di composti bioattivi

Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l'uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi...

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Scopri come interrompere i biofilm batterici con enzimi quorum-quenching ingegnerizzati. Questo metodo utilizza A.baumannii S1 per valutare la riduzione della virulenza e sviluppare nuove terapie antibatteriche.

Turbativa Anti-virulento di patogeni biofilm utilizzando Engineered Quorum-tempra Lactonases

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