Turbativa Anti-virulento di patogeni biofilm utilizzando Engineered Quorum-tempra Lactonases

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare l'efficacia degli enzimi quorum-quenching nella distruzione del biofilm batterico. Questo metodo aiuterà a rispondere a domande chiave nel campo delle terapie antibatteriche e a comprendere l'effetto delle lattonasi che estinguano il quorum sui batteri patogeni all'interno di un ambiente di biofilm. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le lattonasi che estinguano il quorum possono essere aggiunte direttamente in un ambiente in vitro.

Pertanto, il suo effetto sulla distruzione del biofilm è facilmente quantificabile. A dimostrare questa procedura è Terrence Tay, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare, coltiva una coltura da 5 millilitri di A. baumannii S1 in LB a 30 gradi Celsius in un'incubatrice agitante per 16 ore.

Regolare la cultura su un OD 600 di 0,8. Quindi utilizzare LB fresco contenente 4 milligrammi per millilitro di enzima GKL purificato per diluire la coltura da uno a 100. E aggiungere 100 microlitri ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.

Usa i coperchi per coprire i piatti e mettili in un contenitore di plastica da 10 litri. Sigillare il contenitore e incubare a 30 gradi Celsius per tre ore, prima di rimuovere delicatamente il terreno. Aggiungere altri 100 microlitri di terreno LB fresco ai pozzetti e incubare la piastra a 30 gradi Celsius per 21 ore.

Dopo aver rimosso delicatamente il terreno, utilizzare 200 microlitri di acqua sterile per lavare delicatamente le cellule dei batteri planctonici. Posizionare il puntale della pipetta sul fondo del pozzetto e rimuovere con cautela il mezzo liquido per garantire il minimo di perturbazioni sul biofilm estraneo tra l'interfaccia aria e quella liquida. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di cristallovioletto all'1% in ogni pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere la soluzione di cristallovioletto utilizzando 200 microlitri di acqua sterile per lavare i pozzetti tre volte. Aggiungere 100 microlitri di acido acetico al 33% in ogni pozzetto e incubare agitando delicatamente per 15 minuti per sciogliere il colorante. Quantificare la quantità di biofilm misurando l'assorbanza del cristallovioletto a 600 nanometri.

La quantità di cristallovioletto è proporzionale alla quantità di biofilm formato. Per eseguire la microscopia confocale a scansione laser, o CLSM, dei biofilm di A. baumannii S1, coltivare una coltura di cinque millilitri di A. baumannii S1 in LB a 30 gradi Celsius in un incubatore agitante per 16 ore. Regolare la coltura di A. baumannii S1 su un OD 600 di 0,8.

Quindi utilizzare LB fresco contenente 1,2 milligrammi per mililetro di enzima GKL purificato per diluire la coltura, da uno a 100, e aggiungere un millilitro a un micropiatto da 35 millilitri con fondo di vetro. Coprite la micropiastra con un coperchio e mettetela in un contenitore di plastica da 10 litri e sigillatela prima di incubare la capsula a 30 gradi Celsius per tre ore. Dopo aver rimosso delicatamente il terreno, aggiungere un millilitro di terreno fresco contenente 30 microlitri di enzima GKL purificato, quindi incubare a 30 gradi Celsius per altre 21 ore.

Rimuovere delicatamente il terreno una seconda volta e sostituirlo con un altro millilitro di enzima GKL in terreno fresco. Incubare a 30 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere delicatamente il terreno e aggiungere 500 microlitri da cinque microgrammi per millilitro di agglutinina di germe di grano coniugato Alexa Fluor 488 disciolta in HBSS.

Incubare il micropiatto a 37 gradi Celsius per 30 minuti per colorare i biofilm. Per fissare i biofilm, aggiungere 500 microlitri di formaldeide al 3,7% disciolta in HBSS e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzare due millilitri di HBSS per lavare una volta il micropiatto, quindi rimuovere completamente la soluzione.

Conservare la capsula al buio a quattro gradi Celsius prima dell'imaging CLSM. Per l'imaging e l'analisi CLSM, utilizzare un obiettivo 63X per generare 97 stack per immagine con un intervallo di 0,21 micron per stack. Nell'esperimento di quantificazione del cristallovioletto, il GKL wild-type e un enzima di estinzione del quorum doppio mutante GKL migliorato sono stati utilizzati per l'attività della lattonasi contro tre idrossidecanoil l omoserina lattone o 3OHC10HSL, la principale molecola del quorum utilizzata da A.baumanii S1.As mostrato qui, entrambi gli enzimi sono stati in grado di ridurre significativamente la formazione di biofilm in A.baumanii S1 wild-type pretrattato. L'entità della distruzione dei biofilm da parte di entrambi gli enzimi non è proporzionale alla loro efficacia contro 3OHC10HSL.

Come si vede in questa tabella, il tasso di turnover del GKL mutante è sei volte più veloce del GKL wild-type contro il 3OHC10HSL. Tuttavia, la differenza nell'entità della distruzione dei biofilm tra gli enzimi è solo doppia. In questo esperimento, l'enzima mutante GKL migliorato e il suo enzima catecholy inattivo sono stati utilizzati per il confronto.

Questa immagine DIC mostra che il trattamento con l'enzima mutante GKL migliorato ha determinato una diminuzione delle dimensioni del biofilm rispetto all'enzima inattivo. L'analisi delle immagini a fluorescenza ha anche rivelato che c'era una riduzione dell'area superficiale, della biomassa e dello spessore medio dei biofilm, quando trattati con l'enzima mutante GKL migliorato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore, escluso il tempo di incubazione se viene eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo la rimozione e l'interruzione del biofilm durante le fasi di lavaggio. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il conteggio delle cellule e i saggi di stabilità enzimatica. Questo risponderà a ulteriori domande come gli effetti delle lattonasi che estinguano il quorum sulla popolazione cellulare all'interno del biofilm e la loro durata d'azione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del trattamento delle malattie infettive per esplorare gli effetti delle potenziali lattonasi che estinguano il quorum nel biofilm prodotto da batteri patogeni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la disgregazione del biofilm mediante colorazione con cristallovioletto e valutare i cambiamenti morfologici nel biofilm mediante imaging confocale. Non dimenticare che lavorare con materiale patogeno può essere estremamente pericoloso.

Durante l'esecuzione di questa procedura devono essere sempre prese precauzioni, come l'uso di adeguate strutture di contenimento del rischio biologico.